荷丹片對APOE-/-小鼠炎癥因子及氧化應(yīng)激因子的影響

于柏青，周玉娟，劉福林，曹曉華，許明軒

荷丹片對APOE-/-小鼠炎癥因子及氧化應(yīng)激因子的影響

于柏青1，周玉娟2△，劉福林3，曹曉華3，許明軒4

目的探討荷丹片對載脂蛋白E基因敲除（APOE-/-）小鼠炎癥因子、氧化應(yīng)激因子的影響及對動脈粥樣硬化（AS）的干預(yù)作用及機制。方法將50只APOE-/-小鼠隨機均分為對照組、模型組、荷丹片低劑量組、荷丹片高劑量組及辛伐他汀組。對照組給予普通飼料，其余組給予高膽固醇飼料造模。同時用藥組灌胃相應(yīng)劑量藥物，對照組和模型組給予等量生理鹽水灌胃。造模12周后測定血清白細胞介素（IL）-1、IL-10、丙二醛（MDA）、超氧化物歧化酶（SOD）水平；RT-PCR測主動脈腫瘤壞死因子（TNF）-α mRNA表達。結(jié)果模型組較對照組IL-1、MDA、TNF-α mRNA升高，IL-10、SOD降低（P＜0.01）；荷丹片低劑量組、荷丹片高劑量組、辛伐他汀組較模型組IL-1、MDA、TNF-α mRNA降低，IL-10、SOD升高（P＜0.01）。結(jié)論荷丹片可通過抗炎、抗氧化應(yīng)激作用干預(yù)AS的發(fā)生、發(fā)展。

動脈粥樣硬化；載脂蛋白E類；模型,動物；荷丹片；APOE-/-小鼠；炎癥因子；氧化應(yīng)激因子

動脈粥樣硬化（AS）是全球發(fā)病率和病死率最高的疾?。?］。目前臨床對于AS的治療以西藥為主，但不良反應(yīng)明顯，且患者依從性差。荷丹片是復(fù)方調(diào)脂中藥，具有升清降濁、化痰祛瘀功效。本研究旨在觀察荷丹片對載脂蛋白E基因敲除（APOE-/-）小鼠炎癥因子白細胞介素（IL）-1、IL-10、腫瘤壞死因子（TNF）-α及氧化應(yīng)激因子丙二醛（MDA）、超氧化物歧化酶（SOD）的影響，以探討荷丹片對AS的干預(yù)作用及其機制。

1 資料與方法

1.1 一般資料（1）動物。健康清潔級APOE-/-小鼠（C57BL/6J背景）50只，雌雄各半，8周齡，平均體質(zhì)量（18.46±1.66）g，合格證編號為SCXK（京）2013-0002，購自中

國醫(yī)學科學院醫(yī)學實驗動物研究所，飼養(yǎng)于河北大學醫(yī)學部動物實驗中心。（2）藥物和試劑。荷丹片（南昌濟順制藥有限公司），辛伐他汀片（山東方明藥業(yè)集團股份有限公司），膽固醇（賽爾克生物公司），IL-1、IL-10、MDA、SOD試劑盒（南京建成生物工程研究所有限公司），TRizol RNA抽提試劑（Am?bion公司），反轉(zhuǎn)錄試劑盒（Promega公司），PCR引物（上海生工）。（3）實驗儀器。TDL-5-A離心機（上海安亭科學儀器廠），Model680酶標儀（美國BIO-RAD公司），HWS型智能恒溫恒濕箱（寧波東南儀器有限公司），全自動凝膠成像儀（中國容智創(chuàng)業(yè)，ChampGel 5000），普通PCR儀（Applied Biosys?tems公司）。

1.2 模型制備50只APOE-/-小鼠隨機數(shù)字表法均分為對照組、模型組、荷丹片低劑量組、荷丹片高劑量組及辛伐他汀組。適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，對照組正常飲食，其余組予1.25%膽固醇高膽固醇繁殖飼料喂養(yǎng)［2］以建立AS模型。造模開始同時荷丹片低、高劑量組分別給予0.65、2.60 g·kg-1·d-1荷丹片灌胃，辛伐他汀組6 mg·kg-1·d-1辛伐他汀灌胃。對照組、模型組每日等量生理鹽水灌胃，每周稱體質(zhì)量調(diào)整劑量，共灌胃12周。12周末，待小鼠空腹12 h后處死，摘眼球取血，離心分離血清，-20℃保存。分離主動脈，置于液氮中保存。

1.3 檢測項目及方法嚴格按照試劑盒說明書進行操作。ELISA法測定血清IL-1、IL-10水平，硫代巴比妥酸法測定MDA含量，黃嘌呤氧化酶法測定SOD活力。按TRizol試劑說明書提取組織總RNA，進行逆轉(zhuǎn)錄，嚴格按照試劑盒說明進行操作。逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈式反應(yīng)（RT-PCR）檢測：取上述互補脫氧核苷酸（cDNA）產(chǎn)物進行聚合酶鏈式反應(yīng)擴增。TNF-α引物（374 bp）：上游5′-CCTGTAGCCCACGTCG?TAGC-3′，下游5′-TTGACCTCAGCGCTGAGTTG-3′。β-ac?tin（173 bp）:上游5′-AAATCGTGCGTGACATCAAA-3′，下游5′-AAGGAAGGCTGGAAAAGAGC-3′，反應(yīng)條件參考文獻［3］。RT-PCR反應(yīng)產(chǎn)物于1.5%瓊脂糖凝膠電泳。以β-actin為內(nèi)參，荷丹片對TNF-α mRNA表達的影響采用目的基因擴增片段的灰度值與β-actin擴增片段的灰度值的比值表示。

1.4 統(tǒng)計學方法采用SPSS 16.0軟件進行統(tǒng)計學處理。符合正態(tài)分布的計量資料以表示。多組間比較采用單因素方差分析，組間多重比較，方差齊采用LSD-t法，方差不齊采用Dunnett T3方法，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 荷丹片對APOE-/-小鼠血清IL-1、IL-10的影響模型組較對照組IL-1水平升高，IL-10水平降低，荷丹片低劑量組、荷丹片高劑量組、辛伐他汀組較模型組IL-1水平降低，IL-10水平升高（P＜0.01）。荷丹片低劑量組的IL-1水平高于辛伐他汀組（P＜0.01），IL-10水平差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）；荷丹片高劑量組與辛伐他汀組的IL-1、IL-10水平差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），見表1。

2.2 荷丹片對APOE-/-小鼠血清MDA、SOD的影響模型組較對照組MDA升高，SOD降低（P＜ 0.01）；荷丹片低劑量組、荷丹片高劑量組、辛伐他汀組較模型組的MDA降低，SOD升高（P＜0.01）。荷丹片低劑量組的MDA高于辛伐他汀組，SOD低于辛伐他汀組（P＜0.01）；荷丹片高劑量組與辛伐他汀組的MDA、SOD水平差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），見表2。

Tab.1Effects of Hedan tablet on serum levels of IL-1 and IL-10 in APOE-/-mouse表1 荷丹片對APOE-/-小鼠血清IL-1、IL-10的影響（n=10，ng/L,）

Tab.1Effects of Hedan tablet on serum levels of IL-1 and IL-10 in APOE-/-mouse表1 荷丹片對APOE-/-小鼠血清IL-1、IL-10的影響（n=10，ng/L,）

＊＊P＜0.01；a與對照組比較，b與模型組比較，c與荷丹片低劑量組比較，P＜0.01；表2同

IL-10 33.79±2.35 26.44±2.68a31.99±2.81b34.28±3.20b33.05±2.78b13.07＊＊組別對照組模型組荷丹片低劑量組荷丹片高劑量組辛伐他汀組F IL-1 116.82±8.06 207.85±11.43a161.63±9.64b121.18±8.08b115.48±7.55bc196.52＊＊

Tab.2Effects of Hedan tablet on serum levels of MDAand SOD in APOE-/-mouse表2 荷丹片對APOE-/-小鼠血清MDA、SOD的影響（n=10,）

Tab.2Effects of Hedan tablet on serum levels of MDAand SOD in APOE-/-mouse表2 荷丹片對APOE-/-小鼠血清MDA、SOD的影響（n=10,）

組別對照組模型組荷丹片低劑量組荷丹片高劑量組辛伐他汀組F MDA（μmol/L）37.00±4.07 52.02±7.05a41.00±3.77b36.02±4.06b33.30±4.02bc23.79＊＊SOD（U/mL）98.08±5.28 86.58±3.62a94.92±5.69b98.59±4.10b100.18±4.63bc13.21＊＊

2.3 荷丹片對APOE-/-小鼠主動脈組織TNF-α mRNA表達的影響對照組、模型組、荷丹片低劑量組、荷丹片高劑量組、辛伐他汀組TNF-α mRNA表達量分別為0.27±0.04、0.58±0.06、0.36±0.05、0.25± 0.04及0.21±0.04（F=89.92，P＜0.05），其中模型組較對照組升高（P＜0.01），荷丹片低劑量組、荷丹片高劑量組、辛伐他汀組較模型組降低（P＜0.01）；荷丹片低劑量組較辛伐他汀組升高（P＜0.01），但荷丹片高劑量組與辛伐他汀組差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），見圖1。

Fig.1Transcription level of TNF-α mRNA圖1 各組TNF-α mRNA表達

3 討論

中醫(yī)理論認為，AS屬于本虛標實之血瘀、痰濁的范疇，治療上有祛痰降濁、活血化瘀、補益肝腎等方法。荷丹片是一種將荷葉、丹參、補骨脂、潘瀉葉及山楂配伍組方的新型調(diào)脂中藥。AS的病因尚未完全明確。研究顯示，炎癥是AS早期形成的重要誘因，由炎癥介導的脂質(zhì)代謝異常是AS的關(guān)鍵環(huán)節(jié)［4］。炎癥反應(yīng)參與AS發(fā)生、發(fā)展的全過程，并被看作是AS的有效治療靶點［5］。

IL-1是參與AS過程的典型的促炎細胞因子，可促進黏附分子的表達，增加肝臟急相反應(yīng)蛋白的合成。IL-10可以抑制炎性細胞的激活、黏附和浸潤，抑制Th1淋巴細胞分泌干擾素（IFN）-γ、TNF-α等細胞因子。前期研究證實，荷丹片可以通過調(diào)脂作用干預(yù)APOE-/-小鼠AS［6］。本研究結(jié)果顯示，荷丹片低、高劑量組、辛伐他汀組較模型組IL-1水平降低、IL-10水平升高，提示荷丹片可通過下調(diào)APOE-/-小鼠血清促炎性細胞因子IL-1水平，同時上調(diào)IL-10水平來發(fā)揮抗炎作用。

TNF-α能激活核因子（NF）-κB信號通路，誘導黏附分子的表達，促進單核細胞聚集浸潤［7］。通常情況下，TNF-α可增強低密度脂蛋白（LDL）與內(nèi)皮細胞的黏附結(jié)合，可阻斷脂蛋白酯酶而導致高三酰甘油血癥，減少脂肪酸的氧化，促進氧自由基的產(chǎn)生。本研究結(jié)果顯示，荷丹片低、高劑量組、辛伐他汀組較模型組TNF-α水平降低，提示荷丹片可以通過降低TNF-α水平來減輕炎癥反應(yīng)，與況軍等［8］研究認為的荷葉堿降低小鼠AS血管炎癥的結(jié)果一致。因此，筆者推測荷丹片可以通過其君藥荷葉的主要活性成分荷葉堿［9］來降低炎癥反應(yīng)，干預(yù)AS的發(fā)生發(fā)展。

氧化應(yīng)激反應(yīng)增強對細胞和生物大分子產(chǎn)生毒性反應(yīng)，誘導細胞凋亡、壞死，并可能導致促炎性細胞因子生成增多，進而引發(fā)病變，加快AS的進展［10］。體內(nèi)MDA的含量可反映機體內(nèi)脂質(zhì)過氧化反應(yīng)的程度已得到臨床共識［11］。本研究結(jié)果顯示，荷丹片低、高劑量組、辛伐他汀組較模型組MDA降低，SOD升高，表明荷丹片可以通過降低MDA水平、升高SOD水平來抑制氧化應(yīng)激反應(yīng)。SOD是存在于胞漿和線粒體中清除氧自由基的關(guān)鍵酶，可保護機體不受氧自由基損傷，因此，筆者認為測定SOD的活性可反映出機體抗氧化的能力。綜上所述，荷丹片可以降低炎癥反應(yīng)、減輕氧化應(yīng)激狀態(tài)、抑制單核細胞聚集、保護血管內(nèi)皮細胞，從而干預(yù)AS的發(fā)生發(fā)展，為AS的臨床防治提供了廣闊的應(yīng)用前景。

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（2015-01-28收稿 2015-03-31修回）

（本文編輯 陸榮展）

Effects of Hedan tablet on cytokins and oxidative stress factors in APOE-/-mouse

YU Baiqing1,ZHOU Yujuan2△,LIU Fulin3,CAO Xiaohua3,XU Mingxuan4
1 Graduate College，Hebei University，Baoding 071000，China；2 Basic Medical College，Hebei University；3 Affiliated Hospital of Hebei University；4 the People′s Hospital of Cangzhou△

ObjectiveTo observe the effects of Hedan tablet on cytokines and oxidation factors in APOE-/-mouse,and to explore its effect on atherosclerosis and to explore its behind mechanism.MethodsAPOE-/-mice（n=50）were randomly divided into control group,model group,low dose Hedan tablet treatment group,high dose Hedan tablet treatment group and simvastatin treatment group.Mice in control group were given normal feed while mice in other groups were fed with high cho?lesterol diet.Hedan or Simvastatin was administrated intra-gastrically while normal saline was given to model group in the same route.After 12 weeks,mice were sacrificed to observe the mRNA level of tumor necrosis factor-α（TNF-α mRNA）in aorta by RT-PCR.Mean while,serum levels of interleukin-1（IL-1）,interleukin-10（IL-10）,malonaldehyde（MDA）and su?peroxide dismutase（SOD）were determined in different groups.ResultsCompared with control group,TNF-α mRNA tran?scription level as well as serum levels of IL-1 and MDA significantly increase while serum levels of IL-10 and SOD de?creased remarkably in model group,（P＜0.01）.Compared with model group,mRNA levels of TNF-α as well as serum levels of IL-1 and MDA were significantly decreased while serum levels of IL-10,SOD were greatly increased in low dose and high dose Hedan tablet treatment groups as well as in simvastatin treatment group（P＜0.01）.ConclusionHedan tablet inhibit the formation of atherosclerosis through its anti-oxidation role and anti-inflammation role.

atherosclerosis；apolipoproteins E；models,animal；Hedan tablet；atherosclerosis；APOE-/-mouse；inflam?mation factor；oxidation stress factor

R972.6；R394.114

A

10.11958/j.issn.0253-9896.2015.10.016

河北大學醫(yī)學學科專項基金建設(shè)項目（2012A3001）

1河北保定，河北大學研究生院（郵編071000）；2基礎(chǔ)醫(yī)學院藥理教研室；3河北大學附屬醫(yī)院；4滄州市人民醫(yī)院

于柏青（1990），女，碩士在讀，主要從事心血管藥理學研究

△通訊作者E-mail:zyj@hbu.edu.cn