甘南歐拉羊GHR基因第10外顯子SSCP多態(tài)性與生長性狀關(guān)聯(lián)研究

楊樹猛，卡召加，王蘭英，穆峰海，牟永娟，普華才讓

（1.甘南州畜牧科學(xué)研究所，甘肅合作747000；2.甘南州河曲馬場；3.甘南州草原工作站；4.甘南州畜牧學(xué)校）

甘南歐拉羊GHR基因第10外顯子SSCP多態(tài)性與生長性狀關(guān)聯(lián)研究

楊樹猛1，卡召加2，王蘭英3，穆峰海4，牟永娟1，普華才讓1

（1.甘南州畜牧科學(xué)研究所，甘肅合作747000；2.甘南州河曲馬場；3.甘南州草原工作站；4.甘南州畜牧學(xué)校）

采用PCR-SSCP技術(shù)對120只甘南歐拉羊GHR基因的部分序列進(jìn)行了多態(tài)性研究，分析了該基因與藏羊生長性狀的關(guān)聯(lián)性。結(jié)果表明：歐拉羊GHR基因外顯子10存在2個(gè)等位基因和3種基因型。在該基因座上，歐拉羊呈Hardy-Weinberg平衡狀態(tài)。3種基因型與甘南歐拉羊部分生長性狀的最小二乘法分析表明，GHR基因外顯子10不同基因型個(gè)體間3月齡體高差異顯著（P＜0.05或P＜0.01），6月齡AA型個(gè)體體重顯著高于AB型和BB型（P＜0.05），12月齡AA型個(gè)體體高和體重均顯著或極顯著高于AB型和BB型（P＜0.05或P＜0.01）。初步推斷藏羊GHR基因第10外顯子基因座的A為優(yōu)勢等位基因，提示該位點(diǎn)可作為歐拉羊標(biāo)記輔助選擇的遺傳標(biāo)記之一。

歐拉羊；GHR基因；多態(tài)性；性狀標(biāo)記；PCR-SSCP

生長激素受體（GHR）是生長激素受體蛋白，是細(xì)胞因子/造血因子受體超家族成員之一。生長激素必須與其受體蛋白結(jié)合激活一系列的生化反應(yīng)，最終才能產(chǎn)生生物學(xué)效應(yīng)。研究表明，生長激素受體基因的突變會影響生物個(gè)體的生長發(fā)育，如人的LTD矮小癥、性連鎖矮小雞等均是GHR基因突變所致［1-2］。Feng等［3］研究表明，母雞GHR的2個(gè)等位基因與幼齡期體重和產(chǎn)蛋量相關(guān)，隨后研究又發(fā)現(xiàn)HindIII-RFLP多態(tài)與肉用仔雞的體重相關(guān)，含有HindIII+等位基因的肉雞130日齡體重大。Hale等［4］研究發(fā)現(xiàn)，在牛GHR基因啟動區(qū)（TG）n存在微衛(wèi)星多態(tài)，（TG）16-20純合基因型的個(gè)體斷奶重和胴體重都高。Adams等最早對綿羊GHR基因進(jìn)行了cDNA克隆研究，表明綿羊GHR是由634個(gè)氨基酸組成的多肽，成熟的GHR由242個(gè)氨基酸組成的胞外區(qū)、24個(gè)氨基酸組成的跨膜區(qū)和350個(gè)氨基酸組成的胞內(nèi)區(qū)組成；在GHR基因核苷酸及其相應(yīng)的氨基酸序列比較分析中，綿羊與人、兔子、牛等哺乳動物間具有較高的保守性［5］。

歐拉羊是藏羊的一個(gè)類型，主要分布在甘肅省甘南州瑪曲縣歐拉地區(qū)，以境內(nèi)的歐拉山而得名。歐拉羊產(chǎn)肉性能優(yōu)良，對高海拔、低氣壓、少氧量有高度的適應(yīng)能力，現(xiàn)存欄約18萬只。但是，近年來由于缺乏科學(xué)的選配、選留，近親繁殖嚴(yán)重，飼養(yǎng)管理粗放，交配年齡難以控制等因素影響，歐拉羊生產(chǎn)性能明顯下降，品種退化嚴(yán)重，品種質(zhì)量下降［6］。因此，利用傳統(tǒng)的育種技術(shù)結(jié)合現(xiàn)代分子標(biāo)記技術(shù)開展歐拉羊選育，是遏制歐拉羊退化的有效手段。但有關(guān)歐拉羊GHR的多態(tài)性研究較少，本研究將以GHR基因?yàn)楹蜻x基因，對第10外顯子多態(tài)性進(jìn)行檢測，并分析基因型與生長性狀的關(guān)系，以期發(fā)現(xiàn)與生產(chǎn)性狀相關(guān)的分子標(biāo)記，為歐拉羊GHR基因的分子生物學(xué)研究及分子育種奠定理論基礎(chǔ)。

1材料與方法

1.1試驗(yàn)材料

在甘肅省甘南州瑪曲縣隨機(jī)采集成年歐拉羊血樣120頭份，每只羊頸靜脈采血5 mL，用ACD抗凝后帶回實(shí)驗(yàn)室，置于-70℃低溫保存待測。同時(shí)，對采血?dú)W拉羊只收集3月齡、6月齡、12月齡的體尺指標(biāo)（體長、體高、胸圍）和體重指標(biāo)。

1.2試驗(yàn)方法

1.2.1基因組DNA的提取 采用常規(guī)的酚-氯仿抽提法從全血中提取歐拉羊基因組DNA［7］。每100 μL全血中提取的DNA用50 μL的TE緩沖液溶解，4℃保存。

1.2.2引物設(shè)計(jì)與合成參照牛GHR基因序列（Gen-Bank，AY292283），用Primer 5.0軟件設(shè)計(jì)一對引物，預(yù)期擴(kuò)增長度為218 bp。上游引物：5'-GCCAAAACAATAAGACTGGGAACC-3'，下游引物：5'-GGCTGTAGTGGTAAGGCTTTCTGTG-3'，由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。

1.2.3PCR-SSCP反應(yīng)條件 PCR反應(yīng)體系為20 μL。其中10×buffer 2.0 μL，dNTPs 1.6 μL（2.5 mmoL/L），上、下游引物各0.4 μL（10 mmoL/L），Taq酶0.5 μL（5 U/μL），模板1.0 μL，ddH2O13.1 μL。反應(yīng)程序：95℃預(yù)變性4 min，95℃45 s，60℃30 s，72℃30 s，34個(gè)循環(huán)；72℃再延伸10 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠檢測后置于4℃冷藏保存供SSCP分析。

擴(kuò)增產(chǎn)物的SSCP分析，3 μLPCR產(chǎn)物和7 μL變性劑混勻，98℃變性10 min，冰浴10 min。變性后PCR產(chǎn)物以10%聚丙烯酰胺凝膠（丙烯酰胺:甲叉雙丙烯酰胺= 29:1）常溫電泳過夜，銀染顯帶。

1.2.4PCR產(chǎn)物回收、測序?qū)⒉煌蛐偷募兒献觽€(gè)體的PCR產(chǎn)物回收純化（天為時(shí)代回收試劑盒），純化的DNA片段與pGEM-Teasy載體（Promega公司）在T4DNA連接酶（Promega公司）的作用下4℃冰箱中連接12 h，取2.5 μL連接液進(jìn)行轉(zhuǎn)化，培養(yǎng)12～16 h，挑取白斑，搖菌4 h，取菌液做PCR，檢測克隆效果后送上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司測序。

1.3統(tǒng)計(jì)方法

1.3.1計(jì)算基因型頻率和基因頻率，進(jìn)行群體平衡性檢驗(yàn) 某基因位點(diǎn)的Hardy-Weinberg平衡性檢測采用皮爾遜χ2統(tǒng)計(jì)量，其公式為：

其中，m為某一遺傳位點(diǎn)基因型應(yīng)有個(gè)數(shù)；i為基因型序號；fi代表第i個(gè)基因型的實(shí)際個(gè)體數(shù)量；n為樣本數(shù)量；pi代表第i個(gè)基因型的理論頻率。

1.3.2基因多態(tài)性與甘南歐拉羊生長發(fā)育性狀的關(guān)聯(lián)分析 在數(shù)據(jù)處理中，根據(jù)影響生長發(fā)育性狀的因素不同，考慮到年齡和性別效應(yīng)以及遺傳效應(yīng)，分析時(shí)采用了以下固定模型：

其中：yijm為個(gè)體表型記錄；Ai為年齡效應(yīng)；Sj為性別效應(yīng)；Mm為標(biāo)記基因型效應(yīng)；eijm為隨機(jī)誤差。采用SPSS 18.0對數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，并用最小二乘法擬合線性模型，對各標(biāo)記基因型間生長發(fā)育指標(biāo)進(jìn)行差異顯著性檢驗(yàn)。

2　結(jié)果與分析

2.1PCR-SSCP檢測

GHR基因外顯子10的PCR-SSCP分析表明，該位點(diǎn)存在3種基因型，即AA，AB，BB，由一對等位基因A和B控制。將兩個(gè)純合基因型個(gè)體的PCR產(chǎn)物進(jìn)行純化后送上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司測序，結(jié)果發(fā)現(xiàn)AA型與BB型相比，在擴(kuò)增片段發(fā)現(xiàn)一個(gè)A轉(zhuǎn)換G的單堿基突變。其電泳結(jié)果見圖1。

圖1　甘南歐拉羊GHR基因外顯子10的PCR-SSCP圖譜

2.2基因座的遺傳結(jié)構(gòu)分析

由表1可知，在所檢測的歐拉羊群體中發(fā)現(xiàn)AA、AB和BB3種基因型，其中以AB為優(yōu)勢基因型，A為優(yōu)勢基因。χ2檢驗(yàn)結(jié)果顯示，在該基因座上，甘南歐拉羊群體點(diǎn)上處于Hardy-Weinberg平衡狀態(tài)（P＞0.05）。基因雜合度表示群體在某座位雜合子的比例。位點(diǎn)平均雜合度近似反映遺傳結(jié)構(gòu)變異程度高低，雜合度越大變異越大，對環(huán)境適應(yīng)能力越強(qiáng)。甘南歐拉羊GHR基因的雜合度達(dá)0.474 7（見表1），所以甘南歐拉羊群體的遺傳多樣性較高。平均多態(tài)信息含量（PIC）是衡量基因片段多態(tài)性的理想指標(biāo)，當(dāng)PIC＞0.5時(shí)，該座位為高度多態(tài)性座位；當(dāng)0.25＜PIC＜0.5時(shí)，該座位為中度多態(tài)性座位；當(dāng)PIC＜0.25時(shí)，該座位為低度多態(tài)性座位。甘南歐拉羊群體的GHR基因的PIC=0.362 0，呈現(xiàn)中度多態(tài)性。

表1　甘南歐拉羊群體GHR基因第10外顯子基因座的遺傳多樣性

2.3歐拉羊GHR基因外顯子10多態(tài)性與生長發(fā)育性狀關(guān)聯(lián)

由表2可知，對GHR基因研究發(fā)現(xiàn)，3月齡甘南歐拉羊AB基因型的體高顯著高于AA型（P＜0.05），極顯著高于BB型（P＜0.01）；AA基因型的胸圍顯著高于AB型和BB型（P＜0.05）。6月齡甘南歐拉羊AA基因型的體重顯著高于AB型和BB型（P＜0.05）。12月齡甘南歐拉羊AA基因型的體高顯著高于BB型（P＜0.05）和AB型（P＜0.05），體重極顯著高于AB型（P＜0.01）和BB型（P＜0.01）。其他指標(biāo)在不同基因型間均沒有顯著性差異（P＞0.05）。

表2　不同基因型對歐拉羊生長發(fā)育性狀的影響（Mean±SE）

3　討論

研究影響生長性狀的基因?qū)ξ覈胤骄d羊品種向肉用方向培育具有重要意義。歐拉羊是甘南藏羊品種中的一個(gè)優(yōu)良地方類群，有較好的肉用性能，深受農(nóng)戶的歡迎。生長激素受體由Leung（1987）首次從兔肝臟組織中提取純化獲得，后又根據(jù)其氨基酸序列從兔肝臟cDNA文庫中克隆出GHR基因的cDNA序列，此后人們相繼克隆出人、小鼠、大鼠、綿羊、牛、雞等20多種動物的cDNA序列［8］。

許多研究表明，GHR基因可以作為影響綿羊生長性狀的候選基因。目前已有很多關(guān)于GHR基因多態(tài)性與生產(chǎn)及產(chǎn)奶性狀的相關(guān)研究，并發(fā)現(xiàn)了一些對生產(chǎn)及產(chǎn)奶性狀有影響的多態(tài)位點(diǎn)。Ge等［9］在牛第10外顯子內(nèi)發(fā)現(xiàn)了4個(gè)SNPs，分別位于76 bp（T/C）、200 bp（G/A）、229 bp（T/C）和257 bp（A/G）處，其中200 bp和257 bp處的SNPS引起了氨基酸的替代，另外兩個(gè)發(fā)生無義突變。Curi等［10］發(fā)現(xiàn)S等位基因與L等位基因的雜合型具有較高的日增重和體重（P＜0.05）。Hale等［11］研究了6個(gè)家系安格斯牛GHR基因啟動區(qū)（TG）n微衛(wèi)星多態(tài)與生產(chǎn)性能的關(guān)系，發(fā)現(xiàn)純合基因型對安格斯牛的斷奶重和屠體重有明顯影響。秦巧梅等［12］利用PCR-SSCP技術(shù)對南陽牛、利木贊牛、蓋洛威牛的生長激素受體基因的外顯子10部分序列研究發(fā)現(xiàn)，3個(gè)品種中共存在6種基因型，其中利木贊牛和蓋洛威牛表現(xiàn)為中度多態(tài)，而南陽牛表現(xiàn)高度多態(tài)，發(fā)現(xiàn)的5處多態(tài)位點(diǎn)分別與不同年齡牛的生長性狀有一定的相關(guān)性。趙高鋒等［13］研究了秦川牛GHR基因第10外顯子多態(tài)性，發(fā)現(xiàn)了A、B、C 3個(gè)等位基因，測序發(fā)現(xiàn)在該位點(diǎn)存在2個(gè)突變位點(diǎn)，各基因型與生長性狀的關(guān)系分析表明，AB基因型效應(yīng)在生長性狀上高于其他基因型，并認(rèn)為該位點(diǎn)可能成為秦川牛生長性狀的候選位點(diǎn)。張春香等［14］研究南江黃羊和波爾山羊群體，發(fā)現(xiàn)GHR基因5′調(diào)控區(qū)存在多態(tài)，多態(tài)位點(diǎn)在南江黃羊和波爾山羊群體中對初生重影響不顯著（P＞0.05），對周歲體重有顯著影響，說明該多態(tài)性與山羊的生長速度有關(guān)。本研究發(fā)現(xiàn)，AA型個(gè)體在各項(xiàng)指標(biāo)群體均值上均高于AB型個(gè)體和BB型個(gè)體，提示A等位基因有利于生長發(fā)育，而B基因則有可能是不利于生長發(fā)育的基因。A、B基因頻率較高（0.612 5、0.318 5）可能正是長期進(jìn)化的結(jié)果。

生長性狀是一個(gè)數(shù)量性狀，受多個(gè)基因控制，單個(gè)基因作用較小。從本試驗(yàn)結(jié)果看，具有顯著性差異的生長指標(biāo)間AA型個(gè)體雖然在各項(xiàng)指標(biāo)的群體均值上都高于其他型個(gè)體，但是差異達(dá)顯著水平指標(biāo)的基因型群體較少，說明GHR基因的作用比較輕微。提示人們在進(jìn)行育種工作時(shí)，應(yīng)結(jié)合多個(gè)基因位點(diǎn)，才能達(dá)到有效選育的目的。

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過刊征訂

1.《中國草食動物》雜志1999年（1～6期）21元，2000～2002年（1～6期）27元，2003年（2～6期）33元，2004～2008年（1～6期）39元，2009、2010、2011、2012、2013年（1～6期）48元（均含掛號郵資）；

2.有2002、2003、2004、2005、2006和2007年養(yǎng)羊?qū)］嫞òㄆ贩N、遺傳、繁育、營養(yǎng)、市場等內(nèi)容），價(jià)格分別為31、34、26、58、38、28元，含掛號郵資，數(shù)量有限，欲購從速；

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《中國草食動物科學(xué)》雜志社

Study on the Association of Single Nucleotide Polymorphism at Exon10 of GHR Gene with Growth Traits in Oula Sheep

YangShumeng1，Ka Zhaojia2，Mu Yunjuan1，et al
（1.Institute ofAnimal Science ofGannan Tibetan Autonomous State，Hezuo747000，Gansu，China；2.Hequ Horse Pasture ofGannan Tibetan Autonomous State）

The polymorphism of growth hormone receptor（GHR）gene sequence of exon 10 and its correlation with growth traits were investigated in 120 individuals from Gannan Oula sheep with PCR-SSCP.The results showed that there were twoalleles and three genotypes in the locus of GHR gene exon 10.They were at Hardy-Weinberg equilibrium state in this locus.The least square analysis showed that the different genotype ofGHR exon 10 had a significant effect on partial traits ofgrowth includingheart girth，bodyweight（P＜0.05），and the genotype did not affected the bodylength（P＞0.05）.Therefore，the allele Amaybe a dominant allele at the exon 10 ofOula sheep GHR gene.These results implythat the mutation could be used as the molecular genetic marker for Oula sheep breeding.

Oula sheep；GHR gene；PCR-SSCP；polymorphism；genetic marker

S826.2

A

2095-3887（2015）01-0001-04

10.3969/j.issn.2095-3887.2015.01.001

2014-10-16

甘肅省科技支撐計(jì)劃項(xiàng)目“歐拉羊優(yōu)質(zhì)種羊選育集成技術(shù)研究與制種供種示范”

楊樹猛（1976－），男，高級畜牧師。

牟永娟（1980-），女，高級獸醫(yī)師。