細胞外基質(zhì)磷酸化糖蛋白基因啟動子的構(gòu)建及初步研究

宮春梅, 張娟娟, 夏天永, 孫 巖

(山東 濰坊 261042: 1. 濰坊醫(yī)學院口腔醫(yī)學院; 2. 濰坊口腔醫(yī)院)

細胞外基質(zhì)磷酸化糖蛋白基因啟動子的構(gòu)建及初步研究

宮春梅1, 張娟娟1, 夏天永2, 孫 巖1

(山東 濰坊 261042: 1. 濰坊醫(yī)學院口腔醫(yī)學院; 2. 濰坊口腔醫(yī)院)

目的: 研究細胞外基質(zhì)磷酸化糖蛋白(MEPE)基因啟動子在小鼠前成骨細胞中表達的調(diào)控機制。方法：利用軟件分析小鼠的MEPE基因啟動子，得到5條啟動子候選序列后，設計引物進行不同長度MEPE基因啟動子的構(gòu)建，并分別將其轉(zhuǎn)染小鼠前成骨細胞；然后利用雙熒光素酶基因檢測報告系統(tǒng)分析不同長度MEPE基因啟動子在前成骨細胞中的轉(zhuǎn)錄活性，并同時觀察BPM2對小鼠前骨細胞中不同長度MEPE基因啟動子轉(zhuǎn)錄活性的影響及其時間效應。結(jié)果：成功構(gòu)建了P- 78～+66、P-140～+66、P-300～+66、P-500～+66、P-1 081～+66的MEPE基因啟動子；分別轉(zhuǎn)染小鼠前成骨細胞后，不同長度MEPE基因啟動子的活性兩兩相比均有顯著性差異(P<0.05)，其中以P-500～+66的活性最強，推測-140～-500區(qū)域可能為MEPE轉(zhuǎn)錄表達的調(diào)控元件主要結(jié)合部位； BMP2作用于不同長度MEPE基因啟動子后檢測發(fā)現(xiàn)，BMP2在啟動子-140～-500區(qū)域內(nèi)可明顯上調(diào)MEPE基因的轉(zhuǎn)錄活性(P<0.05)。結(jié)論：成功構(gòu)建了MEPE基因啟動子，并發(fā)現(xiàn)BMP2調(diào)控MEPE基因啟動子的主要區(qū)域在-140～-500區(qū)域 。

細胞外基質(zhì)磷酸化糖蛋白; 基因克隆; 骨形成發(fā)生蛋白2; 雙熒光素酶基因檢測

[DOI] 10.15956/j.cnki.chin.j.conserv.dent.2015.09.002

[Chinese Journal of Conservative Dentistry,2015,25(9):519]

骨質(zhì)疏松癥是全身性骨骼疾病，也是目前世界上發(fā)病率及醫(yī)療資源消耗較大的疾病之一。據(jù)統(tǒng)計，半數(shù)以上的婦女和大約1/3的男性在其生存期內(nèi)會發(fā)生骨質(zhì)疏松性骨折[1-2]。細胞外基質(zhì)磷酸糖蛋白(MEPE)在骨的礦化和吸收、骨細胞與破骨細胞的平衡中起重要的作用，其表達異?？蓪е鹿墙M織鈣磷代謝異常，從而導致疾病的發(fā)生。研究表明，MEPE 蛋白在骨的礦化調(diào)節(jié)方面具有雙重性。David等[3]報道，MEPE過表達的小鼠表現(xiàn)為骨形成和礦化減少，提示MEPE具有抑制礦化的作用。Nampei 等[4]通過免疫組化分析發(fā)現(xiàn)， MEPE主要在人的骨細胞中表達，尤其在嵌入骨陷窩中的鈣化骨細胞內(nèi)表達量高，提示MEPE具有促進礦化的作用。目前對MEPE的調(diào)控機制研究甚少，只有Cho YD等[5]通過體外研究發(fā)現(xiàn)，在MC3T3- E1細胞中BMP2可通過Runx2、Dlx5和Smads顯著上調(diào)MEPE表達。本實驗通過構(gòu)建MEPE基因啟動子，并初步探討了BMP2調(diào)控MEPE基因的機制；旨在從分子通路方面揭示MEPE的功能及其調(diào)控機制，以期為骨質(zhì)疏松癥的治療提供新的思路。

1 材料和方法

1.1主要材料

小鼠前成骨細胞(第四軍醫(yī)大學)；pMD18- T Simple Vector、RNAiso Plus、M- MLV RTase cDNA Synthesis Kit、PrimeSTAR HS DNA Polymerase、T4 DNA Ligase(大連TaKaRa公司)；pcDNA3.1(+)/myc- hisA真核表達載體(invitrogen，美國)；UNIQ- 10 柱式DNA膠回收試劑盒、UNIQ- 10柱式質(zhì)粒小量抽提試劑盒(上海Bio Basic Inc公司)；KpnI、XhoI 、TransFastTMTransfection Reagent、Dual-Luciferase?雙熒光素酶報告基因檢測(Promega，美國)；質(zhì)粒中抽試劑盒(QIA- GEN，美國)；胎牛血清(杭州四季青)；DMEM培養(yǎng)基、胰蛋白酶(Hyclone，美國)。

1.2 方法

1.2.1 不同長度重組質(zhì)粒pGL3- MEPE基因啟動子的構(gòu)建

首先利用軟件(http://www.fruitfly.org/seq_tools/promoter.html)對小鼠MEPE基因轉(zhuǎn)錄起始點上游3 000 bp進行預測分析，并得到5條啟動子候選序列；然后再根據(jù)Genbank 中登記的小鼠MEPE啟動子序列及引物設計原則，利用Primer Premier 5.0進行引物設計，并將上下游分別引入限制性內(nèi)切酶KpnⅠ和XhoⅠ酶切位點(表1)。引物合成(大連TaKaRa公司)后，以本實驗室保存的重組質(zhì)粒pMD18- T- MEPE基因啟動子大片度(啟動子長度為2 217 bp)為模板，分別PCR擴增小鼠MEPE基因不同長度的啟動子片段，PCR擴增條件為: 98 ℃、2 min 1個循環(huán)； 98 ℃、10 s,52～60 ℃梯度溫度15 s,72 ℃、3 min 32個循環(huán)；最后72 ℃、10 min 1個循環(huán)。PCR產(chǎn)物經(jīng)DNA瓊脂糖凝膠電泳后，用UNIQ- 10柱式PCR產(chǎn)物回收試劑盒進行回收純化?；厥占兓腜CR產(chǎn)物經(jīng)Taq酶72 ℃處理15 min后，在產(chǎn)物平滑末端加poly- A，并連接于 pMD18- T Simple載體，并將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化入感受態(tài)細胞E.coli DH5α；然后挑取單克隆，置于37 ℃下振蕩培養(yǎng)后進行質(zhì)粒小量提取。提取的質(zhì)粒經(jīng)KpnI和XhoI酶切鑒定后，送南京金斯瑞公司進行測序。

表1 MMP- 20不同長度啟動子PCR引物及反應條件

1.2.2 不同長度重組pGL3- MEPE- promoter在前成骨細胞系的熒光素酶活性分析

將小鼠前成骨細胞接種于含100 mL/L胎牛血清的α- MEM培養(yǎng)基，并在37 ℃、50 mL/L CO2條件下進行培養(yǎng)及傳代。轉(zhuǎn)染前24 h取傳至4代以上的小鼠前成骨細胞，用2.5 g/L胰蛋白酶消化后以 6 000/cm2的密度接種于24孔板，繼續(xù)培養(yǎng)20 h 至細胞長至75%～85%時，按照TransFastTMTransfection Reagent試劑盒說明進行瞬時轉(zhuǎn)染，并以pGL3- Basic為陰性對照、pGL3- Control為陽性對照、pRL質(zhì)粒作為內(nèi)參照。實驗分為4大組，組1：pGL3- Basic；組2：pGL3- Control；組3：pGL3- MEPE；組4設5個小組，分別為：pGL3- Basic-P-78～+66、pGL3-Basic-P-140～+66、pGL3-Basic-P-300～+66、pGL3-Basic-P-500～+66、pGL3-Basic- P-1 081～+66。將構(gòu)建的pGL3-MEPE、pGL3-Basic 、pGL3-Control質(zhì)粒各800 ng分別與pRL- TK質(zhì)粒(16 ng)共轉(zhuǎn)染前成骨細胞后，按照雙熒光素酶報告基因檢測試劑盒說明檢測各組的熒光素酶活性。具體方法如下：取各組細胞用PBS洗滌1次后，加入細胞裂解液PLB裂解細胞15 min；每組各取20 μL細胞裂解液分別與100 μL的Luciferase Assay ReagentⅡ(LARⅡ)一并置于加樣管中，充分混勻后用Berthold DS化學發(fā)光儀檢測10 s時螢火蟲熒光素酶(Firefly luciferase)激發(fā)底物釋放熒光的數(shù)值(U1)；然后在每管中各加入100 μL的Stop&Glo Reagent，檢測海腎熒光素酶(Renilla luciferase)激發(fā)底物釋放熒光的數(shù)值(U2)。以每一樣品U1/U2值作為該質(zhì)粒報告基因的熒光素酶相對活性。每組兩個復孔，每次實驗重復3次。本實驗所測的pGL3- Basic組的U1/U2值為0.02，pGL3- Control組的U1/U2值為287，后敘圖中不再單獨列出。

1.2.3 雙熒光素酶報告基因檢測BMP2對前成骨細胞中MEPE基因不同長度啟動子轉(zhuǎn)錄活性的影響

取傳至4代以上的小鼠前成骨細胞以6 000/cm2的密度接種于24孔板，常規(guī)條件下培養(yǎng)24 h后按1.2.2進行分組，并用800 ng的 pGL3-MEPE、pGL3- Basic、pGL3- Control質(zhì)粒分別與 16 ng的pRL- TK質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染前成骨細胞；細胞培養(yǎng)30 h后，更換含BMP2終濃度為50 ng/mL無血清α- MEM培養(yǎng)液(同時設空白對照組并加入PBS緩沖液)繼續(xù)培養(yǎng)。培養(yǎng)12 h后收集各組細胞進行裂解，并參照雙熒光素酶報告基因檢測試劑盒說明進行檢測(具體方法同1.2.2)，實驗重復3次。

1.2.4 雙熒光素酶報告基因檢測BMP2作用不同時間對前成骨細胞中MEPE基因啟動子轉(zhuǎn)錄活性的影響

800 ng的pGL3- Basic-P-500～+66轉(zhuǎn)染前成骨細胞30 h后，按上述方法加入BMP2繼續(xù)培養(yǎng)。分別于培養(yǎng)后1、3、6、12、24 h各時間點收集各組細胞(空白對照在PBS緩沖液中培養(yǎng)6 h后收集細胞)進行裂解，并參照雙熒光素酶報告基因試劑盒說明進行檢測(具體方法同上)，實驗重復3次。

1.3 統(tǒng)計學分析

采用SPSS 13.0軟件進行統(tǒng)計分析，組間比較用配對t檢驗，檢驗水準α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 不同長度重組質(zhì)粒pGL3- MEPE基因啟動子的構(gòu)建

PGL3- Basic載體和經(jīng)測序正確的重組質(zhì)粒pMD18- T Simple- Promoter(圖1)分別用KpnⅠ和XhoⅠ進行雙酶切后割膠回收?；厥盏膒GL3- Basic載體與小鼠MEPE基因不同長度的啟動子片段進行連接后，轉(zhuǎn)化感受態(tài)細胞E.coli DH5α；然后挑取單克隆進行小量質(zhì)粒提取，并用KpnⅠ和XhoⅠ進行酶切鑒定。鑒定結(jié)果顯示，成功構(gòu)建了5條不同長度的MEPE基因啟動子，分別命名為pGL3- MEPE-P-78～+66、pGL3-MEPE-P-140～+66、pGL3-MEPE-P-300～+66、pGL3-MEPE-P-500～+66、 pGL3-MEPE-P-1 081～+66，統(tǒng)稱為pGL3-MEPE-promoter(圖2)。

M為Marker;1、2、3、4分別為目的條帶144、206、366、566bpM為Marker;1為目的條帶1147bp

圖1 MEPE 基因不同長度啟動子PCR擴增結(jié)果

a: M為Marker；1～3為pGL3 KpnI和XhoI雙酶切; 1可見144 bp小片段及4 818 bp大片段; 2可見206 bp小片段及4 818 bp大片段; 3可見366 bp小片段及4 818 bp大片段; 4為構(gòu)建成功的質(zhì)粒;

b: M為marker; 1為pGL3 KpnI和XhoI雙酶切，可見566 bp小片段及4 818 bp大片段; 2為構(gòu)建成功的質(zhì)粒;

c: M為marker; 1為pGL3 KpnI和XhoI雙酶切，可見1 147 bp小片段及4 818 bp大片段

圖2 MEPE不同長度啟動子連接pGL3-Basic

后的重組質(zhì)粒酶切鑒定結(jié)果

2.2 不同長度重組pGL3- MEPE- promoter在前成骨細胞中的熒光素酶活性比較

熒光素酶活性分析結(jié)果顯示：前成骨細胞中不同長度MEPE啟動子活性兩兩相比均有顯著性差異(P<0.05)，由高到低依次為pGL3- MEPE-P-500～+66>pGL3-MEPE-P-300～+66>pGL3-MEPE-P-78～+66>pGL3-MEPE-P-1 081～+66>pGL3-MEPE-P-140～+66；其中從pGL3-MEPE-P-500～+66到pGL3- MEPE-P-1 081～+66的相對熒光素酶活性下降幅度最大，從pGL3-MEPE -P-140～+66到pGL3- MEPE-P-300～+66的相對熒光素酶活性上升幅度最大(P<0.05)；pGL3- MEPE-P-78～+66雖然只有144 bp，但啟動子活性相對較強，并且在轉(zhuǎn)錄起始位點附近(圖3)。以上結(jié)果說明，MEPE的核心啟動子在-78～+66區(qū)域，啟動子-500～-1 081區(qū)域為下調(diào)MEPE轉(zhuǎn)錄表達的調(diào)控元件的主要結(jié)合部位，而啟動子-140～-500區(qū)域則為上調(diào)MEPE轉(zhuǎn)錄表達的調(diào)控元件主要結(jié)合部位。

圖3 不同長度MEPE基因啟動子在小鼠前

2.3 BMP2對不同長度小鼠MEPE基因啟動子轉(zhuǎn)錄活性的影響

BMP2作用于不同長度小鼠MEPE基因啟動子12 h后，雙熒光素酶報告基因檢測其轉(zhuǎn)錄活性的變化發(fā)現(xiàn)，BMP2對MEPE基因啟動子中(-300～+66)366 bp、(-500～+66)566 bp片段的活性表達均有明顯促進作用(P<0.05)，而對其余長度啟動子片段的上調(diào)作用不顯著(P>0.05)(圖4)。根據(jù)以上結(jié)果推測，BMP2調(diào)控MEPE基因啟動子的反應區(qū)段應該在啟動子-140～-500之間，所以接下來的實驗采用pGL3-MEPE-P-500～+66 進行研究。

圖4 BMP2對小鼠MEPE基因不同

2.4 BMP2作用不同時間對(-500～+66)566 bp片段MEPE基因啟子動轉(zhuǎn)錄活性的影響

BMP2作用于(-500～+66)566 bp片段1～24 h后，雙熒光素酶報告基因檢測其轉(zhuǎn)錄活性的變化發(fā)現(xiàn)，在6、12 h時， MEPE基因啟動子的轉(zhuǎn)錄活性最高，與其他時間點相比差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，12 h與6 h相比差異不顯著(P>0.05)(圖5)。

圖5 BMP2作用不同時間對小鼠MEPE

3 討論

骨質(zhì)疏松癥是以骨量減少和(或)骨組織微細結(jié)構(gòu)被破壞、骨強度下降、骨脆性增加、極易發(fā)生骨折為特征的全身性骨骼疾病。骨質(zhì)疏松癥是老年人的常見病和多發(fā)病，且已成為世界性的常見代謝性疾病之一。骨質(zhì)疏松的發(fā)生系由骨的吸收和骨的形成失衡而引起的，婦女絕經(jīng)后及男性性腺機能減退后，其身體激素的變化在發(fā)病中起重要作用。由于激素水平的變化，會使骨的丟失大于其形成，并可引起骨鈣減少而發(fā)生骨質(zhì)疏松。因此，增加骨形成和抑制骨吸收可有效防治骨質(zhì)疏松。

MEPE，又名成骨細胞/骨細胞因子45(OF45)。Rowe 等[6](2000)發(fā)現(xiàn)了MEPE，并提出MEPE可抑制骨組織的礦化。正常情況下，MEPE在骨組織和大腦中高表達，在肺、腎和胎盤中低表達。Igarashi M等[7]發(fā)現(xiàn)，MEPE在骨組織中，特別是骨小梁和皮質(zhì)骨的骨細胞中呈高表達。王捍國等[8]發(fā)現(xiàn)，MEPE能被furin蛋白酶激活從而促進牙髓細胞的黏附，其可能在牙本質(zhì)和牙髓的發(fā)育中起重要作用。王建、劉宗霞等發(fā)現(xiàn)，在出生后28 d小鼠牙槽骨的成骨細胞中MEPE表達陽性[9-10]；在牙周組織缺損愈合過程中，MEPE參與牙槽骨及牙周膜的再生[11]。Gowen 等[12]報道，敲除小鼠的OF-45基因后，其骨量明顯增加、增齡性骨量的喪失明顯減少，但破骨細胞數(shù)目無顯著變化。上述研究結(jié)果表明，MEPE蛋白在骨的礦化調(diào)節(jié)方面具有雙重性。骨發(fā)生形成蛋白-2(BMP-2)是從骨組織中分離出的一種生長因子，也是TGF-β超家族成員之一。其在已發(fā)現(xiàn)的生長因子中促進骨形成的作用最強，能夠誘導未分化的間充質(zhì)干細胞定向分化為成骨細胞并促進其增殖[13-14]。

本實驗首先成功構(gòu)建了5條不同長度的MEPE基因啟動子，并將該基因啟動子劃分成了不同的區(qū)域進行研究，以確認其核心調(diào)控區(qū)域。將不同長度的MEPE基因啟動子轉(zhuǎn)染小鼠前成骨細胞后，雙熒光素酶報告基因系統(tǒng)檢測顯示：pGL3-MEPE-P-78～+66啟動子活性相對較強，并且在轉(zhuǎn)錄起始位點附近，據(jù)此推測MEPE基因的核心啟動子可能在-78～+66區(qū)域；從pGL3- MEPE-P-140～+66到pGL3- MEPE-P-500～+66，啟動子的活性逐漸上升，提示啟動子140～-500區(qū)域為上調(diào)MEPE轉(zhuǎn)錄表達的調(diào)控元件主要結(jié)合部位。將50 ng/mL的BMP2作用于轉(zhuǎn)染了不同長度MEPE基因啟動子的前成骨細胞，檢測結(jié)果顯示，BMP2在啟動子-140～-500區(qū)域顯著上調(diào)了MEPE基因的轉(zhuǎn)錄活性，推測啟動子-140～-500區(qū)域可能存在調(diào)控活性的主要結(jié)合位點，故在后續(xù)的實驗中采用pGL3- MEPE-P-500～+66進行研究。最后探討了BMP2作用于pGL3- MEPE-P-500～+66片段不同時間后，對其啟動子轉(zhuǎn)錄活性的影響，結(jié)果顯示：在作用6 、12 h時，MEPE基因啟動子的活性得到顯著提升；作用12 h時，其基因啟動子的轉(zhuǎn)錄活性與 6 h相比提升不明顯。根據(jù)該結(jié)果，在以后的實驗中將采用BMP2作用6 h為實驗條件。

本實驗研究了BMP2調(diào)控小鼠前成骨細胞中MEPE基因啟動子的核心區(qū)域，并初步探討了BMP2-MEPE信號通路的分子機制，從而為進一步研究BMP2-MEPE在骨的形成、發(fā)育以及防治骨質(zhì)疏松方面奠定了基礎。

[1]Rachner TD, Khosla S, Hofbauer LC. Osteoporosis: now and the future [J].Lancet, 2011,377 (9773):1276-1287.

[2]Jemtland R, Holden M, Reppe S,etal. Molecular disease map of bone characterizing the postmenopausal osteoporosis phenotype [J].BoneMinerRes, 2011,26(8):1793-1801.

[3]David V, Martin A, Hedge AM,etal. Matrix extracellular phosphoglycoprotein (MEPE) is a new bone renal hormone and vascularization modulator [J].Endocrinology, 2009,150(9):4012-4023.

[4]Nampei A, Hashimoto J, Hayashida K,etal. Matrix extracellular phosphoglycoprotein (MEPE) is highly expressed in osteocytes in human bone [J].BoneMinerMetab,2004, 22(3):176-184.

[5]Cho YD, Yoon WJ, Woo KM,etal. Molecular regulation of matrix extracellular phosphoglycoprotein expression by bone morphogenetic protein-2 [J].BiolChem, 2009,284(37): 25230-25240.

[6]Rowe PS, de Zoysa PA, Dong R,etal. MEPE, a new gene expressed in bone marrow and tumors causing osteomalacia [J].Genomics, 2000,67(1):54-60.

[7]Igarashi M, Kamiya N, Ito K,etal. In situ localization and in vitro expression of osteoblast/ osteocyte factor 45 mRNA during bone cell differentiation [J].Histochem, 2002, 34(5): 255-263.

[8]Wang HG, Kawashima N, Iwata T,etal. MEPE activated by furin promotes pulpal cell adhesion [J].DentRes,2011,90(4):529-534.

[9]王建，劉宗霞，唐開亮,等. 細胞外基質(zhì)磷酸化糖蛋白在小鼠牙齒發(fā)育過程中的表達 [J]. 牙體牙髓牙周病學雜志,2009,19(6):314-317.

[10]Hou C, Liu ZX, Tang KL,etal. Developmental changes and regional localization of Dspp, Mepe, Mimecan and Versican in postnatal developing mouse teeth [J].JMolHistol, 2012,43(1):9-16.

[11]王建，劉宗霞，王鵬,等. 細胞外基質(zhì)磷酸化糖蛋白在大鼠牙周組織缺損愈合過程中的表達 [J]. 牙體牙髓牙周病學雜志,2011,21(5):259-262.

[12]Gowen LC, Petersen DN, Mansolf AL,etal. Targeted disruption of the osteoblast/osteocyte factor 45 gene (OF45) results in increased bone formation and bone mass [J].BiolChem, 2003, 278(3):1998-2007.

[13]Rosen V. BMP2 signaling in bone development and repair [J].CytokineGrowthFactorRev, 2009,20(5/6):475-480.

[14]Ryoo HM, Lee MH, Kim YJ. Critical molecular switches involved in BMP-2-induced osteogenic differentiation of mesenchymal cells [J].Gene, 2006,366(1):51-57.

The construction and preliminary study of matrix extracellular phosphoglycoprotein gene promoter

GONG Chun- mei*, ZHANG Juan- juan, XIA Tian- yong, SUN Yan

(*InstituteofStomotalogy,WeifangMedicalUniversity,Weifang261042,China)

AIM: To study the molecular mechanisms of MEPE gene promoter expression in preosteoblasts in mouse. METHODS: MEPE gene promoter of mouse preosteoblasts was analysed by software(http://www.fruitfly. org/ seq_tools/promoter.html), five candidate sequences were obtained. the primers for the construction of different lengths of MEPE gene promoters were designed; dual luciferase reporter assay was applied to analysis the effects for transcription activity of MEPE gene promoters with different lengths. The effects of BMP2 on the transcription activity of MEPE gene promoters in preosteoblasts were observed. RESULTS: MEPE gene promoters with the lengths of P-78～+66, P-140～+66, P-300～+66, P-500～+66 and P-1081～+66 were obtained. Double luciferase genetic testing report system analysis showed that the transcription activity of different lengths MEPE gene promoters was different(P<0.05) . The transcription activity of MEPE gene promoter was significantly upregulated in the area of -140～-500 after BMP2 treatment. CONCLUSION: The location of MEPE gene promoter in mouse preosteoblasts was reconstructed. BMP2 may regulate the MEPE gene promoter at -140～-500 area.

MEPE; gene clone; BMP2; dual luciferase reporter assay

2015-02-15

國家自然科學基金(81441107 )

宮春梅(1987-)，女，漢族，山東萊陽人。碩士生(導師：于艷玲)

孫 巖，E-mail: jhk@wfmc.edu.cn

R780.2

A

1005-2593(2015)09-0519-05

山東省自然科學基金 (ZR2012HQ036)

山東省教育廳(J12LL51)