初治肺結(jié)核患者外周血樹突狀細胞免疫功能的體外研究

許怡，楊莉，趙磊，曹金鳳，韓瑋，張志，高會霞，劉玉珍，戴二黑

初治肺結(jié)核患者外周血樹突狀細胞免疫功能的體外研究

許怡，楊莉，趙磊，曹金鳳，韓瑋，張志，高會霞，劉玉珍，戴二黑△

目的研究初治肺結(jié)核患者外周血樹突狀細胞（DC）表面成熟標志的表達、分泌細胞因子以及對T淋巴細胞的刺激作用。方法收集初治肺結(jié)核患者68例，其中菌陰組35例，菌陽組33例。收集健康體檢者40例作為對照組。分離外周血單個核細胞，誘導(dǎo)其分化成DC。流式細胞術(shù)檢測各組DC的表面標志CD83和CD86的表達率；MTT法檢測DC促進同種異體T淋巴細胞的增殖能力；ELISA法檢測DC培養(yǎng)上清中白細胞介素（IL）-12、IL-10、干擾素（INF）-γ的含量。結(jié)果初治肺結(jié)核患者與對照組相比，DC表面標志CD83和CD86的表達量均顯著降低（P＜0.05），刺激淋巴細胞增殖的能力均顯著降低（P＜0.05），培養(yǎng)上清中IL-12的含量均顯著增高（P＜0.05），培養(yǎng)上清中IL-10、INF-γ的含量各組間差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。結(jié)論初治肺結(jié)核患者外周血DC的成熟度顯著下降，刺激混合淋巴細胞增殖的能力也顯著降低，分泌IL-12的能力增強。

樹突細胞；結(jié)核，肺；細胞因子類；流式細胞術(shù)

結(jié)核病是一種嚴重危害人類健康的慢性傳染病，是我國重點控制的重大傳染病之一。目前研究證實機體抗結(jié)核感染的免疫應(yīng)答主要以T細胞介導(dǎo)的細胞免疫為主［1］。樹突狀細胞（dendritic cell，DC）作為體內(nèi)功能最強大的抗原提呈細胞（antigen present?ing cell，APC），能夠顯著刺激初始T淋巴細胞進行增殖，是機體免疫應(yīng)答的始動者，可以通過表達抗原刺激信號和共刺激信號啟動免疫應(yīng)答［2］。因此DC在

抗結(jié)核感染免疫應(yīng)答中的作用日益受到關(guān)注。本研究旨在通過體外細胞培養(yǎng)的方法對初治肺結(jié)核患者DC表面成熟標志的表達、分泌的相關(guān)細胞因子以及對T淋巴細胞增殖的干預(yù)功能進行研究，探討初治肺結(jié)核患者體內(nèi)DC的免疫功能狀態(tài)。

1 對象與方法

1.1 研究對象2013年6月—2014年1月就診于我院的初治肺結(jié)核患者68例，診斷均符合中華醫(yī)學(xué)會結(jié)核病學(xué)分會制定的《臨床診療指南-結(jié)核病分冊》的診斷標準，所有患者均未接受任何抗結(jié)核治療及免疫治療。3次痰涂片及1次培養(yǎng)陰性的肺結(jié)核患者入組菌陰肺結(jié)核組（菌陰組）；痰標本直接涂片抗酸桿菌鏡檢陽性或痰標本結(jié)核分枝桿菌培養(yǎng)陽性的肺結(jié)核患者入組菌陽肺結(jié)核組（菌陽組）。將HIV抗體初篩試驗呈陽性，既往有抗結(jié)核治療史，感染其他傳染病（如感染乙型肝炎、丙型肝炎），患有其他慢性疾?。ㄈ缣悄虿　⒛[瘤等），患有自身免疫性疾病的肺結(jié)核患者排除。菌陰組35例，男20例，女15例，年齡（42.9±19.8）歲。菌陽組33例，男18例，女15例，年齡（38.3±16.2）歲。選擇本院同期40例健康體檢者為對照組，男23例，女17例，年齡（36.3±15.6）歲。3組間性別（χ2=0.073）、年齡（F=3.911）比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（均P＞0.05）。

1.2 實驗試劑及儀器重組人白細胞介素（rhIL）-4和重組人粒細胞巨噬細胞集落刺激因子（rhGM-CSF）均購自美國CYTOLAB公司；AIM-V培養(yǎng)基購自美國Gibco公司；FITC標記的CD83及PE標記的CD86單克隆抗體（mAb）均購自美國Baker Catalog公司；檢測白細胞介素（IL）-12、IL-10、干擾素（INF）-γ的ELISA試劑盒購自美國R&D公司；淋巴細胞分離液購自天津市灝洋生物制品科技有限責(zé)任公司；MTT試劑購自美國Sigma公司；Epics-XLⅡ型流式細胞儀由美國Beckman Coulter公司生產(chǎn)；Sunrise型酶標儀由奧地利帝肯公司生產(chǎn)。

1.3 DC的分離和培養(yǎng)無菌采集肝素抗凝外周靜脈血5 mL，經(jīng)Ficoll密度梯度離心法分離單個核細胞（PBMC），生理鹽水洗滌2次后，AIM-V培養(yǎng)基調(diào)整細胞濃度為1×106個/ mL，加入到6孔細胞培養(yǎng)板中（5 mL/孔），在CO2培養(yǎng)箱中貼壁3 h后，倒置顯微鏡下觀察可見細胞開始貼壁生長。洗去非黏附細胞，獲得的貼壁細胞為擬誘導(dǎo)DC的細胞，加入含有rhGM-CSF（50μg/L）和rhIL-4（10μg/L）的AIM-V培養(yǎng)基5 mL，放入CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。隔天半量換液，并補充細胞因子。培養(yǎng)至第7天，收集所培養(yǎng)細胞，計數(shù)并進行表面標志的測定，同時收集培養(yǎng)上清，-80℃保存。

1.4 流式細胞儀檢測CD83、CD86的表達用生理鹽水調(diào)整細胞懸液的濃度至1×106個/mL，吸取100 μL，加入20μL FITC標記的CD83和5μL PE標記的CD86，震蕩混勻，室溫避光孵育15 min，加入PBS洗滌2次，上機進行檢測。

1.5 MTT法檢測混合淋巴細胞增殖能力以正常人的混合淋巴細胞懸作效應(yīng)細胞（濃度為2×106個/mL），以經(jīng)絲裂霉素C作用過的各組DC為刺激細胞（濃度為1×106個/mL），在96孔板中每孔加入100μL刺激細胞和100μL效應(yīng)細胞，以誘導(dǎo)混合淋巴細胞的增殖，每組誘導(dǎo)DC設(shè)3個重復(fù)孔，并設(shè)空白對照（以AIM-V培養(yǎng)基代替DC懸液）。放入CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h，在培養(yǎng)結(jié)束前4 h每孔加入10μL MTT（5 g/ L），繼續(xù)培養(yǎng)至實驗結(jié)束，在酶標儀490 nm波長處測光密度（OD）值，以刺激指數(shù)（SI）作為判斷淋巴細胞增殖的程度。計算公式為SI=（實驗組OD值-對照組OD值）/對照組OD值× 100%。

1.6 培養(yǎng)上清中細胞因子的檢測采用酶聯(lián)免疫吸附測定（ELISA）法檢測各組DC培養(yǎng)上清中的IL-12、IL-10、INF-γ的含量，操作按試劑盒說明進行。

1.7 統(tǒng)計學(xué)方法采用SPSS 13.0統(tǒng)計軟件包。符合正態(tài)分布的計量資料以表示，多組間比較采用方差分析。不符合正態(tài)分布的計量資料以中位數(shù)（四分位數(shù)間距）表示，比較采用Kruskal-Wallis H秩和檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組外周血DC細胞形態(tài)DC細胞培養(yǎng)至第7天，鏡下可見細胞體積增大，細胞表面有數(shù)量不等、形態(tài)各異的突起，為典型的DC形態(tài)。菌陰組和菌陽組的DC在培養(yǎng)過程中，DC生長密度比對照組低，形態(tài)也不如對照組典型。菌陰組和菌陽組的DC數(shù)量明顯低于對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），見圖1、表1。

Fig.1Cell morphology under inverted microscope in the 7thday at initial treatment（×400）圖1 第7天倒置顯微鏡下觀察細胞的形態(tài)（×400）

2.2 各組DC表面標志表達水平及對T細胞刺激能力的比較菌陰組和菌陽組CD83、CD86的表達均低于對照組，菌陽組CD83的表達低于菌陰組（P＜0.05），菌陰組與菌陽組CD86的表達差異無統(tǒng)計學(xué)

意義（P＞0.05）；菌陰組和菌陽組SI均低于對照組（P＜0.05），該2組SI差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），見表1、圖2。

Tab.1Theexpressions of CD83 and CD86 on DCs and T lymphocyte proliferation in different groups表1 各組DC表面標志表達水平及對T細胞刺激能力的比較［M（Q）］

Fig.2Expressions of CD83 and CD86 on DCs from different groups shown by FACs圖2 流式細胞儀檢測各組DC的CD83、CD86的表達

2.3 各組DC培養(yǎng)上清中IL-12、IL-10和IFN-γ含量比較IL-12的含量，菌陰組和菌陽組高于對照組（P＜0.05），菌陰組與菌陽組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。IL-10、IFN-γ的含量，3組差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），見表2。

Tab.2Contents of IL-12，IL-10 and IFN-γ in DC culture supernatant of different groups表2 各組DC培養(yǎng)上清中IL-12、IL-10和IFN-γ的含量比較［ng/L，M（Q）］

3 討論

近年來的研究證實，以T細胞介導(dǎo)的細胞免疫在結(jié)核病的發(fā)病過程中起著決定性作用［3］。而DC可以通過激活CD4+T細胞和CD8+T細胞啟動細胞免疫，發(fā)揮抗結(jié)核的免疫作用。本研究顯示初治肺結(jié)核患者各組誘導(dǎo)生成DC數(shù)量不僅在顯微鏡下明顯減少，而且收集細胞計數(shù)后顯示患者組誘導(dǎo)生成的DC細胞數(shù)明顯低于對照組，表明初治肺結(jié)核患者體內(nèi)生成DC的功能受損。這與胥萍等［4］研究的肺結(jié)核患者外周血DCs數(shù)量低于健康對照組的結(jié)果相符。許多研究顯示肺結(jié)核患者外周血的CD4+T數(shù)量顯著低于健康對照組［5］。有可能是由于DC免疫功能受損，繼而影響CD4+T淋巴細胞的分化增殖以及吞噬細胞的活化，使機體的抗結(jié)核免疫應(yīng)答受到抑制。

DC分化成熟過程中具有未成熟（immature den?dritic cell，iDC）與成熟（mmature dendritic cell，mDC）兩個階段，iDC具有極強的攝取、加工處理抗原的能力，而提呈抗原、激發(fā)免疫應(yīng)答的能力弱，mDC攝取、加工處理抗原能力弱，而提呈抗原、啟動免疫應(yīng)答能力強［6］。另有研究發(fā)現(xiàn)CD83為DC成熟度的特征性標志，CD86是DC通過提呈抗原激活T淋巴細胞的第二信號的表面標志［7］。本研究結(jié)果顯示初治肺結(jié)核患者無論是菌陰組還是菌陽組DC表面標志CD83的表達明顯低于對照組，提示初治肺結(jié)核患者外周血DC的成熟度明顯降低，患者組CD86的表達亦明顯低于對照組，表明患者DC提呈抗原、激活免疫應(yīng)答的功能受損。另外，兩組初治肺結(jié)核患者的DC刺激混合淋巴細胞增殖的能力比對照組明顯降低，進一步表明初治肺結(jié)核患者激活T淋巴細胞的功能受損。菌陽組CD83的表達顯著低于菌陰組，雖然菌陽組CD86的表達、SI與菌陰組無差異?？梢娋柗谓Y(jié)核患者外周血DC提呈抗原能力的受損較菌陰肺結(jié)核患者更嚴重，啟動細胞免疫應(yīng)答的能力更弱于菌陰肺結(jié)核患者，是否是由于感染初期菌陽肺結(jié)核患者體內(nèi)結(jié)核菌數(shù)量比菌陰肺結(jié)核患者多，造成患者免疫細胞受損更嚴重，這有待于今后進一步研究。

目前的研究已經(jīng)證實在Th0向Th1分化的過程中，IL-12起著關(guān)鍵性作用［8］，而且越來越多的研究發(fā)現(xiàn)DC可以通過分泌高水平的IL-12促進Th1類型的免疫應(yīng)答［9］。本研究結(jié)果顯示初治肺結(jié)核患者DC培養(yǎng)上清IL-12水平顯著高于對照組，這說明患者DC通過產(chǎn)生IL-12可以促進Th1型淋巴細胞介導(dǎo)的免疫應(yīng)答的發(fā)生。有學(xué)者認為肺結(jié)核病患者有著一定程度的DC缺損，并且結(jié)核分枝桿菌可以抑制DC的成熟［10］。本研究也發(fā)現(xiàn)初治肺結(jié)核患者外周血DC的成熟度降低，激活T淋巴細胞的能力顯著減弱。但是，DC分泌IL-12水平反而增高，可能是由于MTB感染早期，抑制DC的功能主要表現(xiàn)在DC提呈抗原的功能受損，而并未影響DC分泌IL-12的功能。DC通過分泌更多的IL-12，促進

Th1型淋巴細胞介導(dǎo)的免疫應(yīng)答的發(fā)生，來彌補成熟受阻的DC由于抗原提呈功能下降引起的抗結(jié)核免疫應(yīng)答的抑制。這與Cools等［11］發(fā)現(xiàn)在MTB感染后，DC在較短的時間內(nèi)能分泌IL-12的結(jié)論一致。

IFN-γ為另一種Th1型細胞因子，研究發(fā)現(xiàn)IFN-γ可以促進T細胞的增殖，同時增強T細胞的殺傷功能，活化巨噬細胞以及參與肉芽腫的形成，在抗MTB感染中起著保護性免疫的作用［12］。菌陰組和菌陽組的培養(yǎng)上清中IFN-γ的含量與對照組相比雖無差異，但均有一定程度的升高，可能是由于初治肺結(jié)核患者DC在感染初期分泌IL-12增多，而IL-12可以促進IFN-γ的分泌［13］。IL-10是一種負性免疫調(diào)節(jié)因子，可以抑制DC的成熟，誘導(dǎo)免疫耐受的發(fā)生。各組DC的培養(yǎng)上清中IL-10的含量無差異，由此可見，初治肺結(jié)核患者DC在感染初期分泌IL-12、IFN-γ等細胞因子的能力增強，通過IL-12、IFN-γ分泌增多來增強T細胞的殺傷功能，促進細胞免疫應(yīng)答，達到抗結(jié)核作用。

在對培養(yǎng)上清中細胞因子的檢測發(fā)現(xiàn)菌陽組與菌陰組的差異無統(tǒng)計學(xué)意義，提示初治肺結(jié)核患者血清及培養(yǎng)上清中IL-12、IL-10、IFN-γ的水平與肺結(jié)核患者自身的排菌量無明顯相關(guān)性。MTB感染機體后，體內(nèi)多種類型的細胞及細胞因子協(xié)同發(fā)揮免疫效應(yīng)，其間相互關(guān)系及影響十分復(fù)雜，根據(jù)這3種細胞因子的水平尚不能有效地分析病情的嚴重程度。此觀點有待于今后進一步探討。

綜上所述，初治肺結(jié)核患者外周血單個核細胞誘導(dǎo)形成DC的能力下降，形成的DC成熟度下降，抗原提呈能力受損，使機體啟動免疫應(yīng)答的能力下降，而患者外周血DC分泌細胞因子的能力并未減弱，可見肺結(jié)核患者初期機體啟動免疫應(yīng)答的能力下降可能與DC提呈抗原能力受損有關(guān)。如果能采用各種免疫治療方法使患者體內(nèi)DC數(shù)量增多，且使其抗原提呈能力增強，可能有利于體內(nèi)MTB的清除。隨著DC參與結(jié)核病免疫調(diào)節(jié)的機制被逐步闡明，將為開展有效的免疫治療和開發(fā)新型的抗結(jié)核疫苗提供重要的科學(xué)依據(jù)。

［1］Kleinnijenhuis J，Oosting M，Joosten LA，et al.Innate immune rec?ognition of Mycobacterium tuberculosis［J］.Clin Dev Immunol，2011，2011:405310.doi:10.1155/2011/405310.

［2］Garcia-Romo GS,Pedroza-Gonzalez A,Lambrecht BN，et al.My?cobacterium tuberculosis manipulates pulmonary APCs subverting early immune responses［J］.Immunobiology，2013，218（3）：393-401.doi:10.1016/j.imbio.2012.05.022.

［3］Huang JY，Song XY.The mechanisms of dendritic cells in immune response to mycobacterium tuberculosis［J］.International Journal of Immunology，2009，32（3）：234-237.［黃家禹，宋秀宇.樹突狀細胞在結(jié)核病免疫應(yīng)答中的作用及機制［J］.國際免疫學(xué)雜志，2009，32（3）：234-237］.doi:10.3760/cma.j.issn.1673-4394.2009.03.019.

［4］Xu P，Shi MH，F(xiàn)ei XF，et al.Changes in peripheral blood of pa?tients with pulmonary tuberculosis of dendritic cells and T helper cell level and its clinical significance［J］.Journal of Soochow Uni?versity，2010，30（1）：114-117.［胥萍，施美華，費曉峰，等.肺結(jié)核患者外周血樹突狀細胞和T輔助細胞水平的變化及其臨床意義［J］.蘇州大學(xué)學(xué)報，2010，30（1）：114-117］.

［5］Wang QF，Han XQ，Chen YL，et al.T-lymphocyte subsets detec?tion and clinical significance in patients with pulmonary tuberculo?sis［J］.Beijing Medicine，2013，35（12）：993-995.［王慶楓，韓喜琴，陳玉玲，等.肺結(jié)核患者T淋巴細胞亞群的檢測及臨床意義［J］.北京醫(yī)學(xué)，2013，35（12）：993-995］.

［6］Kou PM,Schwartz Z,Boyan BD，et al.Dendritic cell responses to surface properties of clinical titanium surfaces［J］.Acta Biomater，2011，7（3）：1354-1363.doi:10.1016/j.actbio.2010.1 0.020.

［7］Feng ZX，Liu JY.Research progression of dendritic cell［J］.Medi?cal review，2012，18（20）：3347-3350.［馮鐘煦，劉劍勇.樹突狀細胞的研究進展［J］.醫(yī)學(xué)綜述，2012，18（20）：3347-3350］.

［8］Takei M，Umeyama A，Shoji N，et al.Polyacetylenediols regulate the function of human monocyte-derived dendritic cells［J］.Int Immu?nopharmacol，2010，10（8）：913-921.doi:10.1016/j.intimp.2010.05.002.

［9］Mazurek J,Ignatowicz L,Kallenius G,et al.Divergent effects of mycobacterial cell wall glycolipids on maturation and function of hu?man monocyte-derived dendritic cells［J］.PLoS One，2012，7（8）：e42515.doi:10.1371/journal.pone.0042515.

［10］Morris D,Gonzalez B,Khurasany M,et al.Characterization of den?dritic cell and regulatory T cell functions against Mycobacterium tu?berculosis infection［J］.Biomed Res Int，2013，2013：402827.doi: 10.1155/2013/402827.

［11］Cools N，Ponsaerts P，Van Tendeloo VF，et al.Balancing between immunity and tolerance：an interplay between dendritic cells，regu?latory T cells，and effector T cells［J］.Leukoc Biol，2007，82（12）：1365-1374.doi:10.1189/jlb.0307166.

［12］Liu YY，Bao FK，Liu AH，et al.Progress in study on relationship between interferon gamma and tuberculosis［J］.Tropical Medicine China，2012，12（10）：1275-1280.［劉媛媛，寶福凱，柳愛華，等. γ-干擾素與結(jié)核病關(guān)系研究進展［J］.中國熱帶醫(yī)學(xué)，2012，12（10）：1275-1280］.

［13］Zhang J，Guo SL，Luo YA.The relationship between dendritic cell specific intercellular adhesion molecule-3 withnon integrin expres?sion and tuberculosis［J］.Chin J Tuberc Respir Dis，2009，32（8）：572-575.［張劼，郭述良，羅永艾.樹突狀細胞特異性細胞間黏附分子-3結(jié)合非整合素因子表達差異與結(jié)核病發(fā)病的關(guān)系［J］.中華結(jié)核和呼吸雜志，2009，32（8）：572-575］.doi：10.3760/cma. j.issn.1001-0939.2009.08.006.

（2014-12-30收稿 2015-05-12修回）

（本文編輯 魏杰）

Study of immune function of dendritic cells in peripheral blood of tuberculosis patients after initial treatment

XU Yi,YANG Li,ZHAO Lei,CAO Jinfeng,HAN Wei,ZHANG Zhi,GAO Huixia,LIU Yuzhen,DAI Erhei△The Fifth Hospital of Shijiazhuang，Shijiazhuang 050021，China△

ObjectiveTo investigate expressions of surface maturation markers,secreting cytokines and the stimulat?ing effect on T lymphocytes in the dendritic cells（DC）from peripheral blood of tuberculosis（TB）patients after loading dose treatment.MethodsTB patients who received initial treatment（n=68）were collected at the fifth hospital of Shijiazhuang from 2013 June to 2014 January.Base on clinical diagnosis and treatment guidelines of tuberculosis,they were divided into sputum smear-negative group（35 cases）and sputum smear-positive group（33 cases）.Forty cases of healthy adult were se?lected as control group.Mononuclear cells were isolated from peripheral blood and were cultured in medium to differentiate into DCs.Expression levels of CD83 and CD86 on DCs were examined by flow cytometry.The proliferation of allogeneic mixed lymphocyte stimulated by DCs was dectected using MTT assay.Contents of IL-12,IL-10 and INF-γ in the cultural supernatant of DCs and blood serum from TB patients were detected by ELISA.ResultsCompared with controls,the ex?pressions of CD83 and CD86 on DCs in TB patients after loading dose treatment decreased obviously（P＜0.05）,and the ability to stimulate the proliferation of lymphocytes reduced evidently（P＜0.05）.What's more,IL-12 level increased mark?edly（P＜0.05）while IL-10 and INF-γ levels presented no significant difference among the three groups（P＞0.05）.ConclusionThe expressions of maturation markers of DC cells of the peripheral blood in TB patients after initial treatment de?creased.The ability of stimulating mixed lymphocyte proliferation is also significantly reduced while secretion of IL-12 was enhanced.

dendritic cells；tuberculosis,pulmonary；cytokines；flow cytometry

R521

A

10.11958/j.issn.0253-9896.2015.10.018

河北省衛(wèi)生廳科研基金項目（20130650）

河北省石家莊市第五醫(yī)院（郵編050021）

許怡（1984），女，主管檢驗師，碩士，主要從事感染免疫方面研究

△通訊作者E-mail：daieh2008@126.com