枯草芽孢桿菌對(duì)銅綠微囊藻抑制效果的研究

張 睿，王廣軍，李志斐，郁二蒙，夏 耘（.中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)研究院珠江水產(chǎn)研究所，農(nóng)業(yè)部熱帶亞熱帶水產(chǎn)資源利用與養(yǎng)殖重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東 廣州 50380；2.上海海洋大學(xué)水產(chǎn)與生命學(xué)院，上海 20306）

枯草芽孢桿菌對(duì)銅綠微囊藻抑制效果的研究

張 睿1，2，王廣軍1*，李志斐1，郁二蒙1，夏 耘1（1.中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)研究院珠江水產(chǎn)研究所，農(nóng)業(yè)部熱帶亞熱帶水產(chǎn)資源利用與養(yǎng)殖重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東 廣州 510380；2.上海海洋大學(xué)水產(chǎn)與生命學(xué)院，上海 201306）

為探討枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）對(duì)銅綠微囊藻（Microcystis aeruginosa）的抑制效果，在實(shí)驗(yàn)室條件下，研究了枯草芽孢桿菌不同生長(zhǎng)時(shí)期（延遲期、對(duì)數(shù)期、穩(wěn)定期和衰亡期）無(wú)菌濾液對(duì)銅綠微囊藻生長(zhǎng)的影響、枯草芽孢桿菌抑制銅綠微囊藻生長(zhǎng)的作用方式以及無(wú)菌濾液影響下銅綠微囊藻丙二醛（MDA）含量、超氧化物歧化酶（SOD）活性和光合色素含量的變化.結(jié)果顯示：枯草芽孢桿菌對(duì)數(shù)期、穩(wěn)定期和衰亡期濾液抑藻效果明顯好于延遲期，作用第8d，對(duì)銅綠微囊藻的去除率分別達(dá)到81.19％、91.41％、91.82％；4個(gè)處理組銅綠微囊藻的葉綠素a含量均顯著低于對(duì)照組.添加穩(wěn)定期濾液后，銅綠微囊藻MDA含量顯著升高，SOD活性先升高后降低；在對(duì)光合色素的影響中，類(lèi)胡蘿卜素受到的影響不如葉綠素a顯著.結(jié)果表明，枯草芽孢桿菌對(duì)銅綠微囊藻的抑制效果是通過(guò)分泌胞外物質(zhì)實(shí)現(xiàn)的，且分泌物具有很強(qiáng)的熱穩(wěn)定性.推測(cè)該胞外分泌物能夠破壞光合色素，影響光合作用，抑制藻細(xì)胞的生長(zhǎng)；同時(shí)抑制SOD活性，使細(xì)胞膜脂過(guò)氧化程度不斷加深，進(jìn)而破壞藻細(xì)胞的完整性，表現(xiàn)出對(duì)藻很強(qiáng)的抑制效果.

枯草芽孢桿菌；銅綠微囊藻；抑制；葉綠素a；丙二醛（MDA）

藻類(lèi)是養(yǎng)殖水體的初級(jí)生產(chǎn)力，但由于水體內(nèi)環(huán)境失衡，水體富營(yíng)養(yǎng)化、水溫、pH值等因素的異常變化常導(dǎo)致藻類(lèi)過(guò)渡生長(zhǎng)引起藻類(lèi)水華［1］.細(xì)菌等微生物被認(rèn)為在維持藻類(lèi)生物量平衡方面起重要作用［2］，因其具有經(jīng)濟(jì)、便攜、環(huán)境友好等特點(diǎn)，在控藻領(lǐng)域的研究應(yīng)用中受到越來(lái)越多的關(guān)注［3-4］.細(xì)菌抑制藻類(lèi)的作用方式主要是通過(guò)接觸或進(jìn)入藻細(xì)胞內(nèi)直接進(jìn)攻宿主，或者同藻類(lèi)競(jìng)爭(zhēng)有限營(yíng)養(yǎng)、分泌胞外物質(zhì)間接進(jìn)攻宿主兩大類(lèi)［5］.近年來(lái)，一些國(guó)內(nèi)學(xué)者針對(duì)微囊藻進(jìn)行了微生物控制的研究，篩選出了一系列具有抑制微囊藻效果的細(xì)菌［5］，其中芽孢桿菌被多數(shù)學(xué)者篩選分離，逐漸成為研究熱點(diǎn)［6-8］.

枯草芽孢桿菌是廣泛存在于自然界的一種非致命性細(xì)菌.目前，國(guó)內(nèi)對(duì)其研究大部分集中于發(fā)酵條件的優(yōu)化［9］、抗菌物質(zhì)在生物防治領(lǐng)域的應(yīng)用［10］，以及作為動(dòng)物飼料添加劑［11］、水質(zhì)凈化制劑［12］等方面，而在控藻領(lǐng)域的研究尚未見(jiàn)報(bào)道.

本實(shí)驗(yàn)選用枯草芽孢桿菌，研究其不同生長(zhǎng)時(shí)期濾液對(duì)銅綠微囊藻的抑制效果和抑藻的作用方式，并結(jié)合在無(wú)菌濾液影響下藻類(lèi)MDA含量、SOD活性和光合色素含量的變化，分析其抑藻的作用過(guò)程，為枯草芽孢桿菌在藻類(lèi)防控方面提供理論基礎(chǔ)和應(yīng)用指導(dǎo).

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)菌、藻種來(lái)源及培養(yǎng)條件

枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis，GIM1.372），購(gòu)于廣東省微生物研究所微生物菌種保藏中心，培養(yǎng)基為牛肉膏蛋白胨，高溫滅菌后使用.菌種經(jīng)平板活化后接種于液體培養(yǎng)基，在30℃、150r/min恒溫?fù)u床中培養(yǎng)12h，備用.

銅綠微囊藻（Microcystis aeruginosa FACHB315），由中國(guó)科學(xué)院水生生物研究所藻種保藏中心提供.培養(yǎng)基為BG11，高溫滅菌后使用.藻種于25℃、光照強(qiáng)度2000lx、光暗比12h：12h恒溫培養(yǎng)箱中擴(kuò)大培養(yǎng)，實(shí)驗(yàn)時(shí)按所需藻量接種于BG11.

1.2 細(xì)菌生長(zhǎng)曲線測(cè)定

取1mL培養(yǎng)12h的枯草芽孢桿菌菌液添加至裝有100mL牛肉膏蛋白胨的250mL錐形瓶中，在30℃、150r/min恒溫?fù)u床中培養(yǎng)，定時(shí)取樣，參照沈等方法，用分光光度計(jì)測(cè)定OD600值，以培養(yǎng)時(shí)間和細(xì)菌吸光值繪制生長(zhǎng)曲線［13］.由于預(yù)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)取樣量過(guò)大細(xì)菌液體量減少會(huì)加快細(xì)菌的生長(zhǎng)速度，使同一時(shí)間OD600值變高，因此測(cè)定細(xì)菌生長(zhǎng)曲線時(shí)，準(zhǔn)備9個(gè)錐形瓶在搖床中同時(shí)培養(yǎng)，每次取樣3個(gè)平行，取樣10次換下一批，以此保證生長(zhǎng)曲線的可靠性.

1.3 枯草芽孢桿菌不同生長(zhǎng)時(shí)期濾液對(duì)銅綠微囊藻生長(zhǎng)的影響

根據(jù)1.2節(jié)得到枯草芽孢桿菌生長(zhǎng)曲線，設(shè)定t=2，12，34，52h代表枯草芽孢桿菌生長(zhǎng)的延遲期、對(duì)數(shù)期、穩(wěn)定期和衰亡期.分別在設(shè)定點(diǎn)取細(xì)菌菌液，用0.22μm濾膜過(guò)濾得到無(wú)菌濾液（經(jīng)平板劃線證明無(wú)菌），取各期濾液5mL加入100mL初始生長(zhǎng)、藻量為1.0×106cells/mL、葉綠素a含量為141.05μg/L的銅綠微囊藻液中，每天取樣，用血球計(jì)數(shù)板計(jì)算藻細(xì)胞濃度，繪制生長(zhǎng)曲線，周期8d.第8d測(cè)各實(shí)驗(yàn)組藻葉綠素含量.每個(gè)處理組設(shè)置3個(gè)平行.

1.4 枯草芽孢桿菌抑制銅綠微囊藻生長(zhǎng)的作用方式

將細(xì)菌培養(yǎng)至穩(wěn)定期，分別取5mL原菌液、離心菌體（10000r/min，4℃，10min離心，棄上清，無(wú)菌水沖洗2次）、5mL細(xì)菌濾液（0.22μm濾膜抽濾）、5mL高熱處理濾液（121℃高壓滅菌鍋加熱20min）加入100mL初始生長(zhǎng)、葉綠素a含量為153.09μg/L的銅綠微囊藻液中，測(cè)第4d和第8d葉綠素a含量.每個(gè)處理組設(shè)置3個(gè)平行.

1.5 光合色素含量的測(cè)定

葉綠素a提取方法采用反復(fù)凍融-浸提法［14］，取10mL藻液5000r/min、15min離心后棄上清液，將藻樣置-20℃冰箱和室溫下反復(fù)凍融3次，添加90％丙酮溶液10mL浸提20h，浸提后將藻樣4000r/min離心15min，分光光度計(jì)測(cè)上清液630，645，663，750nm處吸光值，根據(jù)以下公式［15］計(jì)算葉綠素a含量：

式中：V為樣品體積（L），μg/L；

類(lèi)胡蘿卜素的測(cè)定參照文獻(xiàn)［16］，由于藍(lán)藻不含葉綠素b，將公式優(yōu)化計(jì)算其含量：

類(lèi)胡蘿卜素（Car）=（1000D470-3.27Ca）× 10/229V；V為樣品體積（L），μg/L.

1.6 丙二醛（MDA）和超氧化物歧化酶（SOD）的測(cè)定

MDA測(cè)定采用硫代巴比妥酸法［16］，待測(cè)樣品制備參照文獻(xiàn)［17］，根據(jù)預(yù)實(shí)驗(yàn)用反復(fù)凍融取代冰浴研磨破碎藻細(xì)胞，具體方法為：取一定量藻液5000r/min、4℃離心15min收集藻細(xì)胞，加少量磷酸緩沖液（pH7.8）置-20℃冰箱和室內(nèi)下反復(fù)凍融3次，勻漿液8000r/min、4℃離心20min，收集上清液用作MDA含量測(cè)定.

SOD活性測(cè)定通過(guò)SOD WST-1法測(cè)定試劑盒（購(gòu)買(mǎi)自南京建成生物工程研究所），具體參照培養(yǎng)細(xì)胞中SOD活性的測(cè)定方法.

1.7 分析方法

菌落計(jì)數(shù)采用平板涂布計(jì)數(shù)法.藻細(xì)胞計(jì)數(shù)使用血球計(jì)數(shù)板.

藻的去除率R定義為：R=（1-Ct/C0）×100％，其中，C0為對(duì)照組銅綠微囊藻初始濃度，×105cells/mL；Ct為處理組不同時(shí)間的藻細(xì)胞濃度，×105cells/mL.

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)分析用SPSS18.0軟件進(jìn)行.對(duì)各實(shí)驗(yàn)組的數(shù)據(jù)作單因素方差分析（one-way ANOVA）和Duncan’S多重比較分析.

2 結(jié)果與分析

2.1 枯草芽孢桿菌生長(zhǎng)曲線

圖1 枯草芽孢桿菌生長(zhǎng)曲線Fig.1 The growth curve of Bacillus subtilis

由圖1可知，枯草芽孢桿菌經(jīng)過(guò)2h左右的延遲期后進(jìn)入對(duì)數(shù)期，3～10h生長(zhǎng)速率最快，12～22h速率變慢，大約在24h進(jìn)入穩(wěn)定期持續(xù)至48h，48h后開(kāi)始衰亡.枯草芽孢桿菌延遲期短，生長(zhǎng)速率快，對(duì)數(shù)期較長(zhǎng)，用平板涂布計(jì)數(shù)法得知細(xì)菌在12，34，52h時(shí)生物量分別為7.6×108，1.0×109，7.0× 107CFU/cm3.可見(jiàn)，枯草芽孢桿菌能在較短時(shí)間達(dá)到較大生物量.

2.2 枯草芽孢桿菌不同生長(zhǎng)時(shí)期濾液對(duì)銅綠微囊藻生長(zhǎng)的影響

2.2.1 不同生長(zhǎng)時(shí)期濾液影響下銅綠微囊藻的生長(zhǎng)曲線 由圖2可知，枯草芽孢桿菌4個(gè)生長(zhǎng)時(shí)期的濾液對(duì)銅綠微囊藻的生長(zhǎng)均有較好的抑制作用，實(shí)驗(yàn)第8d，4個(gè)處理組藻量分別為10.30× 105，2.30×105，1.07×105，1.00×105cells/mL，低于對(duì)照組的57.50×105cells/mL，差異極顯著（P＜0.01），推測(cè)細(xì)菌從延遲期即開(kāi)始分泌具有抑藻效果的胞外物質(zhì).細(xì)菌對(duì)數(shù)期、穩(wěn)定期和衰亡期處理組的藻量極顯著低于延遲期處理組（P＜0.01），延遲期處理組藻生長(zhǎng)趨勢(shì)受到濾液影響，藻量變化不大；對(duì)數(shù)期和穩(wěn)定期處理組中藻的生長(zhǎng)曲線較為接近，實(shí)驗(yàn)周期內(nèi)藻呈現(xiàn)負(fù)生長(zhǎng)狀態(tài)，藻量從1.0× 106cells/mL下降到2.30×105cells/mL和1.05× 105cells/mL，對(duì)藻有很好的抑制效果，且穩(wěn)定期處理組藻量極顯著低于對(duì)數(shù)期處理組（P＜0.01）；衰亡期濾液在加入后的第1d，藻量有所增長(zhǎng)，但仍顯著低于對(duì)照組（P＜0.05），第2d藻量開(kāi)始下降，藻呈現(xiàn)負(fù)生長(zhǎng)狀態(tài)，第8d，藻量下降到1.00×105cells/mL，與穩(wěn)定期處理組無(wú)顯著差異（P＞0.05）.衰亡期濾液對(duì)藻也有很好的抑制效果.經(jīng)計(jì)算，濾液添加的第1d，延遲期和衰亡期處理組藻量分別增加14％和9.8％，對(duì)數(shù)期和穩(wěn)定期處理組藻的去除率分別為2.3％和2％；第4d，4個(gè)處理組藻的去除率分別為1.7％、78.7％、69.3％、74.7％；第8d，延遲期處理組藻量增長(zhǎng)3％，對(duì)數(shù)期、穩(wěn)定期和衰亡期處理組藻的去除率分別為77％、89.5％、90％.延遲期濾液抑藻效果較差，對(duì)數(shù)期濾液在第4d抑藻效果最好，第8d則不如穩(wěn)定期和衰亡期.從整體看，穩(wěn)定期濾液的抑藻效果最穩(wěn)定.

2.2.2 不同生長(zhǎng)時(shí)期濾液對(duì)藻葉綠素a含量的影響 由圖3可知，受到枯草芽孢桿菌濾液的影響，銅綠微囊藻的葉綠素a含量明顯降低，且極顯著低于對(duì)照組中藻葉綠素a含量（P＜0.01），說(shuō)明在濾液的作用下，銅綠微囊藻的光合作用受到嚴(yán)重影響.實(shí)驗(yàn)初始葉綠素a含量為141.05μg/L，第8d時(shí)，對(duì)照組葉綠素a含量為511.07μg/L，延遲期處理組為97.55μg/L，對(duì)數(shù)期處理組為87.38μg/L，穩(wěn)定期處理組為69.39μg/L，衰亡期處理組為68.95μg/L.其中，延遲期處理組藻葉綠素a含量與對(duì)數(shù)期處理組差異不顯著（P＞0.05），極顯著高于穩(wěn)定期和衰亡期處理組（P＜0.01），對(duì)數(shù)期處理組藻葉綠素a含量顯著高于穩(wěn)定期和衰亡期處理組（P＜0.05），穩(wěn)定期和衰亡期處理組藻葉綠素a含量差異不顯著（P＞0.05）.

圖2 枯草芽孢桿菌不同生長(zhǎng)時(shí)期濾液對(duì)銅綠微囊藻生長(zhǎng)的影響Fig.2 Effects of B.subtilis filtrate in different growth periods on the growth of M.aeruginosa

圖3 枯草芽孢桿菌不同生長(zhǎng)時(shí)期濾液對(duì)銅綠微囊藻葉綠素a含量的影響Fig.3 Effects of B.subtilis filtrate in different growth periods on the Chl a content of M.aeruginosa不同字母代表組間差異顯著P＜0.05

2.3 枯草芽孢桿菌抑制銅綠微囊藻生長(zhǎng)的作用方式

從圖4可以看出，枯草芽孢桿菌濾液、原菌液、高熱處理的濾液對(duì)藻葉綠素a含量影響極顯著，3個(gè)處理組藻的葉綠素a含量在第4d分別為91.47，135.73，90.82μg/L，第8d分別為59.78，81.73，56.60μg/L，比較實(shí)驗(yàn)初始的153.09μg/L，葉綠素a含量明顯降低；而對(duì)照組在第4d和第8d分別上升至318.03μg/L和604.60μg/L.其中，高熱處理濾液和濾液處理組中藻的葉綠素a含量差異不顯著（4、8d：P＞0.05），并且這兩個(gè)處理組在第4d時(shí)藻的葉綠素a含量均顯著低于原菌液處理組（P＜0.05）.但是實(shí)驗(yàn)顯示添加枯草芽孢桿菌離心菌體時(shí)，銅綠微囊藻第4，8d的葉綠素a含量分別為361.83，959.75μg/L，均顯著高于對(duì)照組（4d：P＜0.05、8d：P＜0.01），結(jié)合原菌液處理組葉綠素a含量也高于濾液和高熱濾液處理組，可以說(shuō)明枯草芽孢桿菌存在時(shí)，銅綠微囊藻的生長(zhǎng)確實(shí)被促進(jìn)，但具體原因不明.同時(shí)，第8d數(shù)據(jù)分析顯示，原菌液處理組與高熱處理濾液、濾液處理組的藻葉綠素a含量并無(wú)顯著差異（P＞0.05），這可能是因?yàn)樵褐泻械囊衷逦镔|(zhì)作用效果比藻受到的促進(jìn)作用影響程度更大、持續(xù)時(shí)間更長(zhǎng).因此，本實(shí)驗(yàn)說(shuō)明，枯草芽孢桿菌的抑藻效果是通過(guò)分泌胞外物質(zhì)實(shí)現(xiàn)，且該分泌物具有很強(qiáng)的熱穩(wěn)定性.

圖4 枯草芽孢桿菌培養(yǎng)液不同處理方式對(duì)銅綠微囊藻葉綠素a含量的影響Fig.4 Effects of B.subtilis culture liquid with different treated methods on the Chl a content of M.aeruginosa不同字母表示同一天組間比較差異顯著P＜0.05

2.4 MDA含量的測(cè)定

MDA是反映藻細(xì)胞膜脂過(guò)氧化程度的重要指標(biāo)［16］.圖5顯示加入枯草芽孢桿菌穩(wěn)定期濾液后，銅綠微囊藻MDA含量的變化.實(shí)驗(yàn)第1d，濾液組銅綠微囊藻的MDA含量比對(duì)照組提高59％（P＜0.01），實(shí)驗(yàn)第8d，比對(duì)照組提高918％（P＜0.01），濾液組藻的MDA含量顯著升高.對(duì)照組銅綠微囊藻的MDA含量始終保持在較低水平，但第1d比第8d略高（P＜0.05），這可能是因?yàn)榻臃N于新的培養(yǎng)基，藻細(xì)胞在新環(huán)境中發(fā)生氧化應(yīng)激反應(yīng)造成MDA含量略微升高［18］.該實(shí)驗(yàn)結(jié)果說(shuō)明枯草芽孢桿菌的胞外分泌物質(zhì)對(duì)銅綠微囊藻的膜脂過(guò)氧化作用效果十分明顯且過(guò)氧化程度不斷加深.

圖5 枯草芽孢桿菌濾液對(duì)銅綠微囊藻MDA含量的影響Fig.5 Effects of B.subtilis filtrate on the MDA content of M.aeruginosa

2.5 SOD活性的測(cè)定

圖6顯示加入枯草芽孢桿菌穩(wěn)定期濾液后，銅綠微囊藻SOD活性的變化.SOD是藻細(xì)胞為防止過(guò)氧化損傷產(chǎn)生的保護(hù)性酶［18］.實(shí)驗(yàn)第1d，濾液組銅綠微囊藻的SOD活性顯著升高，比對(duì)照組提高159％（P＜0.01），實(shí)驗(yàn)第8d，其活性相比第1d明顯降低，但仍比對(duì)照組高63％（P＜0.01），對(duì)照組藻的SOD活性始終保持在較低水平.該實(shí)驗(yàn)結(jié)果說(shuō)明，銅綠微囊藻在受到枯草芽孢桿菌的胞外分泌物質(zhì)損傷時(shí)，會(huì)通過(guò)提高抗氧化酶活性來(lái)增強(qiáng)對(duì)活性氧的清除能力，防止藻細(xì)胞發(fā)生膜脂過(guò)氧化.但由于銅綠微囊藻受到的氧化損傷過(guò)大，SOD活性在第8d反而比第1d有所降低.

圖6 枯草芽孢桿菌濾液對(duì)銅綠微囊藻SOD活性的影響Fig.6 Effects of B.subtilis filtrate on the SOD activity of M.aeruginosa

2.6 光合色素含量的變化

圖7 枯草芽孢桿菌濾液對(duì)銅綠微囊藻光合色素含量的影響Fig.7 Effects of B.subtilis filtrate on the photosynthetic pigments content of M.aeruginosa

圖7顯示加入枯草芽孢桿菌穩(wěn)定期濾液后，藻的葉綠素a和類(lèi)胡蘿卜素含量的變化情況.從圖中可以看出，濾液組中銅綠微囊藻兩種色素含量均受到嚴(yán)重影響，且影響效果隨著時(shí)間延長(zhǎng)顯著增加，類(lèi)胡蘿卜素受到的影響程度小于葉綠素a.數(shù)據(jù)顯示，濾液組中葉綠素a含量從170.69μg/L下降至96.69μg/L，對(duì)照組則上升至651.23μg/L，第4，6，8d時(shí)，其含量相比對(duì)照組分別減少71.48％、82.04％、85.15％，影響效果極顯著（P＜0.01）；類(lèi)胡蘿卜素受到的影響較小，濾液組中其含量從114.01μg/L下降到64.12μg/L，對(duì)照組則上升至341.50μg/L，第4，6，8d時(shí)，其含量相比對(duì)照組分別減少53.56％、69.54％、81.22％，只有第8d的影響效果極顯著（P＜0.01）.

3 討論

3.1 枯草芽孢桿菌抑藻的作用方式

近年來(lái)，有關(guān)芽孢桿菌抑藻效果的報(bào)道越來(lái)越多，寧華等［6］在滇池中分離得到28株芽孢桿菌，發(fā)現(xiàn)其中6株有較好的抑藻效果，且抑藻效果都是通過(guò)分泌胞外物質(zhì)實(shí)現(xiàn).Nobuyuki等［19］、馬宏瑞等［8］通過(guò)實(shí)驗(yàn)證明分離得到的芽孢桿菌是通過(guò)分泌胞外物質(zhì)實(shí)現(xiàn)抑藻效果.也有報(bào)道，蠟樣芽胞桿菌是通過(guò)直接接觸的方式進(jìn)攻宿主水華束絲藻［20］，短小芽孢桿菌能同時(shí)通過(guò)分泌胞外物質(zhì)和直接接觸藻細(xì)胞兩種方式抑制微囊藻、束絲藻和魚(yú)腥藻［7］.可見(jiàn)不同芽孢桿菌對(duì)于不同的水華藻類(lèi)有不同的作用方式，但就目前的資料來(lái)看，芽孢桿菌對(duì)于微囊藻屬的藻類(lèi)主要還是通過(guò)間接方式抑藻［6］.本實(shí)驗(yàn)中，枯草芽孢桿菌對(duì)銅綠微囊藻的抑制效果也是通過(guò)分泌胞外物質(zhì)間接實(shí)現(xiàn).研究發(fā)現(xiàn)，枯草芽孢桿菌在生長(zhǎng)代謝過(guò)程中，能分泌多種細(xì)菌素，而且一般是環(huán)肽［21］.其中枯草菌素是研究較深的一種細(xì)菌素，具有抗酸抗熱的特性［22］.據(jù)報(bào)道［23］，含有10mg/L的枯草菌脂肽（產(chǎn)生于多種芽孢桿菌的環(huán)狀脂肽）培養(yǎng)基，可以在2d內(nèi)去除85％的微囊藻，魚(yú)腥藻也可被去除70％.錢(qián)常娣等［24］從枯草芽孢桿菌發(fā)酵上清液提取出一種脂肽類(lèi)化合物，表明其具有熱穩(wěn)定性且耐受較廣的pH值范圍.此外，本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，延遲期濾液對(duì)藻生長(zhǎng)雖然有抑制作用，但因?yàn)樵摃r(shí)期細(xì)菌生物量較小且處于生長(zhǎng)過(guò)渡階段，細(xì)菌代謝活動(dòng)能力較弱，胞外分泌物濃度較低，所以對(duì)藻的生長(zhǎng)影響較??；從對(duì)數(shù)期開(kāi)始，細(xì)菌生物量顯著增加，代謝活動(dòng)能力明顯增強(qiáng)，胞外分泌物濃度較高，因此對(duì)數(shù)期之后濾液對(duì)藻的生長(zhǎng)影響較大；同時(shí)，由于細(xì)菌代謝產(chǎn)物的積累，所以穩(wěn)定期濾液效果好于對(duì)數(shù)期；而衰亡期濾液與穩(wěn)定期和對(duì)數(shù)期有所不同，這可能是因?yàn)榧?xì)菌在衰亡階段，有毒物質(zhì)積累，生長(zhǎng)環(huán)境改變，細(xì)菌代謝產(chǎn)物的種類(lèi)與之前有了較大差異.枯草芽孢桿菌在不同生長(zhǎng)時(shí)期，代謝能力和代謝產(chǎn)物有所不同，造成了各時(shí)期濾液對(duì)藻生長(zhǎng)的影響不同，因此表現(xiàn)出對(duì)藻去除率的差異.該結(jié)果與馬宏瑞等［8］研究結(jié)果一致.

3.2 枯草芽孢桿菌對(duì)銅綠微囊藻MDA含量、SOD活性的影響

MDA是細(xì)胞膜脂過(guò)氧化作用的產(chǎn)物之一，其產(chǎn)生數(shù)量的多少代表細(xì)胞膜脂過(guò)氧化的程度，也間接反映膜系統(tǒng)受氧化損傷程度［16］.羅固源等［25］發(fā)現(xiàn)銅綠微囊藻在菌株S7無(wú)菌濾液的作用下，其MDA含量的升高和藻細(xì)胞結(jié)構(gòu)的損傷具有一致性，他們發(fā)現(xiàn)隨著細(xì)胞膜脂過(guò)氧化程度加深，藻細(xì)胞結(jié)構(gòu)發(fā)生變形并伴有膜壁分離現(xiàn)象.本試驗(yàn)中，濾液組銅綠微囊藻MDA含量顯著升高，對(duì)照組始終保持在較低水平，說(shuō)明濾液組銅綠微囊藻藻受氧化脅迫細(xì)胞膜脂過(guò)氧化作用十分明顯且過(guò)氧化程度不斷加深，這一現(xiàn)象與史順玉［17］研究結(jié)果相似，該研究發(fā)現(xiàn)加入抑藻細(xì)菌能夠引起銅綠微囊藻的活性氧積累，并激活藻細(xì)胞的抗氧化系統(tǒng)，如果植物細(xì)胞不能清除過(guò)量的活性氧，則會(huì)造成細(xì)胞膜脂過(guò)氧化程度加劇，進(jìn)而損傷其膜功能和結(jié)構(gòu)，最終導(dǎo)致一系列生理生化過(guò)程的改變.SOD是抗氧化系統(tǒng)中清除活性氧的重要酶類(lèi)，普遍存在于動(dòng)植物與微生物體內(nèi)，能夠清除超氧陰離子自由基，防御活性氧或其他過(guò)氧化物自由基對(duì)細(xì)胞膜系統(tǒng)的傷害［16］.本試驗(yàn)中，濾液組銅綠微囊藻SOD活性先升高后降低，該結(jié)果與牛丹丹等［26］研究結(jié)果相似.已有報(bào)道［27］，植物在輕度環(huán)境脅迫下，SOD活性會(huì)有所升高，以清除活性氧保護(hù)細(xì)胞膜系統(tǒng)；但在重度環(huán)境脅迫下，SOD活性反而會(huì)大幅度下降.這可能是因?yàn)镾OD受到其歧化反應(yīng)生成的H2O2和O2的濃度的影響導(dǎo)致活性降低［17］.因此，可以推測(cè)枯草芽孢桿菌抑制銅綠微囊藻的作用過(guò)程為：一方面細(xì)菌的胞外分泌物使藻細(xì)胞產(chǎn)生大量活性氧，發(fā)生膜脂過(guò)氧化，藻細(xì)胞為清除活性氧表現(xiàn)出提升SOD活性的自我保護(hù)能力；另一方面隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，細(xì)菌的胞外分泌物對(duì)藻細(xì)胞傷害程度加深、作用時(shí)間長(zhǎng)，超出了藻細(xì)胞的自我保護(hù)能力，SOD活性下降，活性氧累積，進(jìn)一步加深膜脂過(guò)氧化程度，最終導(dǎo)致藻細(xì)胞的完整性被破壞.

3.3 枯草芽孢桿菌對(duì)銅綠微囊藻光合色素含量的影響

光合色素是藻類(lèi)進(jìn)行光合作用的物質(zhì)基礎(chǔ)，其含量變化能較好的反映藻各階段生長(zhǎng)發(fā)育情況正常與否，也間接反映出藻生物量的多少［28］.葉綠素是植物進(jìn)行光合作用主要色素，由于藍(lán)藻不含葉綠素b，本實(shí)驗(yàn)統(tǒng)一用葉綠素a作為顯示藻量和藻光合作用能力的指標(biāo).而類(lèi)胡蘿卜素除參與光傳遞過(guò)程外，還可以吸收剩余光能、猝滅活性氧，保護(hù)葉綠素和光合機(jī)能［29］.從本實(shí)驗(yàn)的結(jié)果可以看出，枯草芽孢桿菌濾液對(duì)銅綠微囊藻光合作用影響顯著，其原因可能是細(xì)菌的胞外分泌物使藻產(chǎn)生大量活性氧，在促使藻細(xì)胞發(fā)生膜脂過(guò)氧化的同時(shí)，也極易進(jìn)攻光合色素及與之結(jié)合的類(lèi)囊體膜［30］.并且，大量存在的活性氧會(huì)改變光合電子傳遞鏈的氧化還原態(tài)，影響相關(guān)核基因的表達(dá)，使葉綠素定位受到干擾，導(dǎo)致自由狀態(tài)的葉綠素被降解，最終降低光合效率和葉綠素含量［31］.這一過(guò)程中，由于類(lèi)胡蘿卜素的保護(hù)機(jī)制，受到濾液的影響更不顯著.該結(jié)果與相關(guān)研究［32-33］結(jié)果類(lèi)似.另一方面，由于藻細(xì)胞膜脂過(guò)氧化程度不斷加深，藻細(xì)胞的完整性被破壞，導(dǎo)致葉綠素被破壞.這一過(guò)程則直接表現(xiàn)為藻生物量的降低.本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，延遲期處理組銅綠微囊藻的葉綠素a含量從初始141.05μg/L降低至97.55μg/L，而藻量變化不大，說(shuō)明在濾液的作用下，銅綠微囊藻的光合作用受到抑制，這一作用比藻細(xì)胞數(shù)量的變化更明顯.原因可能是細(xì)菌的胞外分泌物濃度還不足以完全破壞藻細(xì)胞，藻細(xì)胞葉綠素a有所降解，但保留一定的光合作用功能.相關(guān)研究［34］也有類(lèi)似發(fā)現(xiàn).所以，延遲期處理組藻量雖然大于對(duì)數(shù)期處理組，但葉綠素a含量的比較并無(wú)顯著差異；而對(duì)數(shù)期、穩(wěn)定期和衰亡期3個(gè)處理組之間葉綠素a含量的比較和藻量的比較則具有一致性.

此外，本實(shí)驗(yàn)在探討枯草芽孢桿菌抑藻的作用方式時(shí)，出現(xiàn)離心菌體處理組銅綠微囊藻生長(zhǎng)受到促進(jìn)的情況.實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，將等量的枯草芽孢桿菌離心菌體加入BG11培養(yǎng)基時(shí)，其生物量從1.0×107CFU/cm3到第8d依次遞減為：5.5×106，3.0×106，1.8×106，6.2×105，4.6×105，3.2×105，1.3×105，1.1×103CFU/cm3，可以看出枯草芽孢桿菌在銅綠微囊藻適應(yīng)的環(huán)境中因無(wú)法正常生長(zhǎng)而大量死亡，但是否由于細(xì)菌死亡裂解釋放物質(zhì)導(dǎo)致藻生長(zhǎng)的促進(jìn)，本實(shí)驗(yàn)無(wú)法定論.所以，本實(shí)驗(yàn)可證明枯草芽孢桿菌能通過(guò)分泌胞外物質(zhì)抑制銅綠微囊藻生長(zhǎng)，但有關(guān)細(xì)菌與藻存在的其它作用關(guān)系，還有待進(jìn)一步研究.

4 結(jié)論

4.1 枯草芽孢桿菌不同生長(zhǎng)時(shí)期濾液對(duì)銅綠微囊藻的生長(zhǎng)均有抑制效果，其中穩(wěn)定期濾液對(duì)藻的去除效果最佳；細(xì)菌濾液嚴(yán)重影響銅綠微囊藻光合作用，使其光合色素含量降低.

4.2 枯草芽孢桿菌對(duì)銅綠微囊藻的抑制效果是通過(guò)分泌胞外物質(zhì)實(shí)現(xiàn)的，且該物質(zhì)具有很強(qiáng)的熱穩(wěn)定性.

4.3 枯草芽孢桿菌濾液添加后，銅綠微囊藻MDA含量明顯升高，說(shuō)明藻受濾液影響發(fā)生膜脂過(guò)氧化；銅綠微囊藻SOD活性先升高后降低，是由于藻細(xì)胞的氧化損傷過(guò)大，SOD受到其歧化反應(yīng)生成物濃度的影響，導(dǎo)活性降低.

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Inhibition of Microcystis aeruginosa by Bacillus subtilis.

ZHANG Rui1，2，WANG Guang-jun1*，LI Zhi-fei1，YU Er-meng1，XIA Yun1（1.Key Laboratory of Tropical and Subtropical Fishery Resource Application and Cultivation，Ministry of Agriculture，Pearl River Fishery Research Institute，Chinese Academy of Fishery Sciences，Guangzhou 510380，China；2.College of Fisheries and Life Science，Shanghai Ocean University，Shanghai 201306，China）.China Environmental Science，2015，35（6）：1814～1821

To investigate the inhibition of Bacillus subtilis against Microcystis aeruginosa，the bacterium-free filtrate of B.subtilis culture from different growth periods（delayed，log，stable and decline phase）were used to study its inhibition and mode of action against M.aeruginosa.The MDA，SOD activity and the photosynthetic pigments content in M.aeruginosa were measured.The results showed that the inhibition of M.aeruginosa by the B.subtilis filtrate was greater in log phase，stable phase and decline phase than that in delayed phase with removing efficiency of 81.19％，91.41％and 91.82％，respectively on day 8.The chlorophyll a contents of M.aeruginosa in treated groups were significantly lower than that in the control group.The MDA contents increased obviously in treated group and the SOD activity increased first and then decreased when M.aeruginosa was cultured in the filtrate-containing medium.Carotenoids were not affected as much as chlorophyll a.Results showed that B.subtilis inhibited the growth of the algae by secreting extracellular substances.And these substances were highly thermal-stable.It was speculate that the substances can hinder the photosynthesis by destroying the photosynthetic pigments and increase the membrane lipid peroxidation by inhibiting the SOD activity at the same time，resulting in inhibition of M.aeruginosa.

Bacillus subtilis；Microcystis aeruginosa；inhibition；chlorophyll a；MDA

S946.3，X17

A

1000-6923（2015）06-1814-08

張 睿（1991-），男，福建清流人，上海海洋大學(xué)碩士研究生，主要從事水產(chǎn)動(dòng)物健康養(yǎng)殖研究.

2014-10-20

“十二五”農(nóng)村領(lǐng)域國(guó)家科技計(jì)劃課題（2012BAD25B01）

* 責(zé)任作者，副研究員，wgj5810@163.com