中國美利奴羊（新疆型）KRT27基因的多態(tài)性及其與毛細度性狀關(guān)聯(lián)分析

石曉雷，馬依拉·吐爾遜，劉春潔，米亞沙熱·迪里木熱提，田月珍，詹振宏，艾買提·買買提，黃錫霞，田可川

（1.新疆農(nóng)業(yè)大學動物科學學院，烏魯木齊 830052；2.新疆畜牧科學院畜牧研究所，烏魯木齊 830000）

遺傳育種

中國美利奴羊（新疆型）KRT27基因的多態(tài)性及其與毛細度性狀關(guān)聯(lián)分析

石曉雷1，馬依拉·吐爾遜1，劉春潔1，米亞沙熱·迪里木熱提1，田月珍1，詹振宏1，艾買提·買買提1，黃錫霞1，田可川2

（1.新疆農(nóng)業(yè)大學動物科學學院，烏魯木齊 830052；2.新疆畜牧科學院畜牧研究所，烏魯木齊 830000）

實驗通過PCR-SSCP技術(shù),對中國美利奴羊（新疆型）KRT27基因的多態(tài)性進行了檢測，并對不同基因型與中國美利奴羊（新疆型）羊毛細度性狀間的關(guān)聯(lián)性進行了分析。結(jié)果表明:外顯子5的一段長度為122 bp的擴增產(chǎn)物經(jīng)SSCP分析后出現(xiàn)了兩種基因型AA和AB，存在兩種等位基因A和B；AA基因型和AB基因型在中國美利奴羊（新疆型）中的頻率分布分別為0.86和0.14，等位基因A、B的基因頻率分別為0.93和0.07，表明A等位基因為優(yōu)勢等位基因；所研究群體在該位點上處于Hardy-Weinberg平衡狀態(tài)（P>0.05）。不同基因型的個體間羊毛細度性狀沒有顯著差異（P>0.05）。

中國美利奴羊（新疆型)；KRT27基因；多態(tài)性；羊毛細度

中國美利奴羊（新疆型）是以澳洲美利奴公羊與波爾華斯羊、新疆細毛羊通過雜交培育而成，自從1985年育成之后，逐漸成為新疆地區(qū)細毛羊的主要品種［1］。該品種體格大，呈長方型；被毛白色，呈毛叢結(jié)構(gòu)，密度大，細度60～70支，以64～66支為主。利用動物個體表型差異和基因型差異之間的關(guān)聯(lián)性來預測影響動物性狀的主效基因已經(jīng)成為較為重要的現(xiàn)代育種方式之一。KRT是keratin intermediate filament的縮寫形式，又可寫為KRT-IF（角蛋白中間絲蛋白），是角蛋白家族的重要成員，是形成毛發(fā)、角和指甲的主要成分［2］。KRT-IF有I型（酸性）和Ⅱ型（堿性）兩種類型，I型KRT-IF基因含有4～5 kb個堿基對，有6個內(nèi)含子；II型KRT-IF基因含有7～9 kb個堿基對，有8個內(nèi)含子；KRT27基因?qū)儆冖裥突?。Bawden等［3］將帶有標簽的毛角蛋白Ⅱ型中間絲（keratintypeⅡintermediate filament，KIFⅡ）基因?qū)刖d羊，獲得的轉(zhuǎn)基因綿羊羊毛品質(zhì)得到顯著改善，毛纖維具有較高的光澤和顯著的柔韌性。利用原位雜交對其研究表明，I型IFs在綿羊毛囊內(nèi)根鞘表達豐富，Ⅱ型KRT-IF在皮層高效表達，而改變羊毛纖維的微觀結(jié)構(gòu)和宏觀結(jié)構(gòu)，包括增加羊毛的光澤度和降低羊毛的彎曲度及細度［4］。Langbein L等［5］報道在人類毛發(fā)中角蛋白KRT38分布在皮質(zhì)層的皮質(zhì)細胞中，KRT38基因表達的角蛋白是低硫蛋白，它們形成了毛發(fā)纖維的微原纖維成分。

近年來國內(nèi)外對綿、山羊KRT基因的研究主要集中在基因克隆和表達方面，Grant W等［6］采用PCR-SSCP技術(shù)研究5'非翻譯區(qū)（UTR）綿羊KRT2.13基因的多態(tài)性，發(fā)現(xiàn)了多個不同類型的突變，并且影響基因表達和羊毛性狀。吳茜［7］構(gòu)建了新吉細毛羊皮膚組織全長cDNA文庫，通過序列表達標簽測序發(fā)現(xiàn)KRT27基因可能影響綿羊毛性能。本研究就是在此基礎(chǔ)上，將KRT27基因作為候選基因，采用PCR-SSCP技術(shù)對中國美利奴羊（新疆型）的KRT27基因多態(tài)性進行了檢測，并對不同基因型與中國美利奴羊（新疆型）的羊毛細度性狀之間的關(guān)聯(lián)性進行了分析，以期探索是否存在與羊毛細度有關(guān)的SNP位點。

1　材料與方法

1.1材料

1.1.1實驗動物與數(shù)據(jù)來源實驗對象為中國美利奴羊（新疆型），由新疆鞏乃斯種羊場提供，共206只，均為成年母羊。靜脈采血3～5 mL，EDTA抗凝冷凍保存、備用。收集并整理在新疆鞏乃斯種羊場2007—2008年的中國美利奴羊（新疆型）羊毛細度鑒定記錄。

1.1.2主要試劑和設備Taq DNA聚合酶、dNTPs、10× PCR Buffer、Marker D2000等均為生工生物公司產(chǎn)品；My Cycler型PCR儀；DYY-6C型電泳儀；Gel Doc 2000型凝膠成像系統(tǒng)等。

1.2方法

1.2.1基因組DNA的提取采用常規(guī)的苯酚/氯仿法制備，所提取的基因組DNA利用瓊脂糖凝膠電泳檢測提取結(jié)果的完整性。用分光光度計測定其濃度值及OD260/OD280值，取濃度大于50 μg/mL，OD260/OD280值在1.8～2.0間的樣品-20℃冷凍備用。并用瓊脂糖凝膠電泳進行完整性檢測，用分光光度計進行濃度和純度檢測。

1.2.2引物設計合成根據(jù)牛的KRT27基因（GenBank登錄號-001075815）外顯子5序列，用Primer 5.0引物設計軟件，設計1對引物，序列為上游引物：5'-GCGGATGTCAGTAGTTTGC-3'；下游引物：5'-TCTCCTCCTCGTGGTTCTT-3'。引物由上海生工生物工程公司合成。

1.2.3PCR反應體系的建立及擴增PCR反應體系：基因組DNA 1 μL，10×PCR buffer 2.5 μL，dNTPs 1.6 μL，上下游引物各1 μL，Taq DNA聚合酶0.5 μL，加滅菌純水至總體積為20 μL。PCR擴增反應條件：95℃預變性3 min；94℃30 s，50.3℃30 s，72℃30 s，共進行35個循環(huán)；最后72℃延伸5 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)2%瓊脂糖凝膠電泳檢測后用于SSCP分析。

1.2.4聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測適量PCR產(chǎn)物經(jīng)變性處理后，通過12%非變性聚丙烯酰胺凝膠在0.5×TBE條件下進行電泳。電壓180 V，電泳14～16 h。電泳結(jié)束后取下凝膠，進行固定、銀染和顯色。觀察分析不同的帶型并用凝膠成像系統(tǒng)進行拍照并保存。

1.3數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

根據(jù)SSCP檢測結(jié)果判定基因型（AA型和AB型）。應用EXCEL軟件分析其基因頻率、基因型頻率和其他遺傳特性。應用SAS軟件分析KRT27不同基因型與中國美利奴羊（新疆型）羊毛細度之間的相關(guān)性。

2　結(jié)果與分析

2.1中國美利奴羊（新疆型）KRT27基因PCR檢測以綿羊基因組DNA為模版進行PCR擴增得到長度為122 bp的特異條帶。從圖1可以看出，PCR擴增結(jié)果與預期擴增片段大小一致，而且沒有非特異性擴增條帶，一致性較好，可以用于多態(tài)性檢測。

圖1　KRT27基因的PCR擴增結(jié)果電泳圖

2.2KRT27基因的SSCP多態(tài)性檢測

將擴增的KRT27基因的PCR產(chǎn)物進行PCR-SSCP分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)該片段在中國美利奴羊（新疆型）群體中存在兩種基因型，分別命名為AA、AB型，見圖2。

圖2　KRT27基因擴增產(chǎn)物的PCR-SSCP電泳圖

2.3KRT27基因在中國美利奴羊（新疆型）的頻率分布

統(tǒng)計結(jié)果如表1所示，在中國美利奴羊（新疆型）品種中檢測到AA和AB兩種基因型，卡方檢驗表明中國美利奴羊（新疆型）群體在該位點上處于Hardy-Weinberg平衡狀態(tài)（P>0.05）。

表1　KRT27基因的基因型頻率和等位基因頻率

處理后的數(shù)據(jù)經(jīng)過分析計算得到KRT27基因片段在樣本含量為206的中國美利奴羊群體中的遺傳特性為：基因純合度為0.87，基因雜合度為0.13，有效等位基因數(shù)為1.15，多態(tài)信息含量為0.122。根據(jù)確定位點多態(tài)性的標準：PIC<0.25，為低度多態(tài)位點；0.250.5，為高度多態(tài)位點。表明本試驗中KRT27基因?qū)儆诘投榷鄳B(tài)位點。

2.4不同基因型與羊毛細度的關(guān)聯(lián)分析

實驗對不同基因型與中國美利奴羊（新疆型）羊毛細度性狀的關(guān)聯(lián)性進行了分析。結(jié)果表明：不同基因型個體細度性狀無顯著差異（P>0.05）。

表2　KRT27基因不同基因型之間差異顯著性檢驗

3　討論

3.1實驗分析方法的探討

PCR-SSCP技術(shù)是已經(jīng)相當成熟的研究基因多態(tài)性的技術(shù)，如果已知基因及其可能的調(diào)控功能，則可以利用該技術(shù)進行基因型和動物經(jīng)濟性狀的關(guān)聯(lián)性分析，從而驗證基因?qū)π誀畹挠绊?，從?cè)面反映基因的調(diào)控機制。本實驗經(jīng)過PCR-SSCP分析，結(jié)果產(chǎn)生兩種帶型，AA和AB，這兩種基因型對中國美利奴羊（新疆型）細度性狀沒有顯著差異（P>0.05），因此，KRT27作為中國美利奴羊（新疆型）羊毛細度性狀的候選基因不合適。本實驗數(shù)據(jù)來自鞏乃斯種羊場，采集的樣本較少、區(qū)域較集中，只能反映所研究群體的遺傳特性，不足以代表中國美利奴羊（新疆型）的群體特性。本實驗在進行PCR的引物設計時用牛的基因序列作為源序列，原因在于NCBI中的GenBank中尚未錄入綿羊的KRT27基因序列，因此選取近緣牛序列中作為引物設計的源序列，在理論上雖然誤差較大，但是是可行的。

3.2有關(guān)研究的探討

目前對KRT基因進行的研究方面，在綿羊上，類型I（KRT1.n）和類型Ⅱ（KRT2.n）已經(jīng)被定位于11號和3號染色體上，這種物理圖譜已經(jīng)通過連鎖分析得到了證實［2］。田月珍［9］的研究結(jié)果顯示，KRT26可以作為羊毛細度性狀的候選基因，且在皮膚組織中的表達上調(diào)，即羊毛細度越細，基因的表達量越低。作為同樣為編碼羊毛纖維的結(jié)構(gòu)蛋白，KAP（keratin-associated proteins，KAPs）和KRT都作為了調(diào)控羊毛細度性狀的候選基因。許漢峰［10］以新疆不同毛品質(zhì)的綿羊為研究基礎(chǔ)，利用相似的技術(shù)對KAP基因進行了遺傳多態(tài)性分析，結(jié)果表明不同基因型在羊毛長度性狀上差異不顯著，但其推斷可能會在羊毛細度上存在差異。國外的研究結(jié)果表明，羊毛品質(zhì)的調(diào)控是在KRTⅠ、Ⅱ共同參與的［11］。因此推斷，KRT基因不是獨立的調(diào)控而是不同的KRT基因共同起調(diào)控作用，甚至也會和其他的某些基因也有相互作用，這方面還有待進一步研究。

3.3下一步的實驗思路

本實驗中發(fā)現(xiàn)的突變基因帶型過少，可能是引物擴增的的片段不全。本實驗的結(jié)果只能說明引物擴增的片段內(nèi)不同基因型在羊毛的細度上沒有顯著差異，但其他基因片段是否存在突變能夠影響羊毛細度，需擴大KRT27基因的檢測范圍。進行多態(tài)性檢測的目的是為了最終找到與羊毛性狀有關(guān)的SNP位點，而不同基因的多態(tài)性與羊毛生產(chǎn)性狀關(guān)聯(lián)性分析在大樣本的情況下才具備可靠性。接下來的進一步工作可以增加樣本數(shù)量，提高關(guān)聯(lián)性分析的可靠性；還可以在確定有顯著關(guān)聯(lián)的基因上進行進一步的測序分析其突變類型?；蛘邔Σ煌贩N相同基因進行對比尋找其基因差異和性狀差異之間的關(guān)聯(lián)。當前生物技術(shù)迅猛發(fā)展，高通量測序技術(shù)使得全基因組測序或者全基因測序成為現(xiàn)實。這樣尋找SNP突變位點更加全面準確，本實驗中的基因型對毛細度影響不顯著，因此沒有進行進一步的測序分析。

4　結(jié)論

KRT27基因中存在AA、AB兩種基因型?；蛐皖l率分別為0.86和0.14；等位基因A、B的基因頻率分別為0.93和0.07。KRT27基因中，基因純合度為0.87，雜合度為0.13，基因的PIC為0.122，屬于低度多態(tài)位點。中國美利奴羊（新疆型）中不同基因型個體羊毛細度性狀沒有顯著差異（P>0.05）。

［1］ 李武臣，宮平，高維明，等.中國美利奴羊（新疆型）毛密品系主要生產(chǎn)性能遺傳力估測［J］.新疆畜牧業(yè)，2009，5：25-26.

［2］ McLaren R J，Rogers G R，Davies K P，et al.Linkage mapping of wool keratin and keratin-associated protein genes in sheep［J］.Mammalian Genome，1997，8：938-940.

［3］ Bawden C S，Sivaprasad A V，Verma P J，et a1.Expression of bacterial cysteine biosynthesis genes in transgenic mice and sheep：toward a new invivo amino acid biosynthesis pathway and improved wool growth［J］. Transgenic Research，1995，4（2）：87-104.

［4］Bawden C S，McLaughlan C，Nesei A，et al.A unique type I keratin intermediate filament gene family is abundantly expressed in the inner roots heaths of sheep and human hair follicles［J］.The Journal of Investigative Dermatology，2001，116（1）：157-166.

［5］ Langbein L，Rogcrs MA，Winter H，et al.The catalogue of human hair keratins.Expression of the nine type Ⅰ members in the hair follicle［J］. Journal of Biological Chemistry，1999，274：19874-19884.

［6］ Grant W Mckenzie，Reena Arora，Jon G H Hickford.Genetic variation in the 5′UTR of the KRT2.13 gene of sheep［J］.Animal Science Journal，2012，83（3）：194-198.

［7］ 吳茜.新吉中國美利奴羊皮膚組織均一化全長CDNA文庫的構(gòu)建及其ESTs的生物信息分析［D］.烏魯木齊：新疆農(nóng)業(yè)大學，2010.

［8］ 劉桂芳.新疆優(yōu)質(zhì)中國美利奴羊遺傳多樣性及羊毛細度候選基因的分析［D］.烏魯木齊：新疆農(nóng)業(yè)大學，2005.

［9］ 田月珍.中國美利奴羊（新疆型）羊毛細度相關(guān)候選基因的篩選及其關(guān)聯(lián)性分析［D］.烏魯木齊：新疆農(nóng)業(yè)大學，2008.

［10］許漢峰.角蛋白關(guān)聯(lián)蛋白（KAP和KRT）與羊毛品質(zhì)的關(guān)聯(lián)性研究［D］.石河子：石河子大學，2008.

［11］Herrmann H，Hesse M，Reichenzeller M，et a1.Functional complexity of intermediate filament cytoskeletons：from structure to assembly to gene ablation［J］.Int Rev Cytol，2003（223）：83-175.

《中國草食動物科學》雙月刊

《中國草食動物科學》是由中華人民共和國農(nóng)業(yè)部主管、中國農(nóng)業(yè)科學院蘭州畜牧與獸藥研究所主辦的國家級科技核心期刊。于2012年4月由《中國草食動物》更名而成?！吨袊菔硠游锟茖W》為美國《化學文摘》（CA）收錄期刊，中國科技核心期刊，中國農(nóng)業(yè)核心期刊，RCCSE中國核心（擴展板）學術(shù)期刊；是中國科學引文數(shù)據(jù)庫（CSCD）、中國科技論文與引文數(shù)據(jù)庫、中國學術(shù)期刊綜合評價數(shù)據(jù)庫（CAJCED）和中國生物學文獻數(shù)據(jù)庫統(tǒng)計源期刊。

《中國草食動物科學》在原《中國草食動物》的基礎(chǔ)上，立足西部，充分利用研究所的區(qū)位優(yōu)勢，提高期刊核心競爭力，建立適應市場經(jīng)濟體制的與國際接軌的全新辦刊理念，及時、準確地反映草食動物科技進步的方向，增強在國內(nèi)外同行中的影響力和競爭力，更好地滿足廣大科研、教學與畜牧生產(chǎn)者的需求，服務我國節(jié)糧型動物養(yǎng)殖和畜牧業(yè)發(fā)展。

《中國草食動物科學》主要刊登牛、羊、馬、駱駝、鹿、兔、鴨、鵝、駝鳥、魚等各種節(jié)糧型草食動物的最新科研成果和科技成就。主要欄目：遺傳育種，繁殖與生理，營養(yǎng)與飼料，草地與牧草，疾病防控，專論與綜述。

《中國草食動物科學》為雙月刊，大16開，80頁碼，彩色封面，每期定價8.00元，全年48.00元，雙月1日出版。國內(nèi)統(tǒng)一刊號：CN62-1206/Q，國際標準刊號：ISSN2095-3887,郵發(fā)代號:54—57,國外代號:BM5133。全國郵局和本刊編輯部均可訂閱。

地址：甘肅省蘭州市七里河區(qū)鹼溝沿335號郵編：730050

電話：（0931）2115279Email：xumuchj@163.com

Polymorphism of KRT27 Gene and Its Relationship with Fineness Traits in Chinese Merino Sheep（Xinjiang Type）

Shi Xiaolei1，Huang Xixia1，Tian Kechuan2，et al
（1.College of Animal Science，Xinjiang Agricultural University，Urumqi 830052，China；2.Institute of Animal Science，Xinjiang Academy of Animal Sciences，Urumqi 830000，China）

In this study，PCR-SSCP analysis was used to identify genetic variation in KRT27 in Chinese Merino（Xinjiangtype），and the relationship with fineness traits were analyzed.The results showed that a PCR product of 122 bp corresponding to partial exon 5 had two genotypes，and the frequencies of the genotype AA，AB and allele A，B in Chinese Merino sheep（Xinjiang type）were 0.86，0.14 and 0.93，0.07 respectively，and the A allele was dominant allele.The polymorphic locus of KRT27 gene was at Hardy-Weinberg equilibrium（P>0.05）in the breed.The individuals of genotype AA，AB had no significant difference in the fineness traits（P>0.05）.

Chinese Merino（Xinjiangtype）；KRT27 gene；polymorphism；fineness

S826.2

A

2095-3887（2015）02-0001-04

10.3969/j.issn.2095-3887.2015.02.001

2014-12-10

現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系（CARS-40）；農(nóng)業(yè)科技成果轉(zhuǎn)化資金項目（2012GB2G400493）；緊缺人才專業(yè)大學生創(chuàng)新項目（jqrcp32010021）

石曉雷（1989-），男，在讀碩士研究生。

黃錫霞（1963-），女，教授，博士生導師。研究方向：動物遺傳育種；田可川（1963-），男，研究員。研究方向：細毛羊育種。