膽管上皮細胞TLR3內(nèi)源性活化在原發(fā)性膽汁性肝硬化炎性損傷中的作用

蔣廷旺，熊懷民，張紅星，許國華，許曄瓊

（常熟市醫(yī)學檢驗所，江蘇常熟215500）

膽管上皮細胞TLR3內(nèi)源性活化在原發(fā)性膽汁性肝硬化炎性損傷中的作用

蔣廷旺，熊懷民，張紅星，許國華，許曄瓊

（常熟市醫(yī)學檢驗所，江蘇常熟215500）

目的：研究內(nèi)源性雙鏈RNA活化人肝內(nèi)膽管上皮細胞（human intrahepatic bi1iary epithe1ia1 ce11s，HiBEC）中To11樣受體3（To11-1ike receptor 3，TLR3）引起的凋亡及其信號通路變化。方法：體外培養(yǎng)HiBEC，同時通過反復凍融制備壞死的HiBEC。TLR3活化組：將死亡細胞與活細胞共同培養(yǎng)6 h；對照組：以核酸酶處理過的壞死細胞與活細胞共培養(yǎng)，每組設(shè)3復孔。以Annexin V/PI測定細胞凋亡率，同時以JC-1熒光探針測定細胞線粒體膜電位。熒光定量PCR法檢測TLR3和β干擾素To11樣受體結(jié)構(gòu)域銜接蛋白（To11-inter1eukin 1 receptor domain-containing adaptor inducing interferon-β，TRIF）的表達量，同時以流式細胞術(shù)測定Caspase-3的活性。結(jié)果：TLR3活化組的HiBEC經(jīng)內(nèi)源性活化后，凋亡率為（33.32±2.39）％，明顯高于通過RNA酶處理后的對照組［（2.83±0.53）％，P＜0.001）；線粒體膜電位檢測結(jié)果表明，TLR3活化組的HiBEC經(jīng)內(nèi)源性活化后，表達綠色熒光的細胞比例明顯增加，均值為（34.75± 6.54）％，明顯高于RNA酶處理后的對照組［（3.21±1.24）％，P＜0.001）；定量PCR分析發(fā)現(xiàn)TLR3活化組的TLR3和TRIF mRNA相對表達量分別為3.75±0.22和4.05±0.14，均明顯高于對照組（分別為0.98±0.05和1.03±0.07，P＜0.001）；流式細胞術(shù)檢測結(jié)果顯示，TLR3活化組細胞Caspase-3的平均表達量為（27.1±3.5）％，明顯高于RNA酶處理組［（8.5±2.1）％，P＜0.001）。結(jié)論：內(nèi)源性雙鏈RNA可以通過活化TLR3誘導HiBEC凋亡，可能在原發(fā)性膽汁性肝硬化的炎性損傷過程中發(fā)揮重要作用。

原發(fā)性膽汁性肝硬化；膽管上皮細胞；To11樣受體3；內(nèi)源性

原發(fā)性膽汁性肝硬化（primary bi1iary cirrhosis，PBC）的早期病理改變?yōu)楦蝺?nèi)膽管上皮細胞（human intrahepatic bi1iary epithe1ia1 ce11s，HiBEC）周圍的炎性細胞浸潤，隨著疾病的進展，肝內(nèi)小膽管進行性消失，最終引起肝硬化和肝衰竭［1］。一直以來眾多學者始終將HiBEC在PBC中作為一個被動的“受害者”看待，僅注意到自身反應性T細胞、NK細胞等直接效應作用導致HiBEC的凋亡［2］，忽視了其主動參與免疫調(diào)節(jié)的能力。膽管上皮細胞可以表達多種To11樣受體（To11 1ike receptor，TLR）及黏附分子，并通過分泌細胞因子、趨化因子等參與炎癥反應的免疫調(diào)節(jié)［3］。但是HiBEC在PBC中具有怎樣的調(diào)節(jié)作用尚缺乏相關(guān)研究。

TLR是一類介導天然免疫的跨膜信號傳遞受體家族，在細胞活化信號的轉(zhuǎn)導中發(fā)揮重要作用，是聯(lián)系天然免疫與適應性免疫的橋梁［4］。近年來，研究表明TLR介導的天然免疫在PBC的HiBEC炎性損傷過程中同樣具有重要意義［5-6］。TLR3是TLR家族中的重要成員，不僅在宿主抗病毒過程中具有重要作用，而且還與一些自身免疫病的發(fā)生存在密切關(guān)系。雙鏈RNA（doub1e-stranded RNA，dsRNA）是TLR3所識別的病原相關(guān)分子模式（pathogen-associated mo1ecu1ar patterns，PAMP），多種病毒在復制期間可以產(chǎn)生大量的dsRNA，因此，TLR3可以作為機體抗病毒的重要防線。然而，近期的研究發(fā)現(xiàn)壞死細胞釋放的RNA或體外轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生的mRNA同樣可以活化TLR3，提示體內(nèi)壞死組織釋放的RNA可以作為TLR3的內(nèi)源性配體啟動或調(diào)節(jié)免疫應答［7-8］。由于大部分自身免疫病并未發(fā)現(xiàn)與病毒感染具有直接聯(lián)系，因此，內(nèi)源性配體對TLR3的活化在自身免疫病的發(fā)病機制中可能具有更為重要的意義。

為此，我們通過反復凍融HiBEC模擬PBC中壞死的膽管上皮細胞，并以其釋放的內(nèi)源性dsRNA活化其他HiBEC的TLR3，觀察HiBEC在此過程中的凋亡及其信號通路變化。

1 材料與方法

1.1 材料

HiBEC（Science11公司，美國），胎牛血清、RPMI 1640培養(yǎng)基（Hyc1one公司，美國），谷氨酰胺、Benzonase核酸酶（Sigma公司，美國），線粒體膜電位檢測試劑盒、細胞固定/破膜液、Caspase-3抗體（BD bioscience公司，美國），RNA提取試劑盒（Qiagen公司，美國），Annexin V/PI（Bender MedSystems，澳大利亞）。FACSCa1ibur流式細胞儀（BD公司，美國），PCR分析儀（ABI公司，美國），超凈工作臺（蘇州凈化設(shè)備廠）；細胞培養(yǎng)箱（BeckMan公司，美國）。

1.2 方法

1.2.1 HiBEC的培養(yǎng)及內(nèi)源性活化 將HiBEC在37℃，5％CO2條件下培養(yǎng)于RPMI 1640完全培養(yǎng)基中（10％胎牛血清，50 μg/mL青霉素，2 mmo1/L谷氨酰胺，10 mmo1/L HEPES）。壞死細胞的制備參考文獻［7］中的方法，即將一定數(shù)目的HiBEC反復凍融4次后制備死亡細胞。將死亡細胞與培養(yǎng)的HiBEC按照2∶1的比例，在4℃條件下共同孵育6 h，作為TLR3活化組；以Benzonase核酸酶處理的死亡細胞和HiBEC共培養(yǎng)作為對照組，每組設(shè)3個復孔。再次37℃，5％CO2培養(yǎng)36 h。

1.2.2 流式細胞術(shù)檢測HiBEC的凋亡率 收集細胞，預冷PBS洗滌后以結(jié)合緩沖液［50 mmo1/L三羥甲基氨基甲烷（Tris），100 mmo1/L NaC1，1％BSA，0.02％疊氮化鈉，pH 7.4）重懸細胞并調(diào)節(jié)細胞密度至5×105/mL；195 μL細胞懸液中加入5 μL Annexin-V，室溫放置10 min；洗滌后再以190 μL結(jié)合緩沖液重懸，加入10 μL 20 μg/mL PI；流式細胞儀測定細胞凋亡率，Annexin V-/PI+、Annexin V+/ PI-、Annexin V+/PI+分別表示死細胞、早期凋亡細胞和晚期凋亡細胞。

1.2.3 線粒體膜電位分析 收集培養(yǎng)的細胞以預冷的PBS洗滌后，重懸至1×106/mL；每個15 mL離心管中加入1 mL細胞懸液，室溫400×g離心5 min，棄上清；每管加入0.5 mL新鮮配制的JC-1工作液，充分混勻后置于37℃的CO2培養(yǎng)箱孵育15 min；按照以下步驟洗滌細胞2次：第1次，每管加2 mL 1×分析液，輕輕振蕩懸浮細胞并使其分散，以免聚集成塊。400×g，室溫離心5 min，棄上清；第2次，每管加1 mL1×分析液，振蕩或用槍頭使細胞懸浮分散，以免聚集成塊。400×g，室溫離心5 min，棄上清；每管加0.5 mL 1×分析液，輕輕懸浮細胞，以流式細胞儀進行檢測分析。綠色熒光說明線粒體膜電位下降，細胞很可能處于凋亡早期；紅色熒光說明線粒體膜電位正常，細胞未發(fā)生凋亡，用紅綠熒光的相對比例來表示細胞膜電位變化。

1.2.4 定量PCR檢測HiBEC中TLR3、β干擾素To11樣受體結(jié)構(gòu)域銜接蛋白（To11-inter1eukin 1 receptor domain-containing adaptor inducing interferonβ，TRIF）mRNA的表達 收集各組細胞，抽提細胞總RNA，根據(jù)基因庫中人TLR3、TRIF和β-肌動蛋白的mRNA序列合成引物，以SYBR-Green法定量分析上述基因表達。TLR3上游引物：5′-TGAGTTAGATATGCGCTTTA-3′，下游引物：5′-TCAGGGATGTTGGTATGG-3′；TRIF上游引物：5′-CAAGCCGTGCCCACCTACT-3′，下游引物：5′-TGTTCCGATGATGATTCCAG-3′；β-肌動蛋白上游引物：5′-GAAATCTGTCAAAGTTCA-3′，下游引物：5′-AGGCAGCTCGTAGCTCTT-3′。將總RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA，反應條件：25℃10 min、48℃30 min、95℃5 min。在ABI Prism7000定量PCR儀上進行擴增，讀取閾循環(huán)值（thresho1d cyc1e，Ct），根據(jù)公式：ΔCt=目的基因Ct-內(nèi)參基因Ct和ΔΔCt=研究組ΔCt-對照組ΔCt，計算出2-ΔΔCt。

1.2.5 流式細胞術(shù)檢測Caspase-3活性 按照每個測試樣本加入100 μL Perm/Wash緩沖液和20 μL抗體，計算抗體和Perm/Wash緩沖液用量。根據(jù)用量制備Perm/Wash緩沖液（1×），將10×濃度緩沖液使用蒸餾水進行10倍稀釋；用冷PBS緩沖液洗細胞2次，再用細胞固定/破膜液調(diào)整細胞密度為1×106/0.5 mL；細胞冰浴20 min；離心，棄上清；室溫下，使用1×Perm/Wash緩沖液洗細胞2次，Perm/Wash緩沖液的用量為每1×106細胞0.5 mL；按樣本數(shù)加入1×Perm/Wash緩沖液和抗體，混勻，室溫反應30 min；每管用1.0 mL1×Perm/Wash緩沖液洗細胞1次，再用0.5 mL的1×Perm/Wash緩沖液制成細胞懸液，應用流式細胞儀檢測Caspase-3活性。

1.3 統(tǒng)計學分析

應用SPSS 17.0軟件進行統(tǒng)計分析，所有資料均為計量資料，采用兩樣本等方差t檢驗進行比較，P＜0.05表示差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 內(nèi)源性RNA誘導HiBEC凋亡

HiBEC與反復凍融后的細胞裂解液共培養(yǎng)后的凋亡率為（33.32±2.39）％，而通過RNA酶處理后的對照組凋亡率為（2.83±0.53）％，兩組間差異有統(tǒng)計學意義（t=21.62，P＜0.001）。見圖1。

A：TLR3活化組；B：RNA酶處理組圖1 內(nèi)源性RNA誘導HiBEC凋亡

2.2 線粒體膜電位

流式細胞術(shù)檢測結(jié)果顯示，TLR3活化組HiBEC線粒體膜電位發(fā)生明顯改變，表達綠色熒光的細胞比例明顯增加，平均為（34.75±6.54）％，明顯高于RNA酶處理后的對照組［（3.21±1.24）％］，兩組間差異有統(tǒng)計學意義（t=17.21，P＜0.001）。

2.3 兩組細胞TLR3和TRIF mRNA的表達水平

定量PCR分析結(jié)果顯示，TLR3活化組細胞的TLR3 mRNA和TRIF mRNA相對表達量分別為3.75± 0.22和4.05±0.14，明顯高于RNA酶處理后的對照組［TLR3 mRNA為0.98±0.05，t=17.56，P＜0.001；TRIF mRNA為1.03±0.07，t=28.86，P＜0.001）］。

2.4 各組細胞Caspase-3的活性

流式細胞術(shù)檢測結(jié)果顯示，TLR3活化組細胞Caspase-3陽性率為（27.1±3.5）％，明顯高于對照組［（8.5±2.1）％，t=6.56，P＜0.001）］。見圖3。

圖3 HiBEC體外作用后Caspase-3的活化

3 討論

TLR3在PBC及其他膽汁淤積相關(guān)疾病中的作用近年來備受關(guān)注。Shimoda等［9］通過分離PBC患者肝組織單個核細胞、單核細胞、NK細胞及膽管上皮細胞進行體外實驗，發(fā)現(xiàn)TLR3與TLR4共同作用下，NK細胞對HiBEC的殺傷作用明顯增強。但是該研究并未說明HiBEC是否主動參與及如何參與PBC的炎性損傷過程。Harada等［10］通過分離膽汁淤積患者HiBEC進行po1yIⅠ：C體外誘導實驗，證實po1y：C可以明顯上調(diào)膽管上皮細胞表面腫瘤壞死因子凋亡相關(guān)配體（TRAIL）的表達，并促進Hi-BEC的凋亡。我們前期將po1yI：C注射到C57BL/6小鼠腹腔，在國內(nèi)率先建立了PBC小鼠模型；發(fā)現(xiàn)16周后小鼠肝內(nèi)匯管區(qū)出現(xiàn)明顯的炎性細胞浸潤，同時血清出現(xiàn)抗線粒體抗體、抗核抗體等自身抗體［11］。我們的研究結(jié)果提示，po1yI：C活化的TLR3信號途徑可能在PBC的病理改變及疾病進程中具有重要作用。然而，po1yI：C是一種模擬dsRNA的外源性TLR3活化物質(zhì)，PBC患者體內(nèi)是否能夠產(chǎn)生內(nèi)源性dsRNA同樣活化TLR3參與炎癥反應？

為此，我們在體外通過反復凍融制備壞死的HiBEC，然后與正常HiBEC共培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)HiBEC出現(xiàn)明顯的凋亡。由于線粒體膜電位降低是細胞發(fā)生凋亡的標志性事件，因此為了進一步驗證其凋亡作用，本研究進一步分析了細胞膜電位，發(fā)現(xiàn)TLR3活化組細胞的膜電位明顯降低，且改變比例與凋亡結(jié)果相符合。HiBEC是PBC病理改變最早侵犯的組織細胞，這一結(jié)果說明在PBC患者肝組織出現(xiàn)病變后，HiBEC發(fā)生壞死或凋亡所釋放的內(nèi)源性RNA可以通過TLR3途徑進一步活化周邊正常上皮細胞，促進炎癥反應，進而導致PBC病情惡化。國外多項研究表明，壞死細胞提取物可通過TLRs活化樹突狀細胞，促進其表型改變及細胞因子的分泌［7］。然而對于HiBEC是否存在類似的生物學效應目前尚不明確，我們的研究證實了該作用的存在。

大量的研究表明，TLR3除通過誘導產(chǎn)生多種細胞因子參與免疫調(diào)節(jié)之外，還可以直接誘導細胞凋亡。TLR3有兩條信號通路，一條是髓樣細胞分化因子88（MyD88），另一條是TLR3獨有的MyD88非依賴信號通路。通過MyD88信號通路可以激活絲裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase，MAPK）和NK-κB，最終引起TNF-α、IL-6等細胞因子的表達，參與炎癥反應。MyD88非依賴性信號通路是通過TIR區(qū)域的調(diào)節(jié)分子1（也稱為TRIF）傳遞信號，通過活化IFN調(diào)節(jié)因子3（IRF3）誘導產(chǎn)生IFN-β［12］。本研究結(jié)果顯示，TLR3活化組HiBEC的TLR3和TRIF mRNA表達量均明顯增加，更加明確了HiBEC的凋亡和線粒體膜電位的改變是由TLR3通路引起的，并且該通路是通過MyD88非依賴途徑，經(jīng)由TRIF信號分子進行下游活化，進而導致細胞凋亡和膜電位變化。

Caspase-3是早期凋亡信號通路中的關(guān)鍵分子，產(chǎn)生時以非活化的前體形式存在，當?shù)蛲霭l(fā)生時，經(jīng)其他蛋白酶水解后轉(zhuǎn)化為有活性的Caspase-3。我們以流式細胞術(shù)分析其生物活性，發(fā)現(xiàn)經(jīng)死亡Hi-BEC作用后，表達Caspase-3的細胞明顯增加，而對照組則沒有明顯改變。這證明TLR3內(nèi)源性活化引起的凋亡是通過Caspase-3途徑完成的，進一步明確了凋亡發(fā)生的信號途徑。

綜上，本研究證實了PBC患者的膽管上皮細胞受損后釋放的內(nèi)源性RNA可通過活化其他正常細胞TLR3促進炎癥反應，該作用主要表現(xiàn)為誘導凋亡，而且凋亡的發(fā)生是通過MyD88非依賴途徑完成。這對進一步明確PBC發(fā)病機制及其今后的生物治療具有提示意義。

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Roles of endogenous activation of TLR3 in primary biliary cirrhosis

JIANG Ting-wang，XI0NG Huai-min，ZHANG Hong-xing，XU Guo-hua，XU Ye-qiong
（Changshu Municipa1 Institution for Laboratory Medicine，Changshu Jiangsu 215500，China）

Objective：To investigate apoptosis induced by endogenous doub1e-stranded RNA（dsRNA）activating TLR3 and the fo11owing signa1 pathway in human intrahepatic bi1iary epithe1ia1 ce11s（HiBEC）. Methods：HiBEC were cu1tured in vitro，and necrotic ce11s were prepared by freeze-thawing the ce11s four times.HiBEC were co-cu1tured with necrotic ce11s in TLR3-activation group for 6 h.Necrotic ce11s incubated with Benzonase were used as contro1s.Ce11s apoptosis was determined by using annexin V/PI.Changes of mitochondria1 membrane potentia1 were assayed by JC-1.TLR3 and To11-inter1eukin 1 receptor domaincontaining adaptor inducing interferon-β（TRIF）were ana1yzed by qPCR.Activity of Caspase-3 in HiBEC was ana1yzed by f1ow cytometry.Results：Percentages of apoptotic HiBEC in TLR3-activation and contro1 group were（33.32±2.39）％and（2.83±0.53）％，respective1y（P＜0.001）.Ratio of HiBEC with green f1uorescence in TLR3-activation group was（34.75±6.54）％，obvious1y higher than that in contro1 group［（3.21±1.24）％，P＜0.001）］.Re1ative expression of TLR3 and TRIF mRNA were 3.75±0.22 and 4.05±0.14 in TLR3-activation group，0.98±0.05 and 1.03±0.07 in contro1 group（P＜0.001）. The average Caspase-3 expression in TLR3-activation group was（27.1±3.5）％，more than that in contro1 group（8.5±2.1）％（P＜0.001）.Conclusion：Endogenous RNA cou1d induce HiBEC apoptosis by acti-vating TLR3 pathway，which may p1ay important ro1es in porta1 inf1ammation in primary bi1iary cirrhosis.

primary bi1iary cirrhosis；bi1iary epithe1ia1 ce11s；To11-1ike receptor 3；endogenous

R575.2

A

1671-7783（2015）06-0472-05

10.13312/j.issn.1671-7783.y150182

2015-08-24 ［編輯］ 陳海林

國家863計劃資助項目（2014AA022304）；常熟市科技發(fā)展計劃社會發(fā)展項目（CS201313）

蔣廷旺（1981—），男，江蘇新沂人，助理研究員，博士，主要從事自身免疫性肝病、病毒性肝炎的發(fā)病機制及實驗室診斷研究。