西藏絨山羊GH基因的PCR-RFLP檢測(cè)及其與生產(chǎn)性狀的相關(guān)性

吳玉江，益西多吉，富國(guó)文，王紹卿，滕曉紅，楊鳳婷，樊月圓

（1.西藏自治區(qū)農(nóng)牧科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所，拉薩 850009；2.云南農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，昆明 650201）

西藏絨山羊GH基因的PCR-RFLP檢測(cè)及其與生產(chǎn)性狀的相關(guān)性

吳玉江1，益西多吉1，富國(guó)文2，王紹卿2，滕曉紅2，楊鳳婷2，樊月圓2

（1.西藏自治區(qū)農(nóng)牧科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所，拉薩 850009；2.云南農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，昆明 650201）

利用PCR-RFLP標(biāo)記技術(shù)及序列分析，對(duì)245只西藏絨山羊的GH基因的多態(tài)性位點(diǎn)進(jìn)行檢測(cè)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)：GH基因在西藏絨山羊群體中存在HaeⅢ內(nèi)切酶位點(diǎn)多態(tài)性，存在AA、AB和BB三種基因型，基因型頻率分別為0.012、0.610和0.378，PIC=0.339，屬于中度多態(tài)，經(jīng)χ2適應(yīng)性檢驗(yàn)，該位點(diǎn)處于Hardy-Weinberg不平衡狀態(tài)（P＜0.05）。AB基因型和BB基因型與生產(chǎn)性狀相關(guān)性分析結(jié)果表明，基因型和性別的互作，對(duì)研究群體的十字部高、毛長(zhǎng)和產(chǎn)絨量有極顯著的影響（P＜0.01）。由此可見，GH基因的HaeⅢ內(nèi)切酶位點(diǎn)可能是影響西藏絨山羊生產(chǎn)性狀的主效QTL或與之緊密連鎖，可作為西藏絨山羊生產(chǎn)性狀的輔助選擇標(biāo)記。

西藏絨山羊；GH基因；PCR-RFLP；生產(chǎn)性狀

西藏絨山羊廣泛分布在西藏西北部廣袤的羌塘草原。阿里地區(qū)日土縣、那曲地區(qū)尼瑪縣的白絨山羊是西藏絨山羊的典型代表［1］，其突出特點(diǎn)是產(chǎn)絨性能良好、品質(zhì)優(yōu)良，絨纖維細(xì)度保持在14 μm左右，是山羊絨中的精品［2］。隨著青藏鐵路的全線通車和農(nóng)牧民商品意識(shí)的不斷增強(qiáng)、國(guó)內(nèi)國(guó)際市場(chǎng)對(duì)羊絨需求量的不斷增加，絨山羊產(chǎn)業(yè)越來越成為西藏地區(qū)畜牧特色優(yōu)勢(shì)產(chǎn)業(yè)的一大優(yōu)勢(shì)和發(fā)展重點(diǎn)。

為了保護(hù)西藏絨山羊品種的資源優(yōu)勢(shì)，使該品種優(yōu)良的遺傳潛力得到充分發(fā)揮，本研究以生長(zhǎng)激素（growth hormone，GH）基因?yàn)楹蜻x基因，利用PCR-RFLP技術(shù)研究了西藏絨山羊遺傳多態(tài)性，通過分析GH基因多態(tài)性與生產(chǎn)性狀關(guān)系，旨在獲取相應(yīng)的分子遺傳學(xué)信息，為西藏絨山羊的選育提高提供科學(xué)依據(jù)。

1　材料與方法

1.1材料

1.1.1西藏絨山羊耳樣采集采集西藏自治區(qū)曲尼帕試驗(yàn)站254只周歲西藏絨山羊耳組織樣本，公母各半，放入無水乙醇于－20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.1.2體尺及產(chǎn)絨指標(biāo) 包括產(chǎn)絨前體重、體高、體長(zhǎng)、胸圍、胸深、十字部高、絨長(zhǎng)、毛長(zhǎng)以及產(chǎn)絨量，數(shù)據(jù)由曲尼帕試驗(yàn)站提供。

1.2方法

1.2.1西藏絨山羊耳組織樣DNA的提取 取15 mg左右的西藏絨山羊耳組織，讓其表面酒精揮發(fā)后，用剪刀盡可能地將其剪成碎末，轉(zhuǎn)入1.5 mL離心管中。參照DNA提取試劑盒（TaKaRa）說明書進(jìn)行提取。提取得到的基因組DNA通過核酸蛋白分析儀測(cè)定其濃度。1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)其完整性。

1.2.2PCR擴(kuò)增引物序列：5'-GACCCAGTTCACCAGACGA-3'，5'-GGAGAAGCAGAAGGCAACC-3'。引物由上海生物工程有限公司合成。

PCR反應(yīng)體系：25 μL，包括Premix Taq 12.5 μL，上、下游引物各為0.5 μL，50 ng/μL基因組DNA為1.0 μL，ddH2O補(bǔ)足至25μL。PCR擴(kuò)增程序：95℃，5min；30個(gè)循環(huán)（94℃30s，59.7℃40 s，72℃1 min）；72℃延伸10 min，4℃保存。

1.2.3PCR產(chǎn)物酶切消化反應(yīng)與電泳 PCR產(chǎn)物酶切消化反應(yīng)體系：限制性內(nèi)切酶HaeⅢ2 μL，10×M Buffer 4 μL，PCR產(chǎn)物8 μL，消化總體積14 μL。37℃孵育4 h。1%瓊脂糖凝膠電泳對(duì)酶切效果進(jìn)行檢測(cè)。

1.2.4統(tǒng)計(jì)分析對(duì)不同基因型進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，計(jì)算基因頻率，并進(jìn)行χ2檢驗(yàn)。計(jì)算純合度（Ho）、雜合度（He）、多態(tài)信息含量（PIC）、有效等位基因數(shù)（Ne）。

對(duì)不同基因型頻率進(jìn)行統(tǒng)計(jì)。運(yùn)用SPSS13.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，根據(jù)最小二乘線性模型，分析GH基因的年齡因素和基因型因素的交互效應(yīng)，采用了以下固定模型：Yijl=μ+αi+βj+eijl。式中：Yijl為個(gè)體表型記錄，μ為試驗(yàn)全部觀測(cè)值總體平均值，αi為性別效應(yīng)，βj為基因型效應(yīng)，eijl為隨機(jī)誤差。

2　結(jié)果與分析

2.1GH基因的PCR產(chǎn)物檢測(cè)結(jié)果

隨機(jī)選取6個(gè)管的PCR產(chǎn)物在1.0%瓊脂糖凝膠中電泳后用凝膠成像系統(tǒng)成像，PCR產(chǎn)物片段大小為768 bp（如圖1）。條帶清晰，無拖尾，無非特異性擴(kuò)增。其擴(kuò)增結(jié)果穩(wěn)定，能夠完全重復(fù)。

圖1　西藏絨山羊GH基因的PCR產(chǎn)物檢測(cè)注：M.DL1000。

2.2酶切結(jié)果

PCR產(chǎn)物經(jīng)HaeⅢ酶切后存在3個(gè)酶切位點(diǎn)。在西藏絨山羊群體中存在3種基因型：AA（477/195/93 bp）、AB（477/366/195/93 bp）、BB（366/195/93 bp），如圖2所示。

圖2　西藏絨山羊GH基因PCR產(chǎn)物的HaeⅢ酶切電泳圖譜注：M.DL1000。

2.3GH基因的多態(tài)性指標(biāo)分析

根據(jù)電泳結(jié)果統(tǒng)計(jì)計(jì)算了GH基因座的基因頻率和基因型頻率以及多態(tài)信息含量等。統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示，AB（n=155）基因型為優(yōu)勢(shì)基因型，頻率為0.610；BB（n=96）基因型次之；AA（n=3）所占比例最小，頻率僅0.012。等位基因B為優(yōu)勢(shì)等位基因，其值為0.683。PIC=0.339，屬于中度多態(tài)，χ2檢驗(yàn)顯示，該位點(diǎn)不符合Hardy-Weinberg平衡定律。

2.4西藏絨山羊GH基因多態(tài)性與生產(chǎn)性狀的相關(guān)性分析

考慮到基因型AA在群體中所占比例僅1.2%，無統(tǒng)計(jì)價(jià)值，本研究只將基因型AB和基因型BB與生產(chǎn)性狀作了相關(guān)性分析。結(jié)果表明：同一性別的不同基因型對(duì)生產(chǎn)性狀沒有產(chǎn)生顯著影響（P＞0.05）。而基因型和性別的互作，表現(xiàn)為：體重、體高、體長(zhǎng)、胸圍、胸深等生長(zhǎng)性狀指標(biāo)對(duì)研究群體無顯著影響（P＞0.05），而十字部高、毛長(zhǎng)和產(chǎn)絨量3項(xiàng)指標(biāo)對(duì)研究群體有極顯著的影響（P＜0.01）（表1）。由此可見，GH基因不僅對(duì)動(dòng)物的生長(zhǎng)有顯著影響，而且該基因的變異也對(duì)絨山羊的部分產(chǎn)絨指標(biāo)產(chǎn)生顯著影響，其影響機(jī)制有待于進(jìn)一步深入研究。

表1　西藏絨山羊GH基因多態(tài)性與生產(chǎn)性狀的關(guān)聯(lián)性分析

4　討論

GH是由動(dòng)物腦垂體前葉分泌的一種蛋白類激素，它通過調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)合成、脂肪和糖的代謝，在機(jī)體的生長(zhǎng)發(fā)育、繁殖等方面發(fā)揮重要作用［3-4］。山羊的GH基因長(zhǎng)為2 544 bp，由5個(gè)外顯子和4個(gè)內(nèi)含子構(gòu)成，定位于19q22［5］。Malveiro等［6］對(duì)GH基因各外顯子的基因型與產(chǎn)奶量、脂肪和蛋白質(zhì)含量間的關(guān)系進(jìn)行了分析，結(jié)果表明GH基因外顯子4的基因型F/F個(gè)體、外顯子5的基因型A/A個(gè)體對(duì)奶山羊的產(chǎn)奶量有顯著影響；紀(jì)英卓［7］在對(duì)GH基因的多態(tài)性與經(jīng)濟(jì)性能的相關(guān)性進(jìn)行分析中，發(fā)現(xiàn)GH基因的HaeⅢ內(nèi)切酶位點(diǎn)存在2種基因型AA和AB，各基因型與產(chǎn)羔性狀無相關(guān)性，而與產(chǎn)絨量、絨長(zhǎng)及體重間存在一定的相關(guān)性，在產(chǎn)絨量和絨長(zhǎng)指標(biāo)上，AB基因型個(gè)體均高于AA基因型個(gè)體；在體重指標(biāo)上，AA基因型個(gè)體顯著高于AB基因型個(gè)體。李美玉等［8］以魯北白山羊、引進(jìn)波爾山羊、純繁波爾山羊、魯北白山羊×波爾山羊的雜交一代、回交一代5個(gè)不同山羊?yàn)檠芯坎牧?，?duì)山羊生長(zhǎng)激素基因的第1內(nèi)含子到第2內(nèi)含子進(jìn)行PCR-RFLP分析，擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)限制性內(nèi)切酶HaeⅢ、HhaI、TaqI等10種內(nèi)切酶酶切只有HaeⅢ在5個(gè)種群中均具有多態(tài)性，并表現(xiàn)為兩種基因型（AA和AB），而其它的內(nèi)切酶均未發(fā)現(xiàn)多態(tài)性位點(diǎn)；谷朝勇［9］對(duì)濟(jì)寧青山羊GH基因HaeⅢ酶切位點(diǎn)與生產(chǎn)性能的關(guān)聯(lián)分析研究顯示，AA基因型對(duì)3、12月齡體高及出生重、斷奶重、胴體重、后軀肉重均有顯著影響。哈志俊等［10］對(duì)GH基因進(jìn)行檢測(cè)，僅在第4外顯子檢測(cè)到多態(tài)性。

本試驗(yàn)采用PCR-RFLP技術(shù)，對(duì)西藏絨山羊GH基因HaeⅢ內(nèi)切酶進(jìn)行酶切，酶切片段包括GH基因的第1內(nèi)含子到第2內(nèi)含子，酶切結(jié)果表現(xiàn)為3種基因型（AA、AB和BB），遺傳學(xué)指標(biāo)顯示，AB基因型為優(yōu)勢(shì)基因型，B等位基因?yàn)閮?yōu)勢(shì)等位基因，該研究結(jié)果與紀(jì)英卓［7］及李美玉等［8］的研究結(jié)果不同，在西藏絨山羊群體中首次發(fā)現(xiàn)了BB基因型，同時(shí)AA基因型在西藏絨山羊群體中的變異頻率很低（=1.2%），由于AA基因型所占比例較小，本研究只進(jìn)行了AB基因型和BB基因型與西藏絨山羊生產(chǎn)性狀的相關(guān)性分析，研究結(jié)果顯示，年齡和性別的互作，導(dǎo)致該位點(diǎn)對(duì)西藏絨山羊的十字部高、毛長(zhǎng)和產(chǎn)絨量指標(biāo)有極顯著的影響（P＜0.01）。究其原因可能與西藏絨山羊品種本身有關(guān)，同時(shí)西藏的高原氣候以及人工選育的強(qiáng)度可能也是造成這個(gè)差異的原因之一。

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Analysis on the Polymorphism of GH Gene and Its Association with Production Traits in Tibetan Cashmere Goats

Wu Yujiang1，Yixi Duoji1，F(xiàn)an Yueyuan2，et al
（1.Institute ofAnimal Sciences，Tibet AcademyofAgricultural Sciences，Lhasa 850009，China；2.College ofAnimal Science&Technology，Yunnan Agriculture University，Kunming 650201，China）

PCR-RFLP and sequence analysis technology were applied to analyze the polymorphic loci of GH gene in 245 Tibetan Cashmere Goats.The results showed that the restriction endonuclease HaeIII polymorphism was found in GH gene in Tibet Cashmere Goat populations with three genotypes of AA，AB and BB，the genotype frequencies were 0.012，0.610 and 0.378 respectively，the PIC=0.339，which was in a moderate polymorphism.Chi-square test showed that the locus was not in Hardy-Weinberg equilibrium（P＜0.05）.Correlation analysis between AB，BB genotypes and the production traits showed that there were some interactions between genotype and sex，the interaction had significant effects on height at hip cross，wool length and cashmere yield（P＜0.01）.These findings demonstrated that Hae III restriction endonuclease sites of GH gene might be the main effect QTLofproduction traits，and could be a candidate as a marker for the production ofTibet Cashmere Goat.

Tibetan Cashmere Goat；GH gene；PCR-RFLP；production traits

S827.2

A

2095-3887（2015）01-0015-03

10.3969/j.issn.2095-3887.2015.01.005

2014-12-23

現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系建設(shè)專項(xiàng)資金資助（CARS-40-31）；西藏科技廳畜禽育種項(xiàng)目資助；家養(yǎng)動(dòng)物種質(zhì)資源平臺(tái)資助

吳玉江（1979-），男，碩士。

樊月圓（1979-），女，博士，主要從事動(dòng)物遺傳育種與繁殖研究。