ClC-0氯離子通道蛋白質(zhì)空間結(jié)構(gòu)的同源建模

于 濤，朱紫洪，郝棟梁，彭 黎，張 攀，徐 號，郭 旭

（江漢大學(xué) 物理與信息工程學(xué)院，湖北 武漢 430056）

ClC-0氯離子通道蛋白質(zhì)空間結(jié)構(gòu)的同源建模

于 濤，朱紫洪，郝棟梁，彭 黎，張 攀，徐 號，郭 旭

（江漢大學(xué) 物理與信息工程學(xué)院，湖北 武漢 430056）

ClC型氯離子通道蛋白質(zhì)在調(diào)節(jié)生命體的新陳代謝過程中起著重要作用。在原有蛋白質(zhì)ClC-ec1晶體結(jié)構(gòu)的基礎(chǔ)上，依據(jù)同源建模的原理，借助SWISS-MODEL網(wǎng)絡(luò)服務(wù)器構(gòu)建了一類重要氯離子通道蛋白質(zhì)ClC-0的空間結(jié)構(gòu)，同時對所得結(jié)構(gòu)的合理性進(jìn)行了分析。通過衡量結(jié)構(gòu)的Z-score值、分析結(jié)構(gòu)的空間坐標(biāo)波動性以及利用視圖軟件VMD將建模的ClC-0結(jié)構(gòu)和模板結(jié)構(gòu)進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)通過同源建模所得到蛋白質(zhì)ClC-0的空間結(jié)構(gòu)符合后續(xù)研究的要求，這在很大程度上方便了該類蛋白質(zhì)的后續(xù)計算模擬研究。

同源建模；氯離子通道蛋白質(zhì)；SWISS-MODEL

0 引言

離子通道是鑲嵌在生物體細(xì)胞膜上一類重要的蛋白質(zhì)微小孔道，它在生命體系的新陳代謝過程中扮演著極其重要的角色。氯離子通道（chloride ion channel，CIC）是其中極為重要的一類陰離子通道，它擔(dān)負(fù)著包括鹽類離子的跨膜輸運、調(diào)節(jié)細(xì)胞pH值、控制細(xì)胞體積、調(diào)節(jié)電脈沖以及可激肌肉細(xì)胞的電壓穩(wěn)定性等重要的生理和細(xì)胞功能［1］。研究者們通過生化、物理數(shù)學(xué)以及計算機模擬計算等技術(shù)方法對ClC類氯離子通道進(jìn)行了廣泛的研究，這些研究包括結(jié)構(gòu)分析、功能表達(dá)、變異導(dǎo)致相關(guān)疾病等。研究氯離子通道的結(jié)構(gòu)與功能關(guān)系已成為保護(hù)人類健康，揭示致病機制和開發(fā)新藥的前沿?zé)狳c課題。

在ClC型氯通道蛋白質(zhì)家族中，有兩類蛋白質(zhì)最具有代表性，同時也是被研究最廣泛的兩類氯通道蛋白質(zhì)，它們分別是大腸埃希菌（Escherichia coli）氯離子通道蛋白質(zhì)ClC-ec1和電鰩魚類電器官氯通道蛋白質(zhì)ClC-0［2-3］。對于蛋白質(zhì)ClC-ec1，目前普遍認(rèn)為是一類Cl-/H+相互輸運的輸運體（transporter），而ClC-0則被認(rèn)為是一類典型的氯離子通道［4］。一直以來，研究者們認(rèn)為ClC-0的門控（通道打開和關(guān)閉的過程）與目標(biāo)離子的傳導(dǎo)過程密切相關(guān)。ClC-0的注入和門控之間的密切聯(lián)系說明：ClC-0門控是個非平衡過程，它必須利用能量趨近于平衡，這個能量可以來源于跨膜的離子或電壓梯度。ClC-0的電壓相關(guān)性不是來源于通道蛋白質(zhì)中帶電殘基的移動，而是來源于氯離子自身的跨膜移動［1］。許多實驗結(jié)果表明，門控的激活過程與注入過程是平行進(jìn)行的，雖然有關(guān)ClC-0的單通道微電流記錄清楚地顯示它是一個離子通道，但是有的研究顯示ClC-0結(jié)構(gòu)中也可能存在質(zhì)子的輸運［5］。轉(zhuǎn)運體中離子的輸運也是強烈依賴溶液中離子的濃度、緊密的耦合門控和離子注入，并且過程遠(yuǎn)離平衡態(tài)。

對于氯離子通道蛋白質(zhì)ClC-0，由于其結(jié)構(gòu)在結(jié)晶時非常不穩(wěn)定而導(dǎo)致不能通過實驗上的X射線衍射方法得到其結(jié)構(gòu)信息，這對理論研究產(chǎn)生了很大的阻礙。2002年，DUTZLER等［6］用X射線衍射方法測得了大腸埃希菌氯離子通道ClC-ec1的晶體結(jié)構(gòu)。氯離子通道成為繼水通道、鉀離子通道之后又一種擁有原子水平上結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)的離子通道，它使得通過理論計算方法研究氯通道中離子的輸運機制成為可能。研究者們雖然對與ClC-ec1屬于同一蛋白質(zhì)家族的ClC-0研究較多，但由于ClC-0實驗上的晶體結(jié)構(gòu)還沒有被測得，使得其在理論模擬以及計算方面的研究相對實驗研究落后很多。

1 蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的同源建模

在預(yù)測蛋白質(zhì)三維空間結(jié)構(gòu)方面，同源建模方法取得了很大成功，應(yīng)用最為廣泛，因此蛋白質(zhì)同源建模已經(jīng)成為蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)分析的重要方法。一般同源性超過30%的蛋白質(zhì)序列都可以建立相當(dāng)精確的結(jié)構(gòu)模型，序列的同源性越高則建立模型結(jié)構(gòu)的準(zhǔn)確性就越高［7-9］。一般同源建模法推測蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)需要以下6個步驟：①搜索模板蛋白；②目標(biāo)蛋白與模板蛋白的序列比較；③主鏈結(jié)構(gòu)建模；④環(huán)區(qū)建模；⑤側(cè)鏈建模及優(yōu)化；⑥整體結(jié)構(gòu)優(yōu)化及評估。這些步驟可以用不同的程序完成，也可以使用同源建模服務(wù)器或者自動建模程序模塊完成。目前，互聯(lián)網(wǎng)上提供了很多可利用同源建模技術(shù)預(yù)測蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的服務(wù)器，例如SWISS-MODEL（Geneva）、3D-JIGSAW（London）、FAMS（Tokoy）和SDSCI（San Diego），其中SWISS-MODEL網(wǎng)絡(luò)建模服務(wù)器使用最廣泛［10-11］。

1.1 同源建模服務(wù)器SWISS-MODEL

SWISS-MODEL網(wǎng)絡(luò)同源建模服務(wù)器是一個自動化建模并且對任何學(xué)術(shù)團(tuán)體都免費的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)模擬環(huán)境，用戶可以登錄網(wǎng)站進(jìn)行蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的同源建模，還可以用打分函數(shù)對已建模的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)進(jìn)行評估以確定其優(yōu)劣。本文大部分工作都是在SWISS-MODEL服務(wù)器上實現(xiàn)，同時借助生物大分子可視化軟件VMD對同源建模所構(gòu)建的結(jié)構(gòu)進(jìn)行三維顯示和比較［12］。SWISS-MODEL是一個有注解的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)同源建模服務(wù)器，并且與專業(yè)蛋白質(zhì)分析系統(tǒng)（Expert Protein Analysis System，ExPASy）網(wǎng)站緊密聯(lián)系，目前數(shù)據(jù)庫中約有30 000個蛋白質(zhì)三維結(jié)構(gòu)模型，該服務(wù)器已向全世界的生物化學(xué)和分子生物學(xué)學(xué)者提供蛋白質(zhì)三維結(jié)構(gòu)自動建模服務(wù)。在SWISS-MODEL服務(wù)器的Web界面上可供選擇的同源建模方式有3種：Automated Mode、Alignment Mode以及Project Mode，用戶可以根據(jù)不同的需要選擇相應(yīng)的建模方式。

1.2 ClC-0蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)同源建模任務(wù)提交

使用SWISS-MODEL服務(wù)器對ClC-0蛋白質(zhì)進(jìn)行三維結(jié)構(gòu)建模時，先要在蛋白質(zhì)序列數(shù)據(jù)庫中搜索相似性足夠高的同源序列，以便用來建立最初的結(jié)構(gòu)模型。在蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫中，筆者找到了和ClC-0屬于同一蛋白質(zhì)家族的ClC-ec1蛋白質(zhì)，兩者序列之間的相似度極高，并且ClC-ec1的三維晶體結(jié)構(gòu)已經(jīng)被精確測量。因此，ClC-ec1為筆者提供了可靠的模板。采用蛋白質(zhì)序列比對軟件Clustal-W對ClC-0和ClC-ec1氨基酸序列進(jìn)行序列比對［4］，通過添加空位和人工微調(diào)，得到了最佳的序列比對模式，最終使得兩條序列相似度達(dá)到最高，其中ClC-0和ClC-ec1序列相同的氨基酸殘基占25%，側(cè)鏈性質(zhì)相同的氨基酸占58%，這說明屬于同一蛋白質(zhì)家族的ClC-0和ClC-ec1同源性非常高。在完成序列比對后，就可以在SWISS-MODEL服務(wù)器上提交任務(wù)。由于筆者提前已將需要建模的序列和模板序列進(jìn)行了比對，因此可以選擇建模結(jié)果準(zhǔn)確的比對模式（Alignment Mode）進(jìn)行同源建模，在該模式中需要人工將已經(jīng)比對好的序列提交到服務(wù)器。點擊Alignment Mode按鍵之后，就會進(jìn)入比對建模模式界面（見圖1）。在相應(yīng)的對話框里填入提交者的郵箱、工作任務(wù)名字以及已經(jīng)序列比對得分最高ClC-0和ClC-ec1的序列。在這里蛋白質(zhì)的序列是以FASTA格式輸入的，最后點擊“submit alignment”按鈕提交初始建模任務(wù)。

圖1 在SWISS-MODEL服務(wù)器上提交建模任務(wù)的界面Fig.1 Interface of the submissin of modeling project on SWISS-MODEL web site

在完成任務(wù)的提交后就可以得到SWISS-MODEL服務(wù)器返回的序列比對結(jié)果（見圖2）。在返回的比對結(jié)果中相同的氨基酸下面用星號“*”突出表示。圖2是SWISS-MODEL服務(wù)器進(jìn)行下一步同源建模的序列之間比對的最后結(jié)果，如果提交者對這一比對結(jié)果不滿意，可以返回任務(wù)提交界面對序列比對進(jìn)行調(diào)整，然后再提交。如果對序列比對的結(jié)果滿意，就可以點擊“submit alignment”按鈕進(jìn)行下一步建模。

2 ClC-0空間結(jié)構(gòu)建模結(jié)果及分析

在提交任務(wù)后的0.5 h以內(nèi)，任務(wù)提交者就會在郵箱里收到建模任務(wù)已完成的郵件。同時SWISSMODEL服務(wù)器的網(wǎng)頁也發(fā)生了改變，顯示出最終的建模結(jié)果以及對建模后結(jié)構(gòu)的分析。SWISS-MODEL服務(wù)器對ClC-0蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)建模結(jié)果如圖3所示。在圖3中顯示的只是ClC-0蛋白質(zhì)其中的A鏈的結(jié)構(gòu)，該結(jié)構(gòu)是根據(jù)序列比對結(jié)果進(jìn)行建模，由于A鏈和B鏈氨基酸的序列完全相同，所以用相同的方法可以獲得B鏈的同源建模結(jié)構(gòu)。

為了說明建模結(jié)果的合理性，筆者對建模的結(jié)構(gòu)進(jìn)行了結(jié)構(gòu)特性分析，通過在SWISS-MODEL服務(wù)器網(wǎng)頁上查看和下載建模后的結(jié)構(gòu)特征圖，分析了ClC-0蛋白質(zhì)整體建模結(jié)構(gòu)的空間結(jié)構(gòu)得分結(jié)果（Z-score，見圖4），兩個結(jié)構(gòu)的Z-score值反映了建模結(jié)構(gòu)和模板結(jié)構(gòu)整體結(jié)構(gòu)在能量上的差異性，通過圖4可以看出，4類不同能量差異的Z-score值在-5左右，其中C-β相互作用能量差異為-5.11，所有原子相互作用能量差異為-5.43，溶劑化能量差異為-4.79，扭轉(zhuǎn)角能量差異為-6.45。由于ClC-0蛋白質(zhì)屬于膜蛋白，細(xì)胞膜對蛋白質(zhì)的空間約束較強，使得在沒有細(xì)胞膜的約束下建模后結(jié)構(gòu)的Z-Score值較低，對于膜蛋白來說這些值是合理的。這說明沒有細(xì)胞膜的限制，ClC-0蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)會出現(xiàn)局部變化，如果將建模后的結(jié)構(gòu)放到細(xì)胞膜中，會使得整個結(jié)構(gòu)的變化量大大減少，并且可以通過后續(xù)的分子動力學(xué)模擬將建模后的蛋白質(zhì)和細(xì)胞膜實現(xiàn)完全融合。為了更詳細(xì)地展示建模后結(jié)構(gòu)的具體細(xì)節(jié)變化，筆者計算了建模后ClC-0蛋白質(zhì)和模板蛋白質(zhì)ClC-ec1之間隨著氨基酸序列排序結(jié)構(gòu)中原子空間坐標(biāo)的差異性，圖5是建模后ClC-0空間結(jié)構(gòu)和模板結(jié)構(gòu)在氨基酸序列上的每個氨基酸殘基原子坐標(biāo)的波動性變化情況。對于兩端（C-端和N-端）處的氨基酸來說，由于跟其他氨基酸的相互作用偏弱，導(dǎo)致其結(jié)構(gòu)的波動性偏大，處于蛋白質(zhì)內(nèi)部的疏水氨基酸的位置波動性大大減小，大部分氨基酸殘基上所有原子的坐標(biāo)偏差之和都小于5 ?。這說明通過同源建模得到的ClC-0蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)基本跟模板ClC-ec1的結(jié)構(gòu)相吻合。

圖2 蛋白質(zhì)ClC-0和ClC-ec1氨基酸序列比對結(jié)果Fig.2 Comparison of amino acid sequence of protein CIC-0 andClC-ec1

圖3 SWISS-MODEL服務(wù)器對CIC-0建模結(jié)果的結(jié)構(gòu)信息Fig.3 Structure information of ClC-0 protein by SWISS-MODEL server

圖4 SWISS-MODEL服務(wù)器建模結(jié)果能量差異性的Z-score值Fig.4 The energy Z-score value of the modeling structure by SWISS-MODEL server

圖5 SWISS-MODEL服務(wù)器建模結(jié)構(gòu)和模板結(jié)構(gòu)的原子坐標(biāo)波動性分析Fig.5 Coordinates fluctuation analysis of the modeling structure and template structure

通過下載SWISS-MODEL服務(wù)器上ClC-0的建模結(jié)果中的原子坐標(biāo)文件，用視圖軟件VMD做出了建模后的ClC-0結(jié)構(gòu)示意圖，通過跟模板ClC-ec1的結(jié)構(gòu)進(jìn)行比較，可以看出大部分結(jié)構(gòu)都是一致的，只是在結(jié)構(gòu)中轉(zhuǎn)角處有部分差異，具體結(jié)果如圖6所示（其中灰色區(qū)域為模板結(jié)構(gòu)，螺旋結(jié)構(gòu)為建模結(jié)構(gòu)），這說明筆者事先通過序列比對，然后在SWISS-MODEL服務(wù)器上進(jìn)行蛋白質(zhì)空間結(jié)構(gòu)的同源建模方法是可行的。

圖6 建模ClC-0結(jié)構(gòu)與模板ClC-ec1結(jié)構(gòu)的差異性Fig.6 Differences between the modeling ClC-0 structure and the ClC-ec1 structure

3 結(jié)語

本研究從ClC-0氯離子通道蛋白質(zhì)氨基酸序列出發(fā)，在提前進(jìn)行序列比對的基礎(chǔ)上，通過同源建模的方法第一次得到了該類蛋白質(zhì)的可靠空間結(jié)構(gòu)，同時對所構(gòu)建的結(jié)構(gòu)模型合理性進(jìn)行了評估與分析。所得到的結(jié)構(gòu)為后續(xù)研究（如系統(tǒng)靜電分析、動力學(xué)模擬）提供了可靠樣本，也為同源建模在研究蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)預(yù)測領(lǐng)域的應(yīng)用奠定了基礎(chǔ)。

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（責(zé)任編輯：胡燕梅）

Homology Modeling of Spatial Structure of CIC-0 Chloride Channel Proteins

YU Tao，ZHU Zihong，HAO Dongliang，PENG Li，ZHANG Pan，XU Hao，GUO Xu
（School of Physics and Information Engineering，Jianghan University，Wuhan 430056，Hubei，China）

CIC-type chloride ion channel proteins play important role in regulating the metabolism process of biological system.On the base of CIC-ec1 crystal structure，in accordance with the principle of homology modeling，using SWISS-MODEL net server，constructed the spatial structure of a kind of CIC-0 chloride ion channel protein，and analyzed the reasonableness of the obtained structure.Through measuring the Z-score of the structure，analyzing the fluctuation of space coordinates of the structure，and comparing the modeling CIC-0 structure with template structure，discovered that the spatial structure of CIC-0 protein by homology modeling complied with the requirement of further study，which makes the further simulation and computation be easy.

homology modeling；chloride channel protein；SWISS-MODEL

Q51；TP391.9

A

1673-0143（2015）02-0111-05

10.16389/j.cnki.cn42-1737/n.2015.02.003

2014-10-09

國家自然科學(xué)基金項目（11304123）；國家留學(xué)基金項目（201408420100）；江漢大學(xué)高層次人才科研啟動經(jīng)費項目（2013016）；江漢大學(xué)學(xué)生科研項目（2013yb093）

于 濤（1982—），男，講師，博士，研究方向：凝聚態(tài)物理、軟物質(zhì)物理。