擬南芥CAS基因的生物信息學(xué)分析及超表達(dá)載體構(gòu)建

余璐璐，陽(yáng)敦潤(rùn)，曹中權(quán)，劉龍山，羅 璐，徐 飛*，

（武漢生物工程學(xué)院 a.應(yīng)用生物技術(shù)研究中心；b.生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，湖北 武漢 430415）

擬南芥CAS基因的生物信息學(xué)分析及超表達(dá)載體構(gòu)建

余璐璐a，陽(yáng)敦潤(rùn)b，曹中權(quán)b，劉龍山b，羅 璐b，徐 飛*a，b

（武漢生物工程學(xué)院 a.應(yīng)用生物技術(shù)研究中心；b.生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，湖北 武漢 430415）

對(duì)擬南芥氰丙氨酸合酶（cyanoalanine synthase，CAS）基因進(jìn)行了生物信息學(xué)分析，并構(gòu)建了CAS合酶基因的超表達(dá)載體，以期為其后續(xù)功能研究奠定基礎(chǔ)。生物信息學(xué)分析結(jié)果表明，編碼擬南芥CAS合酶的CYS-C1和CYS-D1基因均含有10個(gè)外顯子和9個(gè)內(nèi)含子，定位于3號(hào)染色體，而CYS-D2基因有9個(gè)外顯子和8個(gè)內(nèi)含子，定位于5號(hào)染色體；3個(gè)基因編碼的蛋白氨基酸序列相似度較高，CYS-C1蛋白偏堿性且主要在線粒體中起作用，而CYS-D1和CYS-D2蛋白偏酸性，主要在細(xì)胞質(zhì)中起作用。通過RT-PCR擴(kuò)增了擬南芥CYS-C1、CYS-D1和CYS-D2基因片段，并構(gòu)建了超表達(dá)載體pBI121-35S-CYS-C1、pBI121-35S-CYS-D1和pBI121-35S-CYS-D2，經(jīng)檢測(cè)重組質(zhì)粒已轉(zhuǎn)化到農(nóng)桿菌GV3101中。

擬南芥；氰丙氨酸合酶（CAS）；超表達(dá)載體；生物信息學(xué)

氰丙氨酸合酶（cyanoalanine synthase，CAS）是植物解氰作用的關(guān)鍵酶［1］，其底物之一氰化氫（hydrogen cyanide，HCN）是植物體內(nèi)廣為存在的一種內(nèi)源性小分子類代謝產(chǎn)物。HCN可抑制線粒體呼吸鏈中的細(xì)胞色素c氧化酶的活性，因而HCN對(duì)于生物體來說有很強(qiáng)的毒性［2-5］。但值得關(guān)注的是，植物具有產(chǎn)HCN并耐HCN的特性。以往的研究者分析一方面是因?yàn)橹参矬w內(nèi)存在一條由交替氧化酶（alternative oxidase，AOX）介導(dǎo)的抗氰呼吸途徑（cyanide-resistance respiration pathway），可減輕HCN對(duì)呼吸鏈的抑制作用［3-4］；另一方面，HCN會(huì)誘導(dǎo)CAS合酶的活性，從而可將HCN降低到安全濃度范圍內(nèi)［5-6］。

有研究表明擬南芥中存在CYS-C1（At3g61440）、CYS-D1（At3g04940）和CYS-D2（At5g28020）3個(gè)編碼CAS合酶蛋白的基因，其中CYS-C1基因表達(dá)量最多［7］。從作用部位來看，CYS-C1蛋白在線粒體中表達(dá)，而CYS-D1和CYS-D2蛋白在細(xì)胞質(zhì)中表達(dá)［8］。值得關(guān)注的是，HCN伴隨乙烯的合成發(fā)生在細(xì)胞質(zhì)中［5］，但分解HCN的CAS合酶主要存在于線粒體，這一重要結(jié)論暗示CAS合酶的作用很可能是為了減輕HCN對(duì)線粒體呼吸鏈的抑制，而非徹底清除HCN。此外，近年來還有研究表明，植物細(xì)胞能利用內(nèi)源HCN調(diào)控一些重要的生理過程，如種子萌發(fā)［9］、開花誘導(dǎo)［10］等，同時(shí)在植物抗蟲抗病反應(yīng)過程中也有重要作用［11-12］。因此，植物在解HCN與利用內(nèi)源HCN存在一個(gè)平衡機(jī)制，關(guān)鍵在于對(duì)不同時(shí)期和部位CAS活性的調(diào)控。但是，植物調(diào)控CAS活性的機(jī)理仍不明確，尤其是在植物響應(yīng)逆境脅迫反應(yīng)的過程中。

因此，筆者試圖通過生物信息學(xué)的方法分析擬南芥CAS基因的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)、氨基酸的組成、蛋白的亞細(xì)胞定位及時(shí)空表達(dá)模式，并構(gòu)建CAS基因的超表達(dá)載體，為今后進(jìn)一步研究CAS基因家族成員的功能及對(duì)植物細(xì)胞內(nèi)源性HCN的調(diào)控機(jī)理奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 擬南芥CAS基因生物信息學(xué)分析

擬南芥CAS基因結(jié)構(gòu)利用在線分析工具Gene Structure Display Server（GSDS，http：//gsds1.cbi.pku.edu. cn/index.php）進(jìn)行分析；基因染色體定位利用NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)的Mapviewer進(jìn)行了在線分析；氨基酸序列分析及同源進(jìn)化樹構(gòu)建分別利用Vector NTI 11.5和MEGA 5.2軟件進(jìn)行分析；CAS基因家族亞細(xì)胞定位和蛋白成員理化性質(zhì)分析分別使用WolfPSORT（http：//psort.hgc.jp/）和ProtParam（http：//web.expasy.org/protparam/）進(jìn)行預(yù)測(cè)分析；擬南芥CAS基因的時(shí)空表達(dá)模式則利用Genevestigator進(jìn)行在線分析。

1.2 擬南芥CAS基因超表達(dá)載體構(gòu)建

1.2.1 試驗(yàn)材料 擬南芥種子（野生型，Col）購(gòu)自ABRC（Arabidopsis Biological Resource Center）種子庫(kù)。擬南芥種子用清水浸種1 d，然后用0.1 mol/L KMnO4消毒5 min后播種在含營(yíng)養(yǎng)土和蛭石（1：1）的培養(yǎng)基質(zhì)上，同時(shí)施以1/2 Hoagland營(yíng)養(yǎng)液。培養(yǎng)30 d后幼苗用于實(shí)驗(yàn)。

1.2.2 擬南芥總RNA的提取及質(zhì)量檢測(cè) 擬南芥總RNA的提取采用Trizol（Invitrogen公司）試劑。RNA的完整性及其純度分別通過1%瓊脂糖凝膠電泳和紫外分光光度計(jì)（TU-1800）測(cè)定OD260/OD280的光密度比值進(jìn)行檢測(cè)分析。

1.2.3 CAS基因的克隆及質(zhì)粒DNA（pBI121）的提取 將mRNA通過反轉(zhuǎn)錄試劑盒（Fermentas公司）合成第一鏈cDNA后，利用設(shè)計(jì)的特異性引物（見表1）進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR反應(yīng)條件為：94℃預(yù)變性5 min；接下來是35個(gè)擴(kuò)增循環(huán)；94℃變性50 s；49℃退火45 s；72℃引物延伸1 min 30 s；最后在72℃條件下反應(yīng)10 min，終止反應(yīng)。將產(chǎn)物純化回收后送往上海生工生物工程有限公司進(jìn)行基因測(cè)序。pBI121質(zhì)粒DNA的提取參照質(zhì)粒提取試劑盒（Takara公司）完成。提取后的質(zhì)粒DNA保存于-20℃冰箱備用。

表1 基因擴(kuò)增引物列表Tab.1 Primers used for genes amplification

1.2.4 重組質(zhì)粒的構(gòu)建 用BamH I和SmaI對(duì)目的基因和表達(dá)載體pBI121分別進(jìn)行雙酶切，回收目的片段后，用T4 DNA連接酶進(jìn)行連接反應(yīng)。連接后的載體分別命名為pBI121-35S-CYS-C1、pBI121-35SCYS-C2和pBI121-35S-CYS-D2。載體構(gòu)建如圖1所示。

圖1 CAS基因超表達(dá)載體構(gòu)建示意圖Fig.1 Schematic diagrams ofCASgenes over-expression vectors

1.2.5 重組質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化與鑒定 將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到農(nóng)桿菌GV3101感受態(tài)細(xì)胞中，并在含100 μg/mL Kana抗生素的平板上（28℃）培養(yǎng)2 d后篩選陽(yáng)性克隆。挑選陽(yáng)性單克隆菌落用YEB搖菌培養(yǎng)12 h后，取菌液并提取質(zhì)粒進(jìn)行PCR檢測(cè)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 擬南芥CAS基因生物信息學(xué)分析

2.1.1 擬南芥CAS基因結(jié)構(gòu)分析 利用在線分析工具Gene Structure Display Server（GSDS，http：//gsds1. cbi.pku.edu.cn/index.php）對(duì)擬南芥CAS基因結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析，結(jié)果如圖2所示，CYS-C1和CYS-D1基因有10個(gè)外顯子和9個(gè)內(nèi)含子，CYS-D2基因有9個(gè)外顯子和8個(gè)內(nèi)含子。

圖2 擬南芥CAS基因結(jié)構(gòu)分析Fig.2 CASgenes structure analysis ofarabidopsis

2.1.2 擬南芥CAS基因的染色體定位分析 為進(jìn)一步了解擬南芥CAS基因在染色體上的定位，利用NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)的Mapviewer進(jìn)行了在線分析，結(jié)果如表2和圖3所示。從圖3中可以看出，擬南芥CYS-C1和CYS-D1基因定位于3號(hào)染色體，CYS-D2基因定位于5號(hào)染色體。

表2 擬南芥CAS基因的染色體定位信息Tab.2 Locus information ofCASgene family inarabidopsischromosome

圖3 擬南芥CAS基因的染色體定位圖譜Fig.3 Mapview ofCASgenes families inarabidopsischromosome

2.1.3 擬南芥CAS基因同源比對(duì)及進(jìn)化樹構(gòu)建 利用Vector NTI 11.5軟件對(duì)CYS-C1、CYS-D1和CYS-D2蛋白氨基酸序列進(jìn)行了比對(duì)分析表明，CYS-C1、CYS-D1和CYS-D2的氨基酸序列相似度較高，尤其是在97～128、200～250和302～348區(qū)間（見圖4）。

圖4 擬南芥CAS基因家族氨基酸序列比對(duì)結(jié)果Fig.4 Blast results ofCASgenes inarabidopsis

此外，從NCBI找到已知CAS基因序列的物種，并與擬南芥CAS基因家族蛋白進(jìn)行同源比對(duì)后，利用MEGA5.2軟件構(gòu)建的系統(tǒng)進(jìn)化樹（見圖5）。由圖5可以看出，擬南芥CYS-C1與黃瓜的親緣關(guān)系較近，而CYS-D1和CYS-D2與鹽芥的親緣關(guān)系較近。

2.1.4 擬南芥CAS基因的亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè)分析 擬南芥CAS基因家族亞細(xì)胞定位使用WolfPSORT（http：//psort.hgc.jp/）進(jìn)行預(yù)測(cè)。結(jié)果如圖6所示，擬南芥CYS-C1蛋白定位于線粒體，而CYS-D1和CYS-D2蛋白主要定位于細(xì)胞質(zhì)，其次是定位于過氧化物酶體。這些結(jié)果表明CYS-C1蛋白應(yīng)該是參與保護(hù)線粒體呼吸鏈（減輕HCN對(duì)呼吸鏈的抑制），CYS-D1蛋白和CYS-D2蛋白可能是代謝HCN（使其降低至安全濃度范圍內(nèi)）。

2.1.5 擬南芥CAS家族成員蛋白的理化性質(zhì)分析 使用ProtParam（http：//web.expasy.org/protparam/）對(duì)擬南芥CAS家族成員蛋白進(jìn)行了理化性質(zhì)分析，結(jié)果見表3。從3表中可以看出，擬南芥CAS家族成員蛋白大小相差不大，其中最大的CYS-C1蛋白氨基酸長(zhǎng)度為368，分子量為39.93 ku。從理論等電點(diǎn)數(shù)據(jù)來看，CYS-C1蛋白偏堿性（PI=8.71），而CYS-D1（PI=5.23）和CYS-D2（PI=5.74）蛋白偏酸性。此外，蛋白不穩(wěn)定性分析顯示，擬南芥CAS家族成員蛋白的不穩(wěn)定指數(shù)在20～33之間，未超過臨界值（大于40被認(rèn)為不穩(wěn)定），表明CAS家族成員蛋白穩(wěn)定性較好。其次，從表3中所顯示各成員的平均親水性來看，CYS-C1和CYS-D1的親水性為負(fù)值，表明均是親水性蛋白，即可溶性蛋白。CYS-D2的親水性值為0.079，表明其是疏水性蛋白，不過數(shù)值并不太高，推測(cè)其應(yīng)是微溶于水。

圖5 CAS基因的同源進(jìn)化樹分析Fig.5 Phylogenetic analysis ofCASgenes

圖6 擬南芥CAS基因的亞細(xì)胞定位分析Fig.6 Subcellular locus analysis ofCASgenes inarabidopsis

表3 擬南芥CAS家族成員蛋白理化性質(zhì)分析Tab.3 Analysis on physical and chemical properties ofCASgenes families inarabidopsis

2.1.6 擬南芥CAS基因的時(shí)空表達(dá)模式分析 利用Genevestigator在線分析擬南芥CAS基因的時(shí)空表達(dá)模式。如圖7所示，擬南芥CYS-C1基因在萌芽和生長(zhǎng)、發(fā)育階段表達(dá)量均較高。相比之下，CYS-D1和CYS-D2的表達(dá)量相當(dāng)，且在擬南芥種子成熟以前均低于CYS-C1基因的表達(dá)。在種子成熟時(shí)期，3個(gè)基因的表達(dá)量均明顯下降，且?guī)缀跆幱谕凰健?/p>

圖7 擬南芥CAS基因的時(shí)空表達(dá)模式Fig.7 CASgenes expression of different stage inarabidopsis

2.2 擬南芥CAS基因的超表達(dá)載體構(gòu)建

2.2.1 擬南芥CAS基因的克隆及pBI121質(zhì)粒DNA的提取 結(jié)果見圖8，從圖8（a）可以看出，本實(shí)驗(yàn)提取的RNA質(zhì)量較好，電泳條帶清晰；紫外分光光度計(jì)測(cè)定后計(jì)算RNA的光密度比值OD260/OD280=1.92，表明提取的RNA無(wú)雜蛋白污染。圖8（b）顯示RT-PCR擴(kuò)增的基因條帶清晰，特異性強(qiáng)。PCR產(chǎn)物回收后進(jìn)行基因檢測(cè)可知CYS-C1、CYS-D1和CYS-D2基因分別為1 200、1 070和970 bp大小的片段。此外，從圖8（c）可以看出，pBI121質(zhì)粒DNA提取質(zhì)量較好，無(wú)明顯蛋白質(zhì)等雜質(zhì)污染。

圖8 擬南芥CAS基因的擴(kuò)增及質(zhì)粒DNA的提取Fig.8 CASgenes amplification and pBI121 plasmid DNA extraction inarabidopsis

2.2.2 重組質(zhì)粒的構(gòu)建及篩選鑒定 菌液用于重組質(zhì)粒鑒定，檢測(cè)結(jié)果如圖9中（a）～（c）所示，重組質(zhì)粒pBI121-35S-CYS-C1、pBI121-35S-CYS-D1和pBI121-35S-CYS-D1均擴(kuò)增出了與目的基因相同大小的片段，表明挑選的菌斑均為陽(yáng)性克隆。

此外，將重組質(zhì)粒進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳后顯示，重組質(zhì)粒明顯大于pBI121空質(zhì)粒（見圖9（d）），從而進(jìn)一步表明CYS-C1、CYS-D1和CYS-D2基因已成功連接至pBI121表達(dá)載體中。

圖9 重組質(zhì)粒的鑒定Fig.9 Identification of recombinant plasmids

3 討論

氰化物可抑制細(xì)胞色素氧化酶的活性，從而抑制線粒體呼吸作用。盡管植物線粒體呼吸鏈中存在一條抗氰呼吸途徑，但植物細(xì)胞不能長(zhǎng)期適應(yīng)高濃度內(nèi)源氰化物的存在，因此解氰作用對(duì)于植物細(xì)胞維持正常物質(zhì)和能量代謝，有著重要的意義［3］。

近年來，國(guó)內(nèi)外的研究發(fā)現(xiàn)氰化物在種子萌發(fā)［9］、植物抗?。?2-14］等反應(yīng)中起重要作用，這表明植物在解氰與利用內(nèi)源氰化物之間存在著某種平衡機(jī)制，但植物調(diào)控CAS合酶活性的機(jī)理仍不明確。筆者通過生物信息學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，擬南芥CAS基因家族成員表達(dá)量和亞細(xì)胞分布不盡相同。CYS-C1基因表達(dá)量最多，蛋白偏堿性（PI=8.71），為親水性蛋白；CYS-D1和CYS-D2基因表達(dá)量較少，蛋白均偏酸性，其中CYS-D1為親水性蛋白，CYS-D2為疏水性蛋白。從蛋白作用部位來看，CYS-C1作用部位為線粒體，而CYS-D1和CYS-D2作用部位主要為細(xì)胞質(zhì)。這些結(jié)果表明，CYS-C1在減輕氰化物（尤其是HCN）對(duì)線粒體呼吸鏈的抑制作用中扮演主要角色。

HCN伴隨乙烯的合成發(fā)生在細(xì)胞質(zhì)［15］，但解氰作用的CAS合酶主要存在于線粒體（CYS-C1），這也再次表明CAS的活性應(yīng)是保護(hù)線粒體呼吸鏈的正常運(yùn)轉(zhuǎn)，而非徹底清除HCN（細(xì)胞質(zhì)中的CYS-D1和CYS-D2表達(dá)量較少），細(xì)胞質(zhì)中殘留的低濃度HCN應(yīng)該是促進(jìn)種子萌發(fā)和增強(qiáng)植物抗病的關(guān)鍵因素之一。因此，筆者通過構(gòu)建CAS基因超表達(dá)載體，以期進(jìn)一步研究CAS基因的功能。經(jīng)菌液PCR和質(zhì)粒大小分析，本實(shí)驗(yàn)已成功構(gòu)建了CYS-C1、CYS-D1和CYS-D2基因的超表達(dá)載體pBI121-35S-CYS-C1、pBI121-35S-CYS-D1和pBI121-35S-CYS-D2。實(shí)驗(yàn)中所用的質(zhì)粒載體pBI121具有在真核生物中高表達(dá)的啟動(dòng)子CaM35S和易檢測(cè)的報(bào)告基因GUS。將目的基因連接在GUS基因前面，使其在植物中整合表達(dá)，便于今后對(duì)基因進(jìn)行準(zhǔn)確的亞細(xì)胞定位，及時(shí)空表達(dá)研究檢測(cè)分析。此外，擬南芥CAS家族3個(gè)基因的重組質(zhì)粒已成功轉(zhuǎn)化到農(nóng)桿菌GV3101中，這為后續(xù)基因功能的相關(guān)研究奠定了基礎(chǔ)。

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（責(zé)任編輯：胡燕梅）

Bioinformatics Analysis and Over-Expression Vectors Construction ofCASGenes in Arabidopsis

YU Lulua，YANG Dunrunb，CAO Zhongquanb，LIU Longshanb，LUO Lub，XU Fei*a，b
（a.Center of Applied Biotechnology；b.College of Life Science and Biotechnology，Wuhan Bioengineering Institute，Wuhan 430415，Hubei，China）

TheCASgenes were analyzed by bioinformatics methods and over-expression vectors ofCAS genes were constructed.Bioinformatics analysis show thatCYS-C1andCYS-D1have ten exons and nine introns，whileCYS-D2has nine exons and eight intron.CYS-C1andCYS-D1locate at chromosome 3 whileCYS-D2locates at chromosome 5.Furthermore，the amino acid sequences ofCASgenes share a high similarity.However，CYS-C1is basic protein and functions at mitochondria，whereasCYS-D1and CYS-D2are acidic protein and function at cytoplasm.The over-expression vectors of pBI121-35SCYS-C1，pBI121-35S-CYS-D1and pBI121-35S-CYS-D2were constructed，and the recombinant plasmids were transformed into agrobacterium GV3101.

arabidopsis；cyanoalanine synthase（CAS）；over-expression vector；bioinformatics

Q71；Q782

A

1673-0143（2015）02-0150-08

10.16389/j.cnki.cn42-1737/n.2015.02.010

2014-11-13

國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（31400242）；武漢生物工程學(xué)院應(yīng)用校本研究項(xiàng)目（2014K29）

余璐璐（1984—），女，助教，碩士，研究方向：植物生理生態(tài)。

*通訊作者：徐 飛（1985—），男，講師，博士，研究方向：植物生理與分子生物學(xué)。Email∶feixu666@hotmail.com