新生小鼠缺氧缺血性腦病腦組織caspase-3表達(dá)的變化

肖愛嬌，康明非，汪建民，羅小泉

新生小鼠缺氧缺血性腦病腦組織caspase-3表達(dá)的變化

肖愛嬌1，康明非2，汪建民3，羅小泉4

目的觀察半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶（caspase）-3在新生兒缺氧缺血性腦?。∟HIE）小鼠模型腦組織中表達(dá)的變化。方法選取7 d CD1新生小鼠30只，按隨機(jī)數(shù)字表法分為假手術(shù)組（9只）和NHIE模型組（21只），后者制備NHIE動(dòng)物模型。用TTC染色法檢查2組的腦組織梗死面積；DAPI染色觀察腦組織病理變化；原位末端標(biāo)記技術(shù)檢測(cè)腦組織細(xì)胞凋亡；熒光免疫組化法檢測(cè)腦組織中caspase-3表達(dá)水平。結(jié)果假手術(shù)組小鼠腦組織未見梗死灶，腦組織細(xì)胞排列致密整齊，TUNEL陽性細(xì)胞數(shù)［（18.57±4.98）個(gè)］和caspase-3陽性細(xì)胞數(shù)［（9.17±2.14）個(gè)］明顯低于NHIE模型組的TUNEL陽性細(xì)胞數(shù)［（209.57±41.27）個(gè)］和caspase-3陽性細(xì)胞數(shù)［（63.33±16.22）個(gè)］；與假手術(shù)組相比，NHIE模型組小鼠的右側(cè)半球可見梗死灶，腦組織細(xì)胞大量壞死脫落、周圍組織間隙變大。結(jié)論NHIE模型鼠出現(xiàn)的腦組織損傷可能與caspase-3表達(dá)增加、腦組織細(xì)胞凋亡增加有關(guān)。

缺氧缺血；腦梗死；細(xì)胞凋亡；半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3；小鼠；缺氧缺血性腦病

新生兒缺氧缺血性腦?。╪eonatal hypoxic-isch?emic encephalopathy,NHIE）指各種圍生期窒息引起的部分或完全缺氧、腦血流減少或暫停而導(dǎo)致的胎兒或新生兒腦損傷［1］，是新生兒窒息后的嚴(yán)重并發(fā)癥，較為常見，病情重且病死率高；并可產(chǎn)生永久性神經(jīng)功能障礙，如智力低下、癲癇、腦性癱瘓、痙攣和共濟(jì)失調(diào)等，嚴(yán)重影響患兒的生活質(zhì)量，給社會(huì)和家庭造成沉重的負(fù)擔(dān)。研究報(bào)道細(xì)胞凋亡參與了缺氧缺血性腦損傷的發(fā)病過程［2-3］。而半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶（caspase）-3是細(xì)胞凋亡的主要執(zhí)行者，研究發(fā)現(xiàn)，NHIE模型鼠腦組織中caspase-3活性增加［4-5］，而NHIE模型鼠腦組織中caspase-3表達(dá)量是否增

加尚不清楚。本研究通過建立NHIE小鼠模型，觀察腦組織損傷程度、細(xì)胞凋亡及caspase-3表達(dá)情況，為下一步研究藥物的作用機(jī)制奠定實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料出生7 d的CD1新生小鼠30只，雌雄不拘，購自湖南斯萊克景達(dá)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司。TTC試劑（2,3,5-氯化三苯基四氮唑，Sigma）；凋亡原位檢測(cè)試劑盒（S7165，Mil?lipore）；兔抗小鼠caspase-3（#9664,Cell Signaling Technolo?gy）；山羊抗兔（A11011,Invitrogen）；含DAPI的熒光封片劑（P36931，Invitrogen）。DL-SSJ頭戴式手術(shù)顯微鏡（中國(guó)DL公司）；Leica熒光顯微鏡及圖像分析軟件（德國(guó)Leica公司）。

1.2 方法

1.2.1 NHIE新生鼠模型制備將小鼠按隨機(jī)數(shù)字表法分為假手術(shù)組（9只）和模型組（21只）。模型組參照Rice-Van?nucci［6］和Levine［7］的方法制備NHIE鼠模型：給予異氟烷吸入麻醉，動(dòng)物在麻醉狀態(tài)下行頸部正中切口，分離右側(cè)頸總動(dòng)脈后用電凝法閉合頸總動(dòng)脈，縫合傷口。術(shù)后動(dòng)物在室溫中恢復(fù)和母乳喂養(yǎng)2 h后，進(jìn)行低氧處理：將動(dòng)物置于37℃的密閉艙內(nèi)，通入含5%CO2的N2，調(diào)節(jié)氧氣濃度為8%，100 min后將動(dòng)物取出，返回母鼠身邊繼續(xù)哺乳喂養(yǎng)。假手術(shù)組：只做手術(shù)，不閉合頸總動(dòng)脈，不缺氧處理。

1.2.2 腦組織梗死檢查于造模后1 d，給予動(dòng)物異氟醚吸入麻醉后迅速取腦（假手術(shù)組6只，模型組18只），以1.5 mm左右間隔自額向枕切成4個(gè)冠狀切片，加入1%TTC染液，置于37℃溫箱中染色20 min，用掃描儀進(jìn)行掃描，Image J軟件測(cè)量每張腦片的梗死面積，并計(jì)算梗死體積百分比（%）=［健側(cè)半球體積–（患側(cè)半球體積–梗死體積）］/健側(cè)半球體積× 100%［8］。

1.2.3 腦組織形態(tài)學(xué)觀察于造模后7 d，給予動(dòng)物異氟醚吸入麻醉后迅速取腦，數(shù)碼相機(jī)拍照后切片，厚30 μm，用含DAPI的P36931熒光封片劑封片，顯微鏡下觀察拍照。

1.2.4 腦組織細(xì)胞凋亡檢測(cè)于造模后3 d，給予動(dòng)物異氟烷吸入麻醉后迅速取腦（2組各3只），置于4%多聚甲醛溶液中固定，PBS清洗后進(jìn)行切片，厚30 μm，置于1%多聚甲醛溶液中備用。隨機(jī)抽取腦組織切片，每個(gè)標(biāo)本取3～5片，按原位凋亡檢測(cè)試劑盒說明書檢測(cè)腦組織細(xì)胞凋亡，即PBS液清洗、末端脫氧核糖轉(zhuǎn)移酶（TdT酶）工作液37℃孵育1 h、反應(yīng)終止液、PBS液清洗、加入羅丹明標(biāo)記物，室溫下放置30 min，PBS液清洗后用普通熒光封片劑封片，熒光顯微鏡觀察、拍照。圖中紅色為TUNEL染色陽性細(xì)胞，計(jì)數(shù)每個(gè)100倍視野下的TUNEL陽性細(xì)胞數(shù)。

1.2.5 腦組織caspase-3陽性細(xì)胞檢測(cè)于造模后3 d，給予動(dòng)物異氟烷吸入麻醉后迅速取腦，每組取3個(gè)標(biāo)本，置于4%多聚甲醛溶液中固定，然后移至梯度蔗糖溶液中脫水。待組織塊下沉后進(jìn)行切片，厚30 μm，置于1%多聚甲醛溶液中備用。隨機(jī)抽取腦組織切片，每個(gè)標(biāo)本取3～5片，經(jīng)PBS漂洗、正常血清封閉后加入兔抗小鼠caspase-3一抗（1∶250），4℃孵育過夜，陰性對(duì)照不加一抗，用PBS代替。PBS液洗后，加入山羊抗兔二抗（1∶500），室溫下避光孵育1 h。PBS液洗后風(fēng)干，用含DAPI的熒光封片劑封固，熒光顯微鏡觀察、拍照。細(xì)胞中caspase-3蛋白呈現(xiàn)紅色，DAPI呈現(xiàn)藍(lán)色。用Image J軟件進(jìn)行圖像分析，分別計(jì)算每張圖片、每100倍視野下的caspase-3陽性細(xì)胞數(shù)。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法用軟件SPSS 13.0進(jìn)行分析，計(jì)量指標(biāo)用表示，2組比較用t檢驗(yàn)，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 腦組織梗死觀察假手術(shù)組腦組織全部染成紅色，未見梗死灶，見圖1A。模型組左側(cè)半球呈紅色；右側(cè)半球有白色梗死灶，見圖1B。腦組織梗死體積百分比為（46.56±6.90）%。

Fig.1TTC staining of mice coronal section of brain圖1 小鼠腦組織TTC染色結(jié)果

2.2 腦組織形態(tài)學(xué)觀察

2.2.1 大體觀察假手術(shù)組腦組織紅潤(rùn)，腦溝及腦回清晰，見圖2A。模型組右側(cè)腦組織表面蒼白、出現(xiàn)液化，且腦溝變淺、腦回變寬，見圖2B。

2.2.2 鏡下觀察假手術(shù)組小鼠腦組織細(xì)胞排列致密、整齊，見圖3A。模型組小鼠患側(cè)腦組織大量細(xì)胞壞死、脫落，周圍間隙增大，見圖3B。

2.3 腦組織TUNEL陽性細(xì)胞數(shù)假手術(shù)組小鼠右側(cè)腦組織TUNEL陽性細(xì)胞數(shù)明顯低于模型組（P＜0.05），見圖4、表1。

Tab.1Number of TUNEL-positive cells and caspase-3-positive cells in two groups of rats表1 2組小鼠腦組織中TUNEL陽性細(xì)胞數(shù)和caspase-3陽性細(xì)胞數(shù)比較

Tab.1Number of TUNEL-positive cells and caspase-3-positive cells in two groups of rats表1 2組小鼠腦組織中TUNEL陽性細(xì)胞數(shù)和caspase-3陽性細(xì)胞數(shù)比較

＊P＜0.05

組別假手術(shù)組模型組t n33 TUNEL陽性細(xì)胞數(shù)18.57±4.98 209.57±41.27 18.43＊caspase-3陽性細(xì)胞數(shù)9.17±2.14 63.33±16.22 8.110＊

2.4 腦組織caspase-3陽性細(xì)胞數(shù)假手術(shù)組小鼠右側(cè)腦組織caspase-3陽性細(xì)胞數(shù)明顯低于模型組（P＜0.05），見圖5、表1。

3 討論

NHIE是由各種因素（如宮內(nèi)窘迫、臍帶脫垂以及產(chǎn)婦休克等圍產(chǎn)期因素）引起圍產(chǎn)期窒息，進(jìn)而導(dǎo)致腦的缺氧缺血性損傷［9］。據(jù)資料統(tǒng)計(jì)，NHIE占新生兒住院病例的18.1%。我國(guó)每年出生活產(chǎn)嬰兒1 800萬～2 000萬，窒息發(fā)生率為13.6%，因?yàn)橹舷?dǎo)致傷殘占窒息患兒的15.6%，每年大約有30萬殘疾兒童產(chǎn)生，嚴(yán)重危害了兒童的生活質(zhì)量［10］。因而對(duì)該病的研究引起了廣泛的關(guān)注。

許多疾病的研究都得益于成功的動(dòng)物模型。由Rice［6］和Levine［7］建立的NHIE新生鼠模型是目前使用最多的模型。因此，本研究參照上述方法，采用單側(cè)頸總動(dòng)脈閉塞后再給予缺氧100 min制備NHIE新生小鼠模型，TTC染色和形態(tài)學(xué)觀察結(jié)果顯示：假手術(shù)組小鼠腦組織未見梗死灶，腦組織外觀紅潤(rùn)，組織細(xì)胞排列致密、整齊；而模型組小鼠患側(cè)半球可見梗死灶，患側(cè)腦組織表面蒼白、出現(xiàn)液化，組織細(xì)胞大量壞死脫落，周圍間隙擴(kuò)大。上述結(jié)果表明，頸總動(dòng)脈閉塞后、缺氧100 min可造成腦組織損傷。然而腦組織損傷的病理機(jī)制卻是相當(dāng)復(fù)雜。

NHIE的病理機(jī)制很多，包括線粒體損傷、氧化應(yīng)激、炎癥反應(yīng)、興奮性毒性和細(xì)胞凋亡等。其中，細(xì)胞凋亡在缺氧缺血性腦損傷中的作用十分重要。本研究觀察到，NHIE新生鼠模型腦組織中TUNEL陽性細(xì)胞數(shù)增加。表明細(xì)胞凋亡參與了新生鼠缺氧缺血性腦損傷的發(fā)生。與文獻(xiàn)［2-3,11］研究結(jié)果相似。Caspase-3是細(xì)胞凋亡的主要執(zhí)行者，其可通過多個(gè)途徑作用于細(xì)胞骨架蛋白、DNA修復(fù)調(diào)節(jié)因子、細(xì)胞周期調(diào)節(jié)蛋白等，導(dǎo)致細(xì)胞DNA修復(fù)功能喪失、caspase激活的脫氧核糖核酸酶（caspases-acti?vated DNase，CAD）激活，導(dǎo)致DNA片段化，失去正常功能而凋亡［12］。據(jù)研究報(bào)道，NHIE模型鼠腦組織中caspase-3活性增加［4-5,13］。本研究觀察到，NHIE模型小鼠患側(cè)腦組織caspase-3陽性細(xì)胞數(shù)明顯增多。上述研究結(jié)果表明，NHIE可能與caspase-3表達(dá)增多、導(dǎo)致細(xì)胞凋亡增加有關(guān)。

（圖3～5見插頁）

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（2015-04-10收稿 2015-06-10修回）

（本文編輯 閆娟）

Increased expression of caspase-3 in ipsilateral neonatal hypoxic-ischemia encephalopathy model in mice

XIAO Aijiao1,KANG Mingfei2,WANG Jianmin3,LUO Xiaoquan4
1 Department of Physiology，2 Department of Rehabilitation of Affiliated Hospital，3 Department of Anatomy，4 Animal Experiment Center of Science and Technology，Jiangxi University of Traditional Chinese Medicine，Nanchang 330004，China

ObjectiveTo observe apoptotic cells and caspase-3-positive cells in ipsilateral neonatal hypoxic-isch?emia encephalopathy（NHIE）model in mice.MethodsCD1 mice of age 7 days（n=30）were randomly divided into two groups:sham group（n=9）and model group（n=21）.NHIE model was induced by right common carotid artery ligation fol?lowed by 8%oxygen hypoxia for 100 min.TTC staining was used to determine area of brain infarction.DAPI staining was used to detect pathological change in brains.TUNEL assay was used to detect apoptotic cells and fluorescence immunohisto?chemistry was used to detect caspase-3 expression in the ipsilateral brain.ResultsNo infarct was detected in sham group. Cells were densely and orderly arranged in brain.TUNEL-positive cells（18.57±4.98）and caspase-3-positive cells（9.17± 2.14）in the ipsilateral brain were both less than those in the ipsilateral brain of mice in model group（209.57±41.27）and（63.33±16.22）respectively.Mice in model group presented infarct in the right hemisphere with more dead cells and wider in?terstitial space compared with sham group.ConclusionBrain injury in NHIE model might be related to the increasing cas?pase-3 expression thus leads to apoptosis.

hypoxia-ischemia；cerebral infarction；apoptosis；caspase 3；mice；hypoxic-ischemic encephalopathy

R742

A

10.11958/j.issn.0253-9896.2015.10.008

國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目（81060305）；江西中醫(yī)藥大學(xué)課題（2014ZR018）；江西省衛(wèi)生計(jì)生委中醫(yī)藥科研計(jì)劃項(xiàng)目（2014Z003）；江西省自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目（20151BAB205068）

1江西中醫(yī)藥大學(xué)生理學(xué)學(xué)科組（郵編330004），2針灸康復(fù)科，3解剖學(xué)學(xué)科組，4實(shí)驗(yàn)動(dòng)物科技中心

肖愛嬌（1973），女，副教授，博士，主要從事中醫(yī)藥神經(jīng)保護(hù)作用機(jī)制研究