雷奈酸鍶對大鼠應(yīng)力缺失性骨丟失的防治作用

馮云波，劉小坡，曹國龍，田發(fā)明

雷奈酸鍶對大鼠應(yīng)力缺失性骨丟失的防治作用

馮云波1，劉小坡1，曹國龍1，田發(fā)明2

目的探討雷奈酸鍶對尾懸吊導(dǎo)致的應(yīng)力缺失性大鼠骨質(zhì)疏松的防治效果。方法6月齡SD大鼠30只，隨機(jī)均分為3組：正常對照組（A組）、尾懸吊組（B組）、雷奈酸鍶干預(yù)組（C組）。B、C兩組大鼠采用尾懸吊法制備應(yīng)力缺失型骨質(zhì)疏松大鼠模型，C組給予1 g/（kg·d）雷奈酸鍶干預(yù)，4周后處死所有大鼠，取左側(cè)股骨檢測骨密度，取左側(cè)脛骨制備非脫鈣組織切片并行骨形態(tài)計(jì)量學(xué)檢測，取右側(cè)股骨和脛骨骨髓細(xì)胞體外培養(yǎng)并向成骨細(xì)胞誘導(dǎo)分化，取第4代細(xì)胞及血清檢測骨鈣素（OCN）的表達(dá)。結(jié)果B組骨密度低于A組，C組高于B組（P＜0.05）。B組骨小梁體積（BV/TV）、骨小梁數(shù)量（Tb.N）、骨小梁厚度（Tb.Th）低于A、C組，破骨細(xì)胞數(shù)（Oc.N）、骨吸收長度比（Er. Pm）高于A組，C組骨形成率（BFR/BV）、礦化長度比（L.Pm）高于B組，Er.Pm、Oc.N低于B組（P＜0.05）。B、C組OCN mRNA表達(dá)水平高于A組，但血清中OCN水平B組低于A、C組（P＜0.05）。結(jié)論尾懸吊4周可造成大鼠骨丟失，雷奈酸鍶可抑制其骨量丟失，作用機(jī)制可能與其通過上調(diào)OCN的表達(dá)促進(jìn)骨形成有關(guān)。

骨質(zhì)疏松；有機(jī)金屬化合物；噻吩類；大鼠，Sprague-Dawley；雷奈酸鍶

骨質(zhì)疏松以骨量減少、微觀結(jié)構(gòu)退變、脆性增加、易于發(fā)生骨折為其主要特點(diǎn)，以往研究認(rèn)為失重或應(yīng)力降低可導(dǎo)致機(jī)體骨形成能力下降，進(jìn)而誘發(fā)骨丟失乃至骨質(zhì)疏松。有研究表明，局部注射硫酸鈣可顯著改善骨質(zhì)疏松椎體的微觀結(jié)構(gòu)和生物力學(xué)性能，降低潛在的骨折風(fēng)險(xiǎn)［1］。雷奈酸鍶是新型抗骨質(zhì)疏松藥物，由一個(gè)有機(jī)酸及兩個(gè)非放射性鍶原子組成，鍶參與骨的礦化，具有促進(jìn)成骨細(xì)胞增殖和抑

制破骨細(xì)胞活性的功能，進(jìn)而表現(xiàn)出同時(shí)促進(jìn)骨形成和抑制骨吸收的雙重作用功效。本研究旨在探討雷奈酸鍶對應(yīng)力缺失性骨質(zhì)疏松的防治效果及其作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料6月齡雄性SD大鼠30只，體質(zhì)量（400±20）g，購自北京維通利華有限公司，自由進(jìn)食水。雷奈酸鍶，國藥準(zhǔn)字J20080098，購自施維雅（天津）制藥有限公司。北京博麥德生物技術(shù)公司Rotor-Gene 3000熒光定量PCR系統(tǒng)產(chǎn)自澳大利亞。

1.2 動(dòng)物分組及處理所有大鼠采用隨機(jī)數(shù)字表法隨機(jī)分為正常對照組（A組）、尾懸吊組（B組）、雷奈酸鍶干預(yù)組（C組），每組10只。B、C兩組大鼠采用懸吊法制備應(yīng)力缺失型骨質(zhì)疏松大鼠模型，C組給予1 g/（kg·d）雷奈酸鍶干預(yù)，實(shí)驗(yàn)持續(xù)4周，大鼠處死前10 d和4 d分別給予皮下注射30 mg/ kg四環(huán)素和5 mg/kg鈣黃綠素。

1.3 標(biāo)本的采集和處理取左側(cè)股骨采用雙能X線法檢測骨密度；取左側(cè)脛骨保存于70%乙醇中，制備非脫鈣組織切片并行骨形態(tài)計(jì)量學(xué)檢測；取右側(cè)股骨和脛骨骨髓細(xì)胞體外培養(yǎng)并向成骨細(xì)胞誘導(dǎo)分化，取第4代細(xì)胞采用Real-time PCR法檢測骨鈣素（OCN）mRNA的表達(dá)，Western blot分析OCN蛋白的表達(dá)水平，取血清采用ELISA法檢測OCN含量。

1.4 檢測指標(biāo)

1.4.1 骨密度檢測將左側(cè)股骨用包被軟組織剔除，應(yīng)用Norland-XR36雙能X線骨密度測量儀（DEXA，美國），采用小動(dòng)物模式測量骨密度。

1.4.2 骨組織形態(tài)計(jì)量學(xué)骨標(biāo)本制作和測量方法骨組織不脫鈣制片：處死大鼠后截取左側(cè)脛骨近端固定于70%乙醇，經(jīng)甲基丙烯酸酯包埋、制備不脫鈣切片，行Giemsa染色，觀察動(dòng)態(tài)熒光標(biāo)記情況的切片不作染色。用Leica DM LB2熒光/光學(xué)顯微鏡及Leica DC300數(shù)碼攝像系統(tǒng)進(jìn)行觀察與攝取圖像。骨計(jì)量學(xué)測量范圍為脛骨近端干骺端生長板下1～4 mm內(nèi)的次級松質(zhì)骨，分內(nèi)、中、外三點(diǎn)隨機(jī)錄入微機(jī)，每個(gè)標(biāo)本采取6個(gè)圖像，然后采用Leica QWin多功能彩色病理圖像分析軟件進(jìn)行骨組織形態(tài)計(jì)量學(xué)參數(shù)測定，包括靜態(tài)參數(shù)：骨小梁體積（BV/TV）、骨小梁厚度（Tb.Th）、骨小梁數(shù)量（Tb.N）、骨小梁分離度（Tb.Sp）；動(dòng)態(tài)參數(shù)：礦化長度比（L. Pm）、骨形成率（BFR/BV）、骨吸收長度比（Er.Pm）、單位面積破骨細(xì)胞數(shù)（Oc.N）。

1.4.3 骨髓基質(zhì)干細(xì)胞的提取和誘導(dǎo)培養(yǎng)無菌條件下取大鼠右側(cè)股骨和脛骨，用完全DMEM培養(yǎng)液（青霉素100 U/ mL，鏈霉素100 mg/L，胎牛血清100 mL/L，）反復(fù)沖洗骨髓腔，收集骨髓細(xì)胞，接種于培養(yǎng)瓶中（2瓶/只），CO250 mL/L，37℃溫箱中培養(yǎng)。24 h后換液，以后每2～3 d更換培養(yǎng)液，棄掉未貼壁的懸浮細(xì)胞。第2次換液后加入條件培養(yǎng)基，向成骨細(xì)胞（50 mg/L維生素C，10 mmol/L β-甘油磷酸鈉）誘導(dǎo)。

1.4.4 Real-time PCR檢測OCN的表達(dá)第4代細(xì)胞長滿瓶底后，采用Trizol一步法提取細(xì)胞總RNA，定量后反轉(zhuǎn)錄合成第一鏈cDNA，行Real-time PCR反應(yīng)。PCR反應(yīng)體系：總體積50 μL，包括Real-time PCR MasterMix 25 μL，引物（10 μmol/L）各2 μL，cDNA模板5 μL，去DEPC水16 μL。反應(yīng)條件：50℃2 min，95℃10 min；95℃15 s，60℃1 min，50個(gè)循環(huán)。溶解曲線法分析產(chǎn)物特異性引物由北京博麥德生物技術(shù)公司合成。GAPDH：上游5′-TGCTGAGTATGTCGTG?GAG-3′，下游5′-GTCTTCTGAGTGGCAGTGAT-3′；OCN：上游5′-CCATGAGGACCCTCTCTCTGC-3′，下游5′-AAACG?GTGGTGCCATAGATGC-3′。通過Rotor-Gene 3000軟件運(yùn)用ΔΔCt法分析OCN mRNA的表達(dá)。

1.4.5 Western blot分析OCN的蛋白表達(dá)水平提取第4代細(xì)胞總蛋白，BCA法測定蛋白濃度，根據(jù)測得的蛋白含量，計(jì)算含30μg蛋白的溶液體積即為上樣量，常規(guī)電泳及轉(zhuǎn)膜后，將PVDF膜在TBST中漂洗3次，每次10 min，然后移至含有BSA的平皿中室溫?fù)u動(dòng)封閉2 h，以封閉非特異性抗原。封閉結(jié)束后將膜與OCN抗體4℃孵育過夜。次日加入二抗（1∶1 000）稀釋液中，37℃搖床孵育2 h，TBST緩沖液洗膜后，加入適量BCIP/NBT顯色液顯色，在避光環(huán)境下進(jìn)行顯色。待蛋白條帶清晰后立刻取出PVDF膜，置于清水中終止顯色，并以GAPDH為內(nèi)參。

1.4.6 ELISA法檢測血清OCN的含量經(jīng)大鼠心臟取血2 mL/只，靜置30 min后，4℃2 000 r/min離心10 min，取血清。采用雙抗體夾心酶標(biāo)免疫分析法測定標(biāo)本中OCN的水平，操作過程嚴(yán)格按照說明書，酶標(biāo)儀進(jìn)行光密度定量測定。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)建立EXCEL數(shù)據(jù)庫，采用SPSS 13.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間多重比較采用LSD-t法，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 骨密度檢測結(jié)果A、B、C組左側(cè)股骨骨密度分別為（0.200 1±0.003 7）、（0.185 9±0.006 4）和（0.192 7±0.005 2）g/cm2，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F= 14.758，P＜0.05），B、C組低于A組，C組高于B組（P＜0.05）。

2.2 骨組織形態(tài)計(jì)量學(xué)檢測結(jié)果B組的BV/TV、Tb.Th、Tb.N低于A、C組，Tb.Sp高于A、C組，C組BV/TV低于A組（P＜0.05）；B、C組Er.Pm、Oc.N高于A組，且C組低于B組（P＜0.05）；C組L.Pm和BFR/BV高于B組（P＜0.05），見圖1、表1。

2.3 細(xì)胞培養(yǎng)結(jié)果細(xì)胞接種初期可見大量懸浮細(xì)胞，24 h換液后可見少數(shù)細(xì)胞伸角變形。隨成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)時(shí)間延長，細(xì)胞由典型梭形或多角形的成纖維細(xì)胞樣生長，逐漸生長變大并變形為三角形或多邊形，傳至第4代時(shí)可見細(xì)胞外基質(zhì)分泌，見圖2。

2.4 OCN的表達(dá)B、C組OCN mRNA表達(dá)水平高于A組（A組設(shè)定為1，B組1.74±0.35，C組2.38± 0.49），C組高于B組（F=26.541，P＜0.05）。B、C組OCN蛋白表達(dá)水平低于A組（A組0.208±0.020，B

組0.107±0.016，C組0.142±0.016），C組OCN的表達(dá)高于B組（F=52.055，P＜0.05），見圖3。A、B、C組OCN的含量分別為（0.947±0.154）、（0.572±0.124）和（0.787±0.083）μg/L，B、C組低于A組，C組高于B組（F=7.509，P＜0.05）。

Fig.1Fluorescence observation in unstained section（×200）圖1 未染色切片行熒光觀察（×200）

Tab.1Results of bone histomorphometry analysis表1 骨組織形態(tài)計(jì)量學(xué)檢測結(jié)果（n=10，）

Tab.1Results of bone histomorphometry analysis表1 骨組織形態(tài)計(jì)量學(xué)檢測結(jié)果（n=10，）

＊P＜0.05；a與A組比較，b與B組比較，P＜0.05

Tb.Th（μm）80.91±10.24 51.32±8.19a 69.13±9.92ab 18.232＊BFR/BV（%/年）46.38±3.79 51.92±7.25 68.33±7.21ab 26.263＊組別A組B組C組F組別A組B組C組F BV/TV（%）34.28±3.90 20.80±3.19a 26.80±3.71ab 27.894＊L.Pm（%）10.04±1.24 11.14±1.62 15.83±1.85ab 29.868＊Tb.N（個(gè)/mm）3.20±0.63 1.78±0.36a 2.74±0.28b 20.872＊Er.Pm（%）6.36±0.97 17.10±2.91a 10.53±2.21ab 48.957＊Tb.Sp（μm）399.47±91.83 882.63±127.85a 553.72±158.28ab29.744＊Oc.N（個(gè)/mm2）0.11±0.04 0.37±0.08a 0.20±0.06ab 37.434＊

Fig.2The primary（A）and 2nd（B）passage of BMSCs（×200）圖2 體外培養(yǎng)的骨髓基質(zhì)干細(xì)胞（×200）（A：原代細(xì)胞；B：第2代細(xì)胞）

Fig.3Western blot of OCN圖3 Western blot檢測OCN表達(dá)結(jié)果

3 討論

本研究采用尾懸吊造成6月齡大鼠后肢失負(fù)重引起應(yīng)力缺失4周，經(jīng)骨密度檢測及骨組織形態(tài)計(jì)量學(xué)分析確實(shí)發(fā)生骨質(zhì)疏松。而雷奈酸鍶全程干預(yù)可顯著提高尾懸吊大鼠股骨骨密度，一定程度上阻止其骨量的丟失，但不能使其恢復(fù)至正常組大鼠水平。

尾懸吊是公認(rèn)的模擬應(yīng)力缺失導(dǎo)致的骨質(zhì)疏松模型的制作方法，以往研究中多以3月齡甚至更小的大鼠為干預(yù)對象［2-4］，雖然3月齡隨激素水平趨于穩(wěn)定，但生長過于旺盛，有潛在影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果的可能，因此本研究選用6月齡大鼠為干預(yù)對象。

骨密度是臨床診斷骨質(zhì)疏松癥的金標(biāo)準(zhǔn)，基礎(chǔ)研究中也多以此作為判斷動(dòng)物模型制作成功與否的技術(shù)手段。骨組織形態(tài)計(jì)量學(xué)是基于體視學(xué)原理用于分析骨組織骨量、微結(jié)構(gòu)、骨吸收、類骨質(zhì)形成、礦化等多個(gè)指標(biāo)的檢測手段。本研究將兩者有機(jī)結(jié)合，一方面觀察尾懸吊大鼠骨量、微結(jié)構(gòu)以及骨轉(zhuǎn)換參數(shù)變化，另一方面判斷雷奈酸鍶對尾懸吊大鼠骨量丟失的干預(yù)效果及機(jī)制。結(jié)果發(fā)現(xiàn)尾懸吊4周后大鼠骨量丟失明顯，但松質(zhì)骨的骨形成參數(shù)與正常對照組無顯著差別，但骨吸收參數(shù)顯著高于對照組，這與先前報(bào)道的擬失重造成的骨量丟失主要是源于骨形成能力的下降［5-6］似乎不符，但經(jīng)過仔細(xì)分析數(shù)據(jù)后發(fā)現(xiàn)，骨量下降后，計(jì)算骨形成率的基數(shù)也隨之下降，在礦化能力（即單位天數(shù)的雙熒光標(biāo)記間距）相同的情況下，骨量越小骨形成率也越高，即在尾懸吊與正常對照組骨量有顯著差異的基礎(chǔ)上，骨形成率的相近仍然提示尾懸吊組骨形成能力的下降。

雷奈酸鍶全程干預(yù)結(jié)果是顯著提高骨量，改善骨小梁微結(jié)構(gòu)，促進(jìn)骨形成，抑制骨吸收，這也與先前報(bào)道的雷奈酸鍶同時(shí)具有促進(jìn)骨形成和抑制骨吸收作用功效的結(jié)論一致［7-9］。

骨鈣素是骨代謝標(biāo)志物之一，主要反映骨形成能力。骨髓基質(zhì)干細(xì)胞具有多方向分化潛能［10-11］，在體內(nèi)體外環(huán)境中均可在適宜刺激下向成骨細(xì)胞分化。為驗(yàn)證在體刺激對骨髓基質(zhì)干細(xì)胞成骨分化的影響，本研究成功誘導(dǎo)骨髓基質(zhì)干細(xì)胞向成骨細(xì)胞分化，并于分化晚期檢測了OCN的mRNA表達(dá)水平，結(jié)果發(fā)現(xiàn)尾懸吊大鼠OCN mRNA的表達(dá)高于對照組。而蛋白水平的研究結(jié)果卻發(fā)現(xiàn)尾懸吊組和雷奈酸鍶干預(yù)組大鼠OCN的表達(dá)均低于對照組，mRNA水平和蛋白水平表達(dá)的差異可能提示尾懸吊

后大鼠自身反饋激發(fā)了骨形成潛能，但由于力學(xué)刺激不足或其他原因?qū)е翺CN的翻譯或合成分泌受阻，最終分泌到外周血中的OCN水平也隨之下降。雷奈酸鍶則在提高OCN mRNA表達(dá)水平的同時(shí)也促進(jìn)OCN蛋白水平的表達(dá)，但其作用機(jī)制有待進(jìn)一步研究。

綜上，尾懸吊可造成大鼠骨量丟失，雷奈酸鍶可通過提高骨髓基質(zhì)干細(xì)胞OCN的表達(dá)，促進(jìn)骨形成、抑制骨吸收、改善松質(zhì)骨微結(jié)構(gòu)部分組織其骨量丟失，改善骨質(zhì)量。

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（2015-03-16收稿 2015-05-12修回）

（本文編輯 魏杰）

Effect of Strontium ranelate on stress-absence induced osteoporosis

FENG Yunbo1,LIU Xiaopo1,CAO Guolong1,TIAN Faming2
1 Department of Orthopedic Surgery of Tangshan Gongren Hospital，Tangshan 063000，China；2 Medical Research Center of Hebei United University

ObjectiveTo investigate the preventive effect of Strontium ranelate on stress-absence induced osteoporo?sis in tail-suspended rat.MethodsA total of 30 SD rats with average age of 6 month were randomly divided into 3 groups（n=10 in each group）:Group A was normal control group while rats in group B and C were subjected to tail suspension test to establish stress absence models.Rats in group C were administered with Strontium ranelate［1 g/（kg·d）］.All rats were sacri?ficed 4 weeks later.Left femurs were harvested for bone mineral density（BMD）test and prepared for undecalcified tissue sec?tion and thereby bone histomorphometry assessment.Bone marrow from right femurs and tibias were cultured and induced to?wards osteogenic-differentiation.The expression levels of osteocalcin in the fourth-passage cultured bone marrow cells and in blood serum were detected separately.ResultsRats in group B showed markedly decreased BMD comparing to those in group A and C（P＜0.05）.Trabecular volume（BV/TV）,number（Tb.N）and thickness（Tb.Th）in group B were lower than those in group A and C；erosion percentage（Er.Pm）and osteoclast number（Oc.N）in group B and C were higher than those in group A；comparing to those in group B,bone formation rate（BFR/BV）,labeled percentage（L.Pm）,were higher in group C, coupled with decreased Er.Pm and Oc.N（P＜0.05）.mRNA expression levels of OCN in group B and C were higher than those of group A.But its level in plasma were lower in group B than those in group A and C（P＜0.05）.ConclusionTail suspension could induce osteosporosis.Strontium ranelate prevent bone loss in stress-absence osteoporosis in rat induced by tail-suspension for 4 weeks,which might be partially through upregulating the expression of OCN,thereby promoting bone formation.

osteoporosis；organometallic compounds；thiophenes；rats,Sprague-Dawley；Strontium ranelate

R681

A

10.11958/j.issn.0253-9896.2015.10.023

1唐山市工人醫(yī)院骨外科（郵編063000）；2河北聯(lián)合大學(xué)醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)研究中心

馮云波（1971），男，碩士，副主任醫(yī)師，主要從事骨質(zhì)疏松防治方面研究