卵巢癌對(duì)順鉑類藥物耐藥性的相關(guān)分析

張玉琪，邢麗，汪濤

卵巢癌對(duì)順鉑類藥物耐藥性的相關(guān)分析

張玉琪，邢麗，汪濤

目的篩選影響卵巢癌順鉑耐藥性的靶點(diǎn)基因。方法從GEO數(shù)據(jù)庫中下載對(duì)順鉑敏感和產(chǎn)生抗藥性的人類卵巢癌細(xì)胞基因表達(dá)譜和甲基化譜數(shù)據(jù)（GSE15709），利用R的相關(guān)工具包篩選A2780和A2780/DDP（順鉑耐藥卵巢癌細(xì)胞系）兩類卵巢癌細(xì)胞之間的差異表達(dá)和差異甲基化的基因；使用DAVID數(shù)據(jù)庫對(duì)差異表達(dá)基因進(jìn)行功能富集分析；對(duì)同時(shí)發(fā)生了差異甲基化、差異表達(dá)且甲基化水平、表達(dá)水平的變化趨勢(shì)相反的基因，進(jìn)一步利用qRT-PCR技術(shù)檢測(cè)這些基因在兩種卵巢癌細(xì)胞中的表達(dá)值。結(jié)果研究發(fā)現(xiàn)在兩種卵巢癌細(xì)胞之間發(fā)生了416個(gè)差異表達(dá)和281個(gè)差異甲基化的基因，這些差異表達(dá)基因主要富集于細(xì)胞周期、核分裂和蛋白修飾負(fù)調(diào)控等生物過程。此外，細(xì)胞周期、DNA復(fù)制和p53等通路在這些基因中同樣富集。共發(fā)現(xiàn)4個(gè)發(fā)生了差異甲基化、差異表達(dá)且甲基化變化水平、表達(dá)水平變化趨勢(shì)相反的基因，qRT-PCR實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證了這些基因在兩種卵巢癌細(xì)胞中的表達(dá)水平。結(jié)論利用生物信息學(xué)和分子生物學(xué)相結(jié)合的方法，可以篩選出部分影響卵巢癌對(duì)順鉑抗藥性的基因，為進(jìn)一步揭示其中的分子機(jī)制提供實(shí)驗(yàn)參考。

順鉑；卵巢腫瘤；計(jì)算生物學(xué)；逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)；qRT-PCR；A2780；A2780/DDP

卵巢癌是發(fā)病率和死亡率較高的惡性腫瘤之一，其發(fā)病率在婦科癌癥中高居第3位，死亡率居于首位［1］?；熓锹殉舶┲匾闹委熓侄危皂樸K為代表的鉑類是化療中最常使用的藥物。但其耐藥性始終是困擾臨床的一個(gè)重要問題，嚴(yán)重影響著患者的生活質(zhì)量及生存率。表觀遺傳學(xué)的重要分支DNA甲基化對(duì)基因的表達(dá)調(diào)控起著非常重要的作用［2-3］。研究表明，DNA甲基化與卵巢癌發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)［4-6］，但關(guān)于DNA甲基化和卵巢癌耐藥性的關(guān)系鮮有報(bào)道。本研究從DNA甲基化入手探究卵巢癌患者對(duì)順鉑產(chǎn)生耐藥性的分子機(jī)制，篩選耐藥性的分子靶標(biāo)有助于進(jìn)一步制定、調(diào)整卵巢癌治療策略。

1 材料與方法

1.1 材料人卵巢癌細(xì)胞A2780和A2780/DDP（順鉑耐藥卵巢癌細(xì)胞系）購自同濟(jì)醫(yī)院腫瘤中心。DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清（FBS）、抗生素、Trizol均購自Invitrogen公司；M-MLV逆轉(zhuǎn)錄酶、SYBR green染料購自Roche公司；順鉑（批號(hào): 091102）購自江蘇豪森藥業(yè)股份有限公司。

1.2 方法

1.2.1 芯片數(shù)據(jù)所用mRNA表達(dá)譜和DNA甲基化數(shù)據(jù)來自GEO數(shù)據(jù)庫中編號(hào)為GSE15709的芯片數(shù)據(jù)，由Li等［7］提供。細(xì)胞類型是A2780卵巢癌細(xì)胞，在mRNA表達(dá)譜數(shù)據(jù)中，對(duì)照組是對(duì)順鉑敏感的A2780細(xì)胞樣本，實(shí)驗(yàn)組是用順鉑處理過5輪的A2780細(xì)胞樣本，各有5個(gè)生物學(xué)重復(fù)，基于GPL570［HG-U133_Plus_2］Affymetrix Human Genome U133 Plus 2.0 Array平臺(tái)進(jìn)行檢測(cè)；在DNA甲基化數(shù)據(jù)中，對(duì)照組為對(duì)順鉑敏感的A2780細(xì)胞樣本，有3個(gè)生物學(xué)重復(fù)，實(shí)驗(yàn)組為用順鉑處理過1輪、3輪和5輪的A2780細(xì)胞樣本，各有1個(gè)，基于GPL8341平臺(tái)進(jìn)行檢測(cè)。

1.2.2 芯片數(shù)據(jù)預(yù)處理對(duì)于mRNA表達(dá)譜數(shù)據(jù)，首先得到原始的CEL格式的數(shù)據(jù)，利用R統(tǒng)計(jì)軟件的affy［8］包進(jìn)行背景校準(zhǔn)和標(biāo)準(zhǔn)化，并利用芯片平臺(tái)的注釋包把探針符號(hào)轉(zhuǎn)化為基因符號(hào)；對(duì)于多個(gè)探針對(duì)應(yīng)一個(gè)基因符號(hào)的情況，取探針上表達(dá)值的平均值作為該基因的表達(dá)值。DNA甲基化芯片的預(yù)處理主要包括利用背景差分去除背景噪音，利用LOESS標(biāo)準(zhǔn)化方法去除技術(shù)誤差，對(duì)于多個(gè)探針對(duì)應(yīng)同一個(gè)基因的情況，取這些探針甲基化水平的平均值作為這個(gè)基因的甲基化水平。

1.2.3 差異表達(dá)和差異甲基化基因的篩選差異表達(dá)基因的篩選主要是通過芯片數(shù)據(jù)線性模型（R的limma）［9］包，對(duì)每個(gè)基因在實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組的表達(dá)值進(jìn)行t檢驗(yàn)和錯(cuò)誤發(fā)現(xiàn)率（FDR）校正。選擇FDR＜0.05并且|log2（fold change）|＞1的基因作為對(duì)順鉑有耐藥性（用順鉑處理了5輪）的卵巢癌細(xì)胞相對(duì)于對(duì)順鉑敏感的卵巢癌細(xì)胞的差異表達(dá)基因（DEG）。為了與表達(dá)譜數(shù)據(jù)相對(duì)應(yīng)，本研究利用的DNA甲基化數(shù)據(jù)為用順鉑處理過5輪的卵巢癌細(xì)胞與對(duì)順鉑敏感的卵巢癌細(xì)胞進(jìn)行對(duì)比；當(dāng)滿足|log2（cy5/cy3）|＞1（cy5為對(duì)順鉑有耐藥性的卵巢癌細(xì)胞的甲基化水平，cy3為對(duì)順鉑敏感的卵巢癌細(xì)胞的甲基化水平）時(shí)，認(rèn)為是發(fā)生了差異甲基化的基因，則記為差異甲基化基因（DEMethy）。

1.2.4 DEG的功能富集分析利用DAVID［10］（http://david. abcc.ncifcrf.gov/）在線工具，對(duì)DEG中的基因進(jìn)行富集分析，選取的背景基因是人類全基因組的基因，物種是人類。最后分別以P＜0.05，并且至少富集了10個(gè)基因和P＜0.05并且至少富集了5個(gè)基因?yàn)殚撝祦磉x取富集的基因本體條目（GO terms）和KEGG通路（KEGG pathways）。

1.2.5 差異表達(dá)與差異甲基化基因的綜合分析將DEG和DEMethy中的基因進(jìn)行對(duì)比，得到重合的基因。由于DNA的甲基化會(huì)抑制基因的表達(dá)，研究從重合的基因中選取甲基化和表達(dá)值的變化水平呈相反趨勢(shì)的基因。

1.2.6 細(xì)胞培養(yǎng)人卵巢癌細(xì)胞A2780和A2780/DDP接種于含10%FBS和1%雙抗（青-鏈霉素）的DMEM培養(yǎng)基中，置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中常規(guī)傳代培養(yǎng)，每2～3 d換液1次。

1.2.7 qRT-PCR驗(yàn)證為了進(jìn)一步驗(yàn)證基因芯片的結(jié)果，利用qRT-PCR檢測(cè)上述實(shí)驗(yàn)所得DEG。Trizol法提取細(xì)胞總RNA并測(cè)定濃度，取2 μg總RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA后進(jìn)行qRT-PCR反應(yīng)，以GAPDH作為內(nèi)參，所需引物見表1。擴(kuò)增條件：94℃12 min，94℃30 s，58℃30 s，72℃30 s，40個(gè)循環(huán)；72℃5 min。qRT-PCR結(jié)果采用2-ΔΔCT法分析。

Tab.1Primers of G6PD，ISL1，NEFL，PSMA1 and GAPDH for qRT-PCR表1 G6PD、ISL1、NEFL、PSMA1、GAPDH的qRT-PCR引物

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用SPSS 11.5軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均以表示，兩組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 差異表達(dá)和差異甲基化基因以FDR＜0.05和|log2（fold change）|＞1為閾值，得到實(shí)驗(yàn)組相對(duì)于對(duì)照組的DEG 416個(gè)，包括239個(gè)表達(dá)下調(diào)的基因和177個(gè)表達(dá)上調(diào)的基因。在這些DEG中，KCNJ2是差異最顯著同時(shí)變化倍數(shù)也較大的基因，TSPAN8是實(shí)驗(yàn)組相對(duì)于對(duì)照組表達(dá)水平升高得最明顯的基因。本研究利用這些DEG，對(duì)樣本進(jìn)行了有監(jiān)督的聚類，見圖1。實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組都分別聚在一起，說明這些DEG在實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組中的表達(dá)值差異是明顯的；以|log2（fold change）|＞1為閾值，得到了用順鉑處理5輪的卵巢癌細(xì)胞相對(duì)于對(duì)順鉑敏感的卵巢癌細(xì)胞的差異甲基化基因有281個(gè)，包含198個(gè)發(fā)生了低甲基化的基因和83個(gè)發(fā)生了高甲基化的基因。

2.2 DEG的功能富集分析結(jié)果通過分析發(fā)現(xiàn)細(xì)胞周期、蛋白質(zhì)修飾過程的負(fù)調(diào)控、DNA復(fù)制和細(xì)胞增殖的調(diào)控DEG的主要富集功能。除此之外，還得到了7條在DEG中富集的KEGG通路，見表2。

2.3 DEG和差異甲基化基因的綜合分析通過對(duì)

比DEG和差異甲基化基因，得到了4個(gè)重合的基因：6-磷酸葡萄糖脫氫酶（G6PD）、胰島素基因增強(qiáng)蛋白-1（ISL1）、神經(jīng)微絲蛋白（NEFL）和蛋白酶體α型亞基（PSMA1）。并且，這4個(gè)基因的表達(dá)值變化水平和甲基化變化水平呈相反的趨勢(shì)，這也符合DNA甲基化對(duì)基因表達(dá)的影響。

2.4 qRT-PCR驗(yàn)證基因芯片結(jié)果G6PD和NEFL在對(duì)順鉑敏感的卵巢癌細(xì)胞A2780中表達(dá)明顯高于卵巢癌耐藥細(xì)胞A2780/DDP，而ISL1和PSMA1在對(duì)順鉑敏感的卵巢癌細(xì)胞A2780中表達(dá)顯著低于卵巢癌耐藥細(xì)胞A2780/DDP，見表3。

Fig.1The heat map of expression levels of differential expressed genes in each sample圖1 差異表達(dá)基因在各個(gè)樣本中表達(dá)值熱圖

Tab.3Comparison of genes expressions between ovarian cancer cells that were sensitive or resistant to Cisplatin表3 qRT-PCR檢測(cè)各基因在順鉑敏感和耐藥的卵巢癌細(xì)胞中的表達(dá)情況

Tab.3Comparison of genes expressions between ovarian cancer cells that were sensitive or resistant to Cisplatin表3 qRT-PCR檢測(cè)各基因在順鉑敏感和耐藥的卵巢癌細(xì)胞中的表達(dá)情況

＊P＜0.05

細(xì)胞A2780 A2780/DDP t n33 G6PD 1.02±0.05 0.32±0.01 26.87＊ISL1 0.98±0.03 2.41±0.33 10.97＊NEFL 0.99±0.16 0.76±0.05 4.67＊PSMA1 1.04±0.18 1.68±0.11 5.86＊

3 討論

順鉑是一種廣泛應(yīng)用于腫瘤化療中的藥物，以順鉑為基礎(chǔ)的聯(lián)合化療方案已在卵巢癌等多種疾病中表現(xiàn)出極為重要的抗腫瘤活性。盡管如此，受細(xì)胞獲得性及固有的耐藥性影響，患者從中獲益率還非常有限。目前，順鉑耐藥的分子機(jī)制還不明確。DNA是順鉑的主要靶點(diǎn)，順鉑結(jié)合會(huì)導(dǎo)致DNA損傷并誘發(fā)細(xì)胞凋亡。任何影響順鉑與DNA的結(jié)合以及干擾細(xì)胞凋亡的因素都可能導(dǎo)致耐藥性的產(chǎn)生。

本研究得到了實(shí)驗(yàn)組相對(duì)于對(duì)照組的DEG和差異甲基化基因，這些基因主要富集于細(xì)胞周期、DNA復(fù)制和p53等信號(hào)通路，而得到的4個(gè)重合基因——G6PD、ISL1、NEFL和PSMA1，其甲基化水平的變化和表達(dá)水平的變化趨勢(shì)是相反的。進(jìn)一步通過qRT-PCR實(shí)驗(yàn)在RNA水平驗(yàn)證這些基因在對(duì)順鉑產(chǎn)生了耐藥性的卵巢癌細(xì)胞中表達(dá)明顯增高。G6PD可以編碼葡萄糖-6-磷酸脫氫酶，至今已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了該基因兩種不同的轉(zhuǎn)錄本亞型；ISL1能夠編碼同結(jié)構(gòu)域的轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子，對(duì)胰島素基因的表達(dá)起重要的調(diào)控作用；NEFL能夠編碼神經(jīng)絲蛋白，是一種有抑癌作用的異質(zhì)多糖；PSMA1可以編碼泛蛋白酶體，并且由可變剪接能夠轉(zhuǎn)錄出多種轉(zhuǎn)錄本［11-12］。

NEFL神經(jīng)絲輕鏈基因，隸屬于驅(qū)動(dòng)蛋白超家族基因，被認(rèn)為是一種抑癌基因。有研究報(bào)道NEFL基因微衛(wèi)星的雜合性缺失與多種腫瘤的發(fā)生和進(jìn)展相關(guān)。G6PD是戊糖磷酸途徑所需限速酶。戊糖磷酸途徑5磷酸核糖及還原型輔酶Ⅱ都是腫瘤細(xì)胞增殖分裂的重要原料。前者是DNA、RNA合成的基礎(chǔ)物質(zhì)，后者維持著谷胱甘肽的還原狀態(tài)。研究證實(shí)此兩者均與順鉑耐藥相關(guān)，與既往報(bào)道一致［13］。

ISL1屬于LIM同源框基因，其編碼的蛋白具有

促進(jìn)細(xì)胞增殖分化、血管形成等多種生物活性。其不僅與正常的生長相關(guān)，而且是腫瘤的自分泌和旁分泌的生長因子，與腫瘤關(guān)系密切：負(fù)調(diào)控凋亡，促進(jìn)細(xì)胞增殖、血管增生、細(xì)胞浸潤。PSMA1是蛋白酶體的一個(gè)亞結(jié)構(gòu)，編碼高度有序，具有環(huán)形結(jié)構(gòu)20 S核心α亞基［14］。蛋白酶體是真核細(xì)胞依賴泛素化對(duì)蛋白降解的重要結(jié)構(gòu)。對(duì)細(xì)胞內(nèi)許多功能蛋白的降解起著重要的作用，廣泛影響著多條信號(hào)通路，與多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。據(jù)報(bào)道，靶向藥硼替佐米就是通過抑制PSMA1而發(fā)揮抗腫瘤活性作用的［15］。但目前對(duì)PSMA1研究仍較少，特別是與順鉑耐藥性的關(guān)系少見報(bào)道。本研究篩選結(jié)果發(fā)現(xiàn)ISL1和PSMA1可能與卵巢癌對(duì)順鉑耐藥有關(guān)，有待于后續(xù)實(shí)驗(yàn)在蛋白水平進(jìn)一步驗(yàn)證。

本研究通過生物信息學(xué)和分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)相結(jié)合的手段，發(fā)現(xiàn)了一些可能影響卵巢癌細(xì)胞對(duì)順鉑產(chǎn)生耐藥性的分子靶標(biāo)，有助于加深研究者關(guān)于卵巢癌對(duì)順鉑耐藥的認(rèn)識(shí)，為新藥的研發(fā)提供新的思路。

［1］Jiang J,Xie WY.Current Situation of the therapies of middle-ad?vanced ovarian cancer［J］.Anti-tumor Pharmacy,2013,3（6）:416-421.［蔣靜,謝宛玉.中晚期卵巢癌的治療現(xiàn)狀［J］.腫瘤藥學(xué), 2013.3（6）:416-421］.doi：10.3969/j.issn.2095-1264.2013.103.

［2］Wang HX,Zhai JJ,Wang L,et al.The differential expression of 14-3-3 protein in the cisplatin resistant of ovarian cancer［J］.Journal of Obstetrics and Gynecology in China,2011,27（7）:538-540.［王慧香,翟建軍，王蕾，等.卵巢癌順鉑耐藥細(xì)胞模型中14-3-3蛋白的差異表達(dá)［J］.中國實(shí)用婦科與產(chǎn)科雜志,2011,27（7）:538-540］.doi:1005-2216（2011）07-0538-03.

［3］Wang RX,Xu JH.Genome DNA methylation and histone methyla?tion［J］.Hereditas,2014,36（3）:191-199.［王瑞嫻，徐建紅.基因組DNA甲基化及組蛋白甲基化［J］.遺傳,2014,36（3）:191-199］. doi:10.3724/SP.J.1005.2014.0191.

［4］Ding Y,Gong XM.Progress of DNA methylation changes in ovarian cancer［J］.J Int Obstet Gynecol,2014,41（3）:236-239.［丁一，龔曉明.卵巢癌的DNA甲基化研究進(jìn)展［J］.國際婦產(chǎn)科學(xué)雜志，2014, 41（3）：236-239］.

［5］Jacob F,Hitchins MP,Fedier A,et al.Expression of GBGT1 is epi? genetically regulated by DNA methylation in ovarian cancer cells［J］.BMC Mol Biol,2014,15:24.doi:10.1186/1471-2199-15-24.

［6］Wittenberger T,Sleigh S,Reisel D,et al.DNA methylation markers for early detection of women's cancer:promise and challenges［J］. Epigenomics,2014,6（3）:311-327.doi:10.2217/epi.14.20.

［7］Li M,Balch C,Montgomery JS,et al.Integrated analysis of DNA methylation and gene expression reveals specific signaling path?ways associated with platinum resistance in ovarian cancer［J］. BMC Med Genomics,2009,2:34.doi:10.1186/1755-8794-2-34.

［8］Gautier L,Cope L,Bolstad BM,et al.affy--analysis of Affymetrix GeneChip data at the probe level［J］.Bioinformatics,2004,20（3）: 307-315.doi:10.1093/bioinformatics/btg405.

［9］Diboun I,Wernisch L,Orengo CA,et al.Microarray analysis after RNA amplification can detect pronounced differences in gene ex?pression using limma［J］.BMC Genomics,2006,7:252.doi: 10.1186/1471-2164-7-252.

［10］Sherman BT,Huang DW,Tanet Q,et al.DAVID Knowledgebase:a gene-centered database integrating heterogeneous gene annotation resources to facilitate high-throughput gene functional analysis［J］. BMC Bioinformatics,2007,8:426.doi:10.1186/1471-2105-8-426.

［11］Lee EL,Hasegawa Y,Shimizu T,et al.IK1 channel activity contrib?utes to cisplatin sensitivity of human epidermoid cancer cells［J］. Am J Physiol Cell Physiol,2008,294（6）:1398-1406.doi:10.1152/ ajpcell.00428.2007.

［12］Xu FQ,Yang Y,Zhang XD,et al.Effect of oncoprotein HBXIP on the proliferation of ovarian cancer cells［J］.Med J Chin PLA,2013，38（9）：725-728.［徐福強(qiáng)，楊瑩，張曉東，等.癌蛋白HBXIP對(duì)卵巢癌細(xì)胞增殖功能的影響［J］.解放軍醫(yī)學(xué)雜志，2013，38（9）：725-728］.

［13］Liang XJ,Taylor B,Cardarelli C,et al.Different roles for K+chanels in cisplatin-resistant cell lines argue against a critical role for these channels in cisplatin resistance［J］.Anticancer Res,2005,25（6B）: 4113-4122.

［14］Gaiteri C,Ding Y,French B,et al.Beyond modules and hubs:the potential of gene coexpression networks for investigating molecular mechanisms of complex brain disorders［J］.Genes Brain Behav, 2014,13（1）:13-24.doi:10.1111/gbb.12106.

［15］Vangipurapu J,Stan?áková A,Pihlajam?ki J,et al.Association of indices of liver and adipocyte insulin resistance with 19 confirmed susceptibility loci for type 2 diabetes in 6,733 non-diabetic Finnish men［J］.Diabetologia,2011,54（3）:563-571.doi:10.1007/s00125-010-1977-4.

（2014-12-16收稿 2015-04-16修回）

（本文編輯 魏杰）

The analysis of cisplatin resistance in ovarian cancer treatment

ZHANG Yuqi,XING Li,WANG Tao
Tianjin Central Hospital of Gynecology Obstetrics，Tianjin 300100，China

ObjectiveTo screen the target genes that contribute to cisplatin resistance in ovarian cancer treatment. MethodsGene expression and methylation profiles of ovarian cancer cells that were sensitive or resistant to cisplatin with accession number GSE15709 were downloaded from GEO database.Differential expressed and methylated genes were identi?fied through associating packages in R.DAVID database to screen the enriched GO terms and pathways of the different ex?pressed genes between A2780 and A2780/DDP.Gene Set Enrichment Analysis（GSEA）of different gene was performed against DAVID database.Genes that exhibited difference in both expression and methylation profiles between the two types of ovarian cancer cells as well as genes that present contradictory profile between expression and methylation were verified via qRT-PCR.ResultsWe found 416 different expressed genes and 281 methylated genes between the two types of ovari?an cancer cells respectively.These differential genes were rich in pathways of cell cycle,DNA replication,nucleus division，p53 signaling,and negative regulation of protein modification process etc.Four genes demonstrated contradictory profile be?tween expression and methylation in the two types of ovarian cancer cells and were verified by qRT-PCR.Conclusion Combination of bioinformatics and molecular biology is useful in the identification of target genes that contribute to resis?tance of cisplatin in ovarian cancer treatment and further reveal molecular mechanism behind it.

cisplatin；ovarian neoplasms；computational biology；reverse transcriptase polymerase chain reaction；qRTPCR；A2780；A2780/DDP

R737.31

A

10.11958/j.issn.0253-9896.2015.10.006

天津市中心婦產(chǎn)科醫(yī)院藥劑科（郵編300100）

張玉琪（1971），女，主管藥師，本科，主要從事臨床藥學(xué)方面研究