葡萄籽原花青素通過細胞外信號調節(jié)激酶1/2途徑對放射性腦損傷大鼠海馬區(qū)生長相關蛋白-43活性的影響①

肖穎，劉永亮

葡萄籽原花青素通過細胞外信號調節(jié)激酶1/2途徑對放射性腦損傷大鼠海馬區(qū)生長相關蛋白-43活性的影響①

肖穎1，劉永亮2

目的觀察葡萄籽原花青素(GSPE)對放射性腦損傷大鼠的防治作用，并分析可能的保護機制。方法72只3月齡雄性Sprague-Daw ley大鼠隨機分為對照組(n=18)、模型組(n=18)、低劑量GSPE組(n=18)和高劑量GSPE組(n=18)。用直線加速器進行腦部照射22Gy制作放射性腦損傷模型。采用穿梭箱實驗檢測大鼠學習能力；HE染色觀察海馬區(qū)神經細胞組織形態(tài)變化；RT-PCR法檢測生長相關蛋白-43(GAP-43)mRNA表達，Western blotting檢測磷酸化的細胞外信號調節(jié)激酶1/2(ERK1/2)表達。結果與模型組比較，各GSPE組動物穿梭箱主動回避反應率顯著升高(P＜0.001)，被動回避潛伏期顯著縮短(P＜0.001)；海馬區(qū)神經細胞結構損傷減輕；GAP-43mRNA和磷酸化ERK1/2表達水平增高(P＜0.001)。且高劑量GSPE組顯著優(yōu)于低劑量GSPE組(P＜0.001)。模型組中GAP-43mRNA表達水平與磷酸化ERK1/2水平呈正相關(r=0.764,P＜0.001)；低劑量GSPE組和高劑量GSPE組中GAP-43mRNA表達水平與磷酸化ERK1/2水平呈正相關(r=0.814,0.822,P＜0.001)。結論GSPE通過ERK1/2途徑提高大鼠海馬區(qū)GAP-43表達，發(fā)揮防治放射性腦損傷作用。

放射性腦損傷；學習；生長相關蛋白-43；細胞外信號調節(jié)激酶1/2；大鼠

[本文著錄格式]肖穎，劉永亮.葡萄籽原花青素通過細胞外信號調節(jié)激酶1/2途徑對放射性腦損傷大鼠海馬區(qū)生長相關蛋白-43活性的影響[J].中國康復理論與實踐,2015,21(12):1397-1401.

CITED AS:Xiao Y,Liu YL.Effectof grape seed proanthocyanidin on grow th associated protein-43 through extracellular signal regulated kinase 1/2 pathway in ratswith brain radiation injury[J].Zhongguo Kangfu Lilun Yu Shijian,2015,21(12):1397-1401.

1　材料和方法

1.1試劑和儀器

GSPE：天津市尖峰天然產物研究開發(fā)有限公司，用蒸餾水溶解成所需濃度。ZH-CSC型穿梭實驗視頻分析系統(tǒng)(Shuttle Box System)：安徽正華生物儀器設備有限公司。西門子PRMUSM型直線加速器：德國。

1.2動物分組

72只3月齡雄性Sprague-Daw ley大鼠，體質量(220±20)g，購自北京維通利華公司，合格證號SCXK(京)2003-003。隨機分成對照組(n=18)、模型組(n= 18)、高劑量GSPE組(n=18)和低劑量GSPE組(n=18)。各組又分別分為照射后7 d、14 d、28 d 3個亞組。

1.3方法

對照組只進行常規(guī)麻醉，不進行照射。

模型組常規(guī)麻醉，參考文獻[7]制作放射性腦損傷模型。用特制的固定盒固定大鼠，采用加速器產生的6MeV電子線對大鼠進行單次全腦照射，源皮距為100 cm，吸收劑量率250 Mu/m in，吸收劑量為22 Gy；照射時僅頭部暴露于射線下，同時使用擋鉛保護眼睛、耳朵、頸部、身體。使用1.0 cm厚的組織補償膠體(Bolx)覆蓋頭皮，使劑量分布均勻。

高劑量GSPE組和低劑量GSPE組動物照射方法同模型組，于照射前2周開始每天灌胃給藥1次，持續(xù)至觀察時點。給藥劑量參考文獻[8]：高劑量GSPE組200mg/kg，低劑量GSPE組100mg/kg。

1.4學習能力評測

將各組大鼠按時間點分別放入穿梭箱，適應5 m in消除探究反射后給予鈴聲刺激5 s，繼之給予電擊20 s，間隔10 s后進入下一輪訓練。訓練中，如果在鈴聲刺激5 s內大鼠逃向安全區(qū)，則為主動回避反應，系統(tǒng)自動停止當次訓練；如果在鈴聲刺激5 s內大鼠未逃向安全區(qū)，則給予1.5mA交流電20 s，如果在電擊后逃向安全區(qū)，則為被動回避反應陽性，否則為主動、被動回避反應陰性。每只大鼠電擊30次，記錄被動回避潛伏期(passiveavoidance latency,PAL)、主動回避反應次數等參數。主動回避反應次數占總訓練次數的百分比即為主動回避反應率(active avoidance reaction rate,AARR)；AARR越高，PAL越短，表明動物學習能力越強。

1.5腦組織海馬區(qū)形態(tài)結構觀察

各組各時間點取3只大鼠，4%多聚甲醛灌注固定后，取腦，截取視交叉平面至大腦橫裂腦組織。石蠟包埋、冠狀切片，片厚5μm，HE染色。光學顯微鏡下觀察。

1.6RT-PCR法檢測GAP-43mRNA表達

各組各時間點取3只大鼠，致死后迅速取雙側海馬區(qū)組織，稱量0.6 g，加入RNAiso Plus溶液1m l勻漿，室溫靜置5m in后12000 r/m in 4℃離心5min，取上清移至新的1.5m l離心管內，加入1/5RNAiso Plus溶液體積的氯仿，震蕩混勻后室溫靜置5m in，12000r/min 4℃離心15m in，將上清液轉移至新離心管中，加入0.5～1倍RNAiso Plus溶液體積的異丙醇，室溫靜置10 min，12000 r/m in 4℃離心10 m in，棄掉上清液，用與RNAiso Plus溶液等量的75%乙醇清晰沉淀，7500 r/min 4℃離心5m in，棄上清保留沉淀，干燥(不可加熱)，溶解于30μlDEPC處理水中，測量光密 度(OD)260/280， 根 據 OD260計 算 RNA濃度，-80℃保存。

檢測步驟：GAP-43引物(F:CCCAAGCTTCCATGCTGTGCTGTATGAG;R:GGGTACCCTCAGGCATGTTCTTGGTC;上海生工生物技術有限公司合成)。進行Real TimeOne Step RT-PCR反應。Satge 1,2(反轉錄反應)：Reps：1，42℃5m in，95℃10 s；Stage 3 (PCR反應)：Reps：40，95℃5 s，60℃31 s；Stage 4(融解曲線分析)：Dissociation Protocol。

1.7Western blotting檢測磷酸化ERK1/2表達

取材方法同上。蛋白樣品40μg與等體積上樣緩沖液混合，煮沸10m in后進行100 g/L十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)、轉膜；加封閉液，室溫下震蕩2～3 h后，加入磷酸化ERK1/2單克隆抗體(北京中山生物公司，1∶2000)，4℃孵育過夜，用TBST洗膜，加標記的二抗，37℃孵育1 h后，再次TBST洗膜；ECL顯色，用圖像分析儀測定光密度。

1.8統(tǒng)計學分析

應用SPSS 17.0統(tǒng)計分析軟件對數據進行數據處理。組間分析采用析因設計資料的方差分析，組內分析采用SNK-q分析。數據以(±s)表示，顯著性水平α=0.05。

2　結果

2.1穿梭實驗檢測

與對照組相比，模型組動物的AARR顯著減小，PAL顯著延長(P＜0.001)，且至照射后28 d時，AARR 和PAL恢復跡象不明顯。與模型組相比，GSPE組動物的AARR顯著增大，PAL顯著縮短(P＜0.001)，且28 d時AARR和PAL恢復跡象明顯。見表1、表2。

表1　各組大鼠AARR比較(%)

表2　各組大鼠PAL比較(s)

2.2神經細胞形態(tài)結構的改變

對照組神經細胞形態(tài)結構正常，神經元胞體較大，胞核大而圓，核仁清晰。模型組可見神經細胞變性水腫，細胞輪廓模糊，亦可見部分死亡神經細胞，表現胞體收縮呈多角形或不規(guī)則。GSPE組神經細胞形態(tài)結構減輕，在高劑量組變化尤為明顯。見圖1。

2.3RT-PCR

采用2-△△Ct計算法來顯示實時定量PCR實驗中基因表達的相對濃度。與對照組比較，模型組7 d、14 d GAP-43mRNA表達水平顯著增高，28 d有所降低，但仍顯著高于對照組(P＜0.001)；與模型組比較，GSPE組中各時間點GAP-43mRNA表達水平進一步顯著增高，高表達狀態(tài)持續(xù)至28 d，在高劑量GSPE組變化尤為明顯(P＜0.001)。見表3。

圖1　各組大鼠海馬區(qū)神經元形態(tài)結構變化(光鏡，400×)

表3　各組大鼠海馬區(qū)GAP-43mRNA表達水平比較

2.4Western blotting

以β-actin校準后的蛋白條帶IOD值反映其蛋白水平。見圖2。與對照組比較，模型組7 d、14 d時間點磷酸化ERK1/2表達水平顯著增高，28 d有所降低，但仍高于對照組(P＜0.001)；與模型組比較，GSPE組中各時間點磷酸化ERK1/2表達水平進一步顯著增高，高表達狀態(tài)持續(xù)至28 d，在高劑量組變化尤為明顯(P＜0.05)。見表4。

圖2　Western blotting檢測各組大鼠海馬區(qū)磷酸化ERK 1/2蛋白表達

表4　各組大鼠海馬區(qū)磷酸化ERK 1/2蛋白表達水平比較

2.5相關分析

模型組中GAP-43 mRNA表達水平與磷酸化ERK1/2水平呈正相關(r=0.764,P＜0.001)。低劑量GSPE組和高劑量GSPE組中GAP-43mRNA表達水平與磷酸化ERK1/2水平呈正相關(r=0.814,0.822,P＜ 0.001)。

3　討論

GSPE是一種理想的天然抗氧化劑和自由基清除劑，具有抗腫瘤、抗輻射、抗衰老等多種藥理作用，對癌癥、心血管疾病等具有一定的治療作用，且作用機制多與其強大的抗氧化和自由基清除能力相關[9]。張國瑜等發(fā)現GSPE能夠促進肺癌細胞中半胱天冬酶-9、半胱天冬酶-3蛋白的表達，提示其可能通過線粒體通路促進癌細胞的凋亡，從而抑制其增殖[10]。

GSPE還具有一定的腦保護作用。目前GSPE腦保護作用的報道主要來自腦缺血、缺氧損傷。王紅陽等研究證實GSPE有提高阻塞性睡眠呼吸暫停模式下低氧大鼠腦組織耐受缺氧的作用，減輕大鼠腦組織結構損傷和學習、記憶障礙[11]。劉文倩的研究顯示GSPE可抑制腦缺血模型大鼠腦內5-羥色胺的含量，而改善動物學習行為[12]。亦有研究報道GSPE可抑制誘導型一氧化氮合酶(iNOS)的表達、抑制p8MAPK的激活及NF-кB向胞內移位而降低腦內的炎癥反應，發(fā)揮較強的腦保護作用[13]。本研究結果顯示，GSPE組大鼠學習記憶能力顯著改善，腦組織形態(tài)結構損傷減輕，說明GSPE對放射性腦損傷有較好的防治作用。

GAP-43是軸突生長因子的代表。腦損傷刺激后，未受損神經細胞大量合成GAP-43，可通過與胞內信息分子G蛋白等相互作用，提高興奮性氨基酸受體的反應性，釋放鈣調素，促使軸突側枝出芽和形成，允許神經元軸突繼續(xù)延伸，調控神經元細胞骨架的重新裝配，有利于神經通路的整合[14]。研究顯示，參芎化瘀膠囊可促使腦損傷后神經再生和神經功能恢復，其機制均與上調腦內GAP-43表達有關[15]。本研究結果顯示，GAP-43在GSPE組呈劑量依賴式增高，且高表達狀態(tài)時間延長，加之GSPE組動物學習記憶能力檢測指標的變化，提示GSPE對放射性腦損傷的防治作用與提高海馬區(qū)GAP-43活性有關。

ERK1/2是迄今MAPKs家族中研究最為深入的成員。ERK1/2激活可通過基因表達、蛋白合成等影響神經細胞增殖分化、突觸可塑性、軸突生長等，參與多種神經系統(tǒng)疾病發(fā)生發(fā)展[16]。如Zhong等發(fā)現外源性手段增加腦內神經生長因子均可擴大或強化神經細胞增殖和分化能力，以補充或替代損傷的神經細胞；而當條件性敲除ERK1/2通路基因，則不能誘導神經軸突生長[17]。

本研究結果顯示，磷酸化ERK1/2和GAP-43在GSPE組均呈劑量依賴式增高，且二者高表達時間都出現延長趨勢；相關分析顯示磷酸化ERK1/2和GAP-43在模型組和GSPE組均呈顯著正相關，說明GSPE通過調節(jié)ERK1/2信號途徑提高海馬區(qū)GAP-43活性。GSPE的基本作用是清除自由基和抗氧化，在此基礎上其神經保護機制包括改腦內能量代謝、改善微環(huán)境和微循環(huán)、抑制炎癥反應、抑制神經細胞凋亡等[18]。

本實驗結果表明，GSPE通過ERK1/2途徑提高放射性腦損傷大鼠海馬區(qū)GAP-43活性，減輕放射性腦損傷大鼠學習能力障礙，為GSPE抗腫瘤及抗輻射的應用中提供了一定的理論依據。

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Effect of Grape Seed Proanthocyanidin on Grow th Associated Protein-43 through Extracellular SignalRegulated Kinase1/2 Pathway in Ratswith Brain Radiation Injury

XIAO Ying1,LIU Yong-liang2
1.Tangshan Worker Hospital,Tangshan,Hebei 063000,China;2.Tangshan People's Hospital,Tangshan,Hebei 063000,China

Objective To observe the effectof grape seed proanthocyanidin extract(GSPE)on grow th associated protein-43(GAP-43) through extracellular signal regulated kinase 1/2(ERK1/2)pathway in rats with brain radiation injury.Methods 72 3-month male Sprague-Daw ley ratswere divided into controlgroup(n=18),modelgroup(n=18),high dose GSPE group(n=18)and low dose GSPE group (n=18).The brain radiation injury modelswere established by linear accelerator irradiation with 22 Gy.The learning ability was assessed with shuttle box.Themorphological changesof neurons in hippocampuswereobservedwith HE staining;theexpression of GAP-43was detected by RT-PCR;and the expression of phosphorylated ERK1/2 was detected by Western blotting.Results Compared with the model group,the active avoidance reaction rate in the shuttle box test increased and the passive avoidance latency shortened in GSPE groups(P＜ 0.001);the nerve cellmorphological injury reduced and the expression of GAP-43 mRNA and phosphorylated ERK1/2 increased in the GSPE groups(P＜0.001),especially in the high dose GSPE group(P＜0.001).The GAP-43mRNA levelpositively correlated with phosphorylated ERK1/2 level in themodelgroup(r=0.764,P＜0.001),the low dose GSPEgroup(r=0.814,P＜0.001)and thehigh dose GSPEgroup(r= 0.822,P＜0.001).Conclusion GSPE could promote the expression of GAP-43 through ERK1/2 pathway in rats,and prevent the brain from radiation injury.

brain radiation injury;learning;grow th associated protein-43;extracellular signal regulated kinase1/2;rats

10.3969/j.issn.1006-9771.2015.12.007

R651.1

A

1006-9771(2015)12-1397-05

河北省科技廳資助項目(No.1327776D)。

1.唐山市工人醫(yī)院，河北唐山市063000；2.唐山市人民醫(yī)院，河北唐山市063000。作者簡介：肖穎(1974-)，女，漢族，河北唐山市人，副主任醫(yī)師，主要研究方向：腦轉移癌的治療。通訊作者：劉永亮，男，碩士，主任醫(yī)師。E-mail:zyning789@126.com。

放射性腦損傷(brain radiation injury)是顱面頸區(qū)腫瘤放射治療后的常見并發(fā)癥。臨床報道，接受全腦照射并存活患者出現認知功能障礙的概率高達50%～90%，且認知障礙的程度往往與照射的劑量有關[1]，嚴重影響患者的生存質量。放射性認知損傷與電離輻射引發(fā)的神經發(fā)生障礙密切相關，促進突觸新生和重建藥物的研究和開發(fā)成為防治電離輻射腦損傷醫(yī)學研究的熱點。

生長相關蛋白-43(grow th associated protein-43, GAP-43)是一種神經生長相關蛋白，是目前國際公認的神經元再生突觸重塑的首選分子學標志。腦損傷狀態(tài)下，GAP-43在中樞神經系統(tǒng)特異性表達，位于新生和損傷后再生神經元的胞漿和軸突，在引導軸突生長和調節(jié)軸突形成新的聯(lián)系上起關鍵作用[2]。

胞外信號調節(jié)激酶1/2(extracellular signal regulated kinase 1/2,ERK1/2)是有絲分裂原活化蛋白激酶(m itogen-activated protein kinases,MAPKs)家族重要組成部分，活化后經多級激酶的級聯(lián)反應把細胞外刺激信號向細胞內傳遞，與神經可塑性密切相關[3]。

葡萄籽原花青素(grape seed proanthocyanidin extract,GSPE)是一種從葡萄籽中提取出的生物類黃酮物質。此類物質具有多電子的羥基，均以雙鍵共軛，使得電子在分子中得以穩(wěn)定；采用化學發(fā)光法和細胞色素C還原法檢測GSPE清除超氧陰離子和羥基自由基的能力，結果顯示與維生素E清除超氧陰離子和羥基自由基的能力比較，50mg/L的GSPE清除超氧陰離子和羥基自由基的能力分別達84%和98%，較維生素C分別高43.9%和57.5%[4]。目前GSPE已逐漸應用到高血壓、動脈粥樣硬化及腦血管疾病等防治中，并取得較好的治療效果[5-6]。

本研究建立放射性腦損傷模型，觀察GAP-43及ERK1/2活性變化，初步探討GSPE防治放射性腦損傷認知障礙的作用機制。

2015-08-19

2015-10-15)