外泌體在疾病診斷和藥物遞送系統(tǒng)中的應(yīng)用研究進展

劉佳凡，楊莉，洪岸，王曉剛

（暨南大學(xué)生物醫(yī)藥研究院，廣東 廣州 510632）

·前沿與進展·

外泌體在疾病診斷和藥物遞送系統(tǒng)中的應(yīng)用研究進展

劉佳凡，楊莉，洪岸，王曉剛*

（暨南大學(xué)生物醫(yī)藥研究院，廣東 廣州 510632）

外泌體是直徑為30～100 nm的內(nèi)吞衍生囊泡，由多種活細(xì)胞分泌，含有大量的與其來源和功能密切相關(guān)的蛋白質(zhì)、脂質(zhì)和RNA分子，可以在細(xì)胞間傳遞。已有研究表明癌癥患者血液中的外泌體濃度比正常人高，且其中包含癌癥標(biāo)志分子，因此其有潛力成為疾病診斷的生物標(biāo)志物。此外，作為一種天然的物質(zhì)運輸載體，外泌體已經(jīng)被作為一種新型的藥物遞送系統(tǒng)，用于腫瘤及阿爾茨海默病等疾病的治療。對外泌體作為疾病診斷標(biāo)記物以及藥物遞送載體的研究進展進行綜述。

外泌體；生物標(biāo)志物；藥物遞送系統(tǒng)

近年來的癌癥研究中，藥物載體特別是納米級的藥物載體，由于其具有可包載疏水性藥物、提高藥物生物利用度、可特異性修飾和靶向遞送等特點，已成為研究熱點。例如脂質(zhì)體、微粒、納米粒等已得到廣泛研究［1-2］。而來源于細(xì)胞或生物體自身的天然載體外泌體（exosomes），可以從病人自身獲得，從而可極大地減小載體自身的毒性及免疫原性，另外，外泌體作為一種膜結(jié)構(gòu)載體，能夠通過其表面的膜蛋白與靶細(xì)胞膜融合，從而將其負(fù)載的藥物直接運送到受體細(xì)胞中，避免了細(xì)胞吞噬-溶酶體途徑帶來的藥物降解及細(xì)胞毒性等問題。因此，外泌體作為一種新型藥物載體獲得了廣泛關(guān)注。此外，許多研究表明外泌體最重要的生物利用價值之一是其作為生物標(biāo)志物在疾病診斷方面的應(yīng)用，和傳統(tǒng)的診斷方法如單純檢測血清和尿液中的分子指標(biāo)相比，外泌體中的生物標(biāo)志物具有很高的特異性和靈敏性。本文對外泌體作為疾病診斷標(biāo)記物以及藥物遞送載體的研究進展進行綜述，旨在為其深度開發(fā)提供參考。

1 外泌體的產(chǎn)生和組成成分

外泌體來源于晚期內(nèi)吞體（也稱多囊泡體，multivesicular bodies，MVB）的囊泡，是細(xì)胞內(nèi)吞泡膜向內(nèi)凹陷形成含有多個小囊泡的多囊泡體，這種多囊泡體與細(xì)胞膜融合，釋放到細(xì)胞外基質(zhì)中的一種直徑約30～100 nm的膜性囊泡［3］。外泌體最早由Johnstone等［4］在研究網(wǎng)織紅細(xì)胞向成熟紅細(xì)胞轉(zhuǎn)變過程中發(fā)現(xiàn)。后來研究發(fā)現(xiàn)，不僅網(wǎng)織紅細(xì)胞能釋放這種小囊泡，幾乎所有類型的活細(xì)胞都能分泌。

外泌體主要由蛋白質(zhì)、脂質(zhì)和核酸（mRNA，miRNA等）組成。外泌體的組成與其細(xì)胞來源有關(guān)，不同細(xì)胞來源的外泌體所含具體成分不盡相同。普遍存在的蛋白包括：胞質(zhì)蛋白，如微管蛋白、三聚體G蛋白等；膜蛋白，如：四跨膜蛋白、溶酶體蛋白（Lamp2b）、熱休克蛋白（hsp70，hsp90）等［5］。此外一些細(xì)胞來源的外泌體中還在其質(zhì)膜上攜帶有MHC I和II類分子［6-7］，如B細(xì)胞、T細(xì)胞、腫瘤細(xì)胞等。另一類是特異性蛋白質(zhì)，只存在于特定細(xì)胞來源的外泌體，如腎癌細(xì)胞源性外泌體富含腎癌特異性抗原G250［8］，人鼻咽癌來源的外泌體含LMP1，研究表明這些蛋白能促進癌細(xì)胞逃避宿主免疫［9］。

外泌體中除了蛋白質(zhì)外，還包含其他多種成分，如脂質(zhì)。目前臨床學(xué)者對外泌體脂質(zhì)的研究仍不充分，但是已經(jīng)證實其主要成分為神經(jīng)鞘磷脂及磷脂酰絲氨酸等。此外，Valadi等［10］首先提出小鼠和人的肥大細(xì)胞衍生出的外泌體中存在RNA，一些類型的RNA（如mRNA和miRNA）可以從外泌體腔內(nèi)被分泌出來，這些mRNA在體外翻譯實驗中能翻譯成蛋白質(zhì)而發(fā)揮作用。此外，有大量的研究集中于生理及病理條件下外泌體中miRNA的變化，以表征機體的生理狀況［11-13］。

2 外泌體的生物學(xué)功能

首先，外泌體參與細(xì)胞間的物質(zhì)運輸和信號傳遞。Ludwig等［14］提出，外泌體可以通過膜融合的方式將內(nèi)容物釋放到靶細(xì)胞中，以參與細(xì)胞間的通訊。如某些細(xì)胞來源的外泌體中含有參與信號通路的蛋白β-catenin、WNT5B以及mRNA、miRNA等，這些內(nèi)含物可被外泌體轉(zhuǎn)運至靶細(xì)胞來調(diào)控靶細(xì)胞的基因表達。Vlassov等［15］通過對肝癌細(xì)胞及其分泌的外泌體中miRNA的檢測，發(fā)現(xiàn)存在于外泌體中的11種miRNA可能靶向TAK1、TAB2基因，以利于腫瘤細(xì)胞的生存。該研究揭示了外泌體分泌的miRNA通過細(xì)胞間通訊從而調(diào)控肝癌的一個重要機制。

其次，外泌體具有免疫調(diào)節(jié)功能。外泌體中含有大量免疫相關(guān)分子，如抗原呈遞分子MHC I和II類分子、熱休克蛋白等。最初，Raposo等［16］發(fā)現(xiàn)由B細(xì)胞分泌的外泌體可以抗原特異性的方式激活CD4+T細(xì)胞，從而發(fā)現(xiàn)了外泌體的免疫學(xué)應(yīng)用價值。后來，經(jīng)多組實驗證實，樹突細(xì)胞、肥大細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞來源的外泌體均可產(chǎn)生抗腫瘤免疫反應(yīng)（見表1）。

另外，外泌體還具有排泄細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)的作用。在Johnstone等［4］的研究中，網(wǎng)織紅細(xì)胞會將不需要的質(zhì)膜蛋白，如轉(zhuǎn)鐵蛋白受體排出細(xì)胞，從而達到清除的目的。而在此過程中，外泌體則作為運出這些廢棄蛋白的載體。隨后有研究表明，細(xì)胞內(nèi)某些不能被降解的物質(zhì)以及一些新陳代謝的產(chǎn)物，可以通過外泌體排出細(xì)胞。

表1 不同細(xì)胞來源的外泌體的免疫調(diào)節(jié)功能Table 1 Immune modulatory functions of exosomes from different cells

續(xù)表1

3 外泌體用作疾病診斷的生物標(biāo)志物

細(xì)胞在正常和病理條件下都能分泌外泌體，外泌體中的核酸和蛋白質(zhì)能夠表征一定的生理病理狀況。目前外泌體的內(nèi)容物已經(jīng)被廣泛作為一種重要的生物標(biāo)志物用于臨床上的疾病診斷。此外，外泌體易于從體液如血液和尿液中分離，這更為其作為診斷候選物提供了便利。

3.1 外泌體中蛋白作為診斷標(biāo)志物

外泌體中含有多種類型的蛋白質(zhì)，包括膜蛋白和胞漿蛋白，這些蛋白在一定程度上可以反映出細(xì)胞的功能和狀況。目前，已發(fā)現(xiàn)多種外泌體蛋白可以作為疾病診斷的潛在標(biāo)志分子，如癌癥、肝病、腎病等。

在中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病的診斷中，已發(fā)現(xiàn)大量的潛在標(biāo)志蛋白分子。Skog等［26］的研究表明表皮生長因子vIII（EGFRvIII）在成膠質(zhì)細(xì)胞瘤患者血清外泌體中的表達量上升。Graner等［27］指出腦癌患者的血清外泌體中含有EGFR、EGFRvIII和TGF-β。另外，在帕金森病中起重要作用的α-synuclein可以在外泌體中被檢測到［28］。因此，外泌體中的EGFRvIII、TGF-β以及α-synuclein可以作為中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病診斷的潛在標(biāo)志分子。

外泌體中富含跨膜蛋白超家族，如CD63。Logozzi等［29］報道過黑色素瘤患者血漿中的CD63+外泌體比正常人高。之后，Yoshioka等［30］通過分析比較不同類型的癌癥患者外泌體中標(biāo)志蛋白的表達量，發(fā)現(xiàn)惡性腫瘤細(xì)胞分泌的外泌體中CD63比正常細(xì)胞的表達量要高，這進一步表明外泌體表面的CD63或可作為癌癥診斷的蛋白標(biāo)志物。此外，Welker等［31］提出，外泌體表面的CD81在慢性C型肝炎中的表達量上升，且可能與炎癥和纖維化有關(guān)，這表明外泌體表面的CD81可以作為慢性C型肝炎診斷和治療的潛在標(biāo)志物。

3.2 外泌體中核酸作為診斷標(biāo)志物

自從Valadi等［10］在2007年報道外泌體中含有RNA后，人們對外泌體中RNA的研究興趣與日俱增，特別是對外泌體的miRNA作為診斷標(biāo)志物的研究。外泌體中的miRNA可以免于RNA酶的降解，從而能在血液中循環(huán)［11，32-33］，為其用作臨床診斷的分子標(biāo)志物奠定了基礎(chǔ)。

外泌體中的miRNA經(jīng)常被用于癌癥診斷標(biāo)志物的研究。Taylor等［11］研究了8種miRNA在卵巢癌組織切片以及血清外泌體中的表達量，與健康人相比發(fā)現(xiàn)其表達量上升，這表明外泌體的miRNA可以作為卵巢癌活體組織切片性能分析的一個參數(shù)。Brase等［12］研究指出，血清外泌體中的miR-141和miR-375與前列腺癌的腫瘤生長有關(guān)，因此，可以將miR-141和miR-375用于前列腺癌的診斷。此外，外泌體中的miR-21與初級食管癌的生長和侵染有關(guān)［13］，因此外泌體中的miR-141、miR-375、miR-21等可以作為癌癥診斷的標(biāo)志分子。

除了外泌體的miRNA，一些研究表明外泌體中的mRNA也可作為潛在的臨床診斷分子［34-35］。研究人員證實了兩種mRNA：PCA-3和TMPRSS2，可以作為診斷前列腺癌的生物標(biāo)志物?？傊?，外泌體的內(nèi)含物作為疾病檢測的標(biāo)志分子，可以監(jiān)控疾病的惡化程度和療效，有望成為多種疾病的診斷標(biāo)志物［36-37］。

4 外泌體在藥物遞送系統(tǒng)中的應(yīng)用

近年來，將外泌體用于疾病治療逐漸成為外泌體應(yīng)用研究的一大熱點。不斷有研究提出將外泌體作為藥物載體用于疾病治療的設(shè)想。如Tan等［38］提出，外泌體可作為納米治療診斷的遞送載體用于基因治療。構(gòu)建一個有效的外泌體藥物遞送系統(tǒng)，需要對其不同的組分進行適當(dāng)?shù)母脑旌托揎棧赃_到預(yù)期的效果。

4.1 用于藥物遞送系統(tǒng)的外泌體的細(xì)胞來源

幾乎所有的活細(xì)胞都能產(chǎn)生外泌體，在構(gòu)建一個有效的外泌體藥物遞送系統(tǒng)時，首先要找到最優(yōu)的供體細(xì)胞類型。供體細(xì)胞產(chǎn)生的外泌體應(yīng)該缺乏免疫原性以避免炎癥反應(yīng)，且這些外泌體在運輸過程中是穩(wěn)定的，以便有足夠的時間遞送藥物。迄今為止，已有許多類型的細(xì)胞被作為外泌體的供體細(xì)胞，其中最為典型的是模型細(xì)胞系HeLa和HEK-293，它們作為外泌體的供體細(xì)胞被應(yīng)用于許多研究中［39-45］，另外，在一些研究中，不同類型的小鼠黑素瘤細(xì)胞系，如B16-F10、B16-BL6等也被用于分離外泌體，如在Takahashi等［46］的研究中。

Yin等［47］研究發(fā)現(xiàn)，未成熟的樹突狀細(xì)胞是外泌體的一種理想供體細(xì)胞。未成熟的樹突狀細(xì)胞特殊的膜表面蛋白組成，使其具有抗炎癥特性，但是由于未成熟樹突狀細(xì)胞產(chǎn)生的外泌體的量不能滿足需要，尚不適于臨床應(yīng)用。而骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（MSC）能產(chǎn)生大量外泌體，在一些研究中被用作外泌體的供體細(xì)胞，如Yeo等［48］進行的研究。然而，由于MSC源性的外泌體有促腫瘤特性［49］，所以在用MSC作為外泌體供體細(xì)胞用于腫瘤治療時需謹(jǐn)慎。

4.2 外泌體可遞送的藥物類型

外泌體可用于裝載多種藥物，已有研究證明，藥物在被外泌體遞送到特定靶組織后呈現(xiàn)出一定的治療效果。作為一種天然的物質(zhì)運輸載體，外泌體已經(jīng)被開發(fā)運用于核酸類藥物及其他一些小分子藥物的靶向遞送。

4.2.1 siRNA 小分子干擾RNA（siRNA）是一種基因治療藥物，但是由于siRNA在循環(huán)系統(tǒng)中會被降解，穩(wěn)定性很低，用外泌體遞送siRNA也許能夠解決藥物被降解的問題。許多研究已經(jīng)證實外泌體能成功遞送siRNA。Wahlgren等［50］的研究表明，體外實驗中源于細(xì)胞和血漿的外泌體可以有效地遞送MAKP1-siRNA到受體外周血單核細(xì)胞，致使體外特定基因沉默；Shtam等［51］用類似的方法遞送RAD51-siRNA和RAD52-siRNA到纖維素肉瘤細(xì)胞來誘導(dǎo)兩個基因沉默，從而抑制該細(xì)胞的生存和增殖。

在Alvarez-Erviti等［52］的研究中，為了提高外泌體的靶向性，經(jīng)過人工改造，使樹突狀細(xì)胞分泌的外泌體上的膜蛋白Lamp2b連接上一個神經(jīng)元特異性RVG多肽，從而使富含siRNA的外泌體能順利地靶向遞送到特定神經(jīng)細(xì)胞，導(dǎo)致GAPDH和老年癡呆癥相關(guān)基因BACE1的表達下調(diào)?？梢?，用外泌體遞送siRNA用于疾病治療是一大可行且十分有效的策略。

4.2.2 miRNA 外泌體自身攜帶miRNA，且利用外泌體遞送小核酸藥物miRNA已有成功的案例。Xin等［53］研究發(fā)現(xiàn)，體外實驗中源于MSC的富含miR-133b的外泌體可以提高神經(jīng)突觸的生長水平，表明MSC源性外泌體可以用于大腦局部缺血的治療；Chen等［54］的研究表明，miR-214可以通過外泌體穿梭到肝星狀細(xì)胞，造成結(jié)締組織生長因子（CCN2）表達的降低，從而抑制肝臟纖維化。

大多數(shù)類型的腫瘤細(xì)胞都以miRNA的異常表達為特征。MSC源性的外泌體中miR-146b高表達，而在多形性膠質(zhì)母細(xì)胞瘤（GBM）的移植瘤模型中，miR-146能抑制腫瘤生長，因此一些研究中將外泌體的藥物遞送作用和miRNA的治療作用結(jié)合起來［55-56］。在另外一些研究中，HEK293細(xì)胞源性的外泌體被用于遞送腫瘤抑制性miRNA——miR-143和let-7，分別用于抑制前列腺癌和乳腺癌［57-58］。

4.2.3 小分子化合物 最近一些研究為裝載小分子藥物進入外泌體的可能性提供了證據(jù)。阿霉素（Dox）是臨床上廣泛應(yīng)用的一種抗腫瘤藥物，體內(nèi)實驗中，Dox被載入外泌體或者外泌體類似納米囊泡中，并用于乳腺癌和結(jié)腸腺癌異植瘤模型動物的治療［59］。利用未成熟樹突狀細(xì)胞衍生的外泌體靶向遞送Dox到腫瘤組織，Dox的治療效果顯著提高，且對心臟等器官的傷害小?？梢?，外泌體不僅能靶向遞送藥物，其對藥物的包裹還能降低藥物的毒副作用。

外泌體還可以包載姜黃素，提高其溶解性和體內(nèi)生物利用度［60］；基于外泌體包裹藥物的穩(wěn)定性和抗炎癥的特點，研究人員將STAT3抑制劑JSI-124（葫蘆素Ⅰ）裝載到外泌體中，并用于治療多形性成膠質(zhì)細(xì)胞瘤（GBM）模型鼠，結(jié)果表明其能有效抑制腫瘤生長［61］；外泌體還可以通過攜帶自殺性mRNA和胞嘧啶脫氨酶來抑制神經(jīng)鞘瘤的生長［62］。

5 結(jié)語與展望

近年來，外泌體作為疾病診斷的生物標(biāo)志物和疾病治療中的藥物遞送系統(tǒng)已成為研究熱點。目前，外泌體中作為疾病診斷的生物標(biāo)志物的物質(zhì)主要是核酸和蛋白，在后續(xù)研究中脂質(zhì)也有望成為疾病診斷的生物標(biāo)志物。由于外泌體中的分子網(wǎng)絡(luò)復(fù)雜，例如同一種核酸或蛋白在不同的疾病中表達量不一樣，因此外泌體作為疾病診斷的生物標(biāo)志物仍處于早期研究階段，要使其應(yīng)用于臨床診斷，還有待進一步的研究和探索。

外泌體負(fù)載藥物的方法主要有電穿孔法和脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法，但是藥物包封率低，另外還可以用基因工程的方法，但是周期長，成本高，且并非所有藥物都能表達。在未來研究中，我們可以通過找到負(fù)載目的藥物（miRNA/siRNA）的天然外泌體，或者運用一些物理學(xué)方法，如增強外泌體膜的疏水性，以達到高效負(fù)載藥物的目的。已有研究證實，30～100 nm的納米粒是可以被有效靶向的，已研制出了許多類型的納米靶向制劑，成功實現(xiàn)了藥物的靶向遞送，但目前外泌體的細(xì)胞來源多樣，靶向性傳遞物質(zhì)的機制尚不明確。因此，需要深入研究增強外泌體靶向性的方法，例如可以利用配體與受體結(jié)合的原理，在外泌體上連接特殊的靶向引導(dǎo)分子，使其靶向受體細(xì)胞；也可以利用仿生學(xué)原理，找到靶向性高的天然來源外泌體?？傊饷隗w作為疾病診斷的生物標(biāo)志物和疾病治療中的藥物遞送系統(tǒng)的研究前景廣闊，如何實現(xiàn)其在臨床上的最大潛在應(yīng)用價值仍需研究者的共同努力。

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Research Progress in Exosomes for Disease Diagnosis and Drug Delivery System

LIU Jiafan， YANG Li， HONG An， WANG Xiaogang
（Biomedicine Institute， Jinan University， Guangzhou 510632， China）

Exosomes are 30-100 nm membrane vesicles of endocytic origin that are secreted by various living cells. Exosomes can be transferred between cells and contain various molecular constitutes closely related to their origin and function， including proteins， lipids and RNAs. It has been shown that exosomes in the blood of cancer patients are at abnormally high levels and contain cancer biomarkers， suggesting their potential as biomarkers for diagnosis. In addition， as natural carriers for material transportation， exosomes have been used as drug delivery systems for treating tumors and Alzheimer's disease. In this article， the research progress in exosome as biomarker and drug delivery system were reviewed.

exosomes； biomarker； drug delivery system

Q26

A

1001-5094（2015）09-0676-07

接受日期：2015-07-08

*通訊作者：王曉剛，教授；

研究方向：非編碼RNA生物學(xué)；

Tel：020-85221983；E-mail：txg_wang@jnu.edu.cn