植物蛋白酶提取檸檬皮果膠

韓鵬，黃雨欣，李雪梅，葉艷梅，宋麗潔，劉義武

（內(nèi)江師范學(xué)院化學(xué)化工學(xué)院，四川內(nèi)江641199）

植物蛋白酶提取檸檬皮果膠

韓鵬，黃雨欣，李雪梅，葉艷梅，宋麗潔，劉義武*

（內(nèi)江師范學(xué)院化學(xué)化工學(xué)院，四川內(nèi)江641199）

利用植物蛋白酶-醇析法對檸檬皮果膠的提取工藝進(jìn)行研究。考察液料比、緩沖液pH、提取時間、提取溫度、酶濃度對果膠得率的影響，采用單因素試驗及正交試驗得到檸檬皮果膠的最佳提取工藝條件：提取時間50 min，溫度54℃，pH 7.0，加酶量3 mg/g，液料比20∶1。在此條件下進(jìn)行了3次平行試驗，在平行實驗中其重現(xiàn)性很好，結(jié)果表明此工藝條件確實是穩(wěn)定性良好的最佳工藝條件，果膠平均得率為27.60%。

植物蛋白酶；檸檬皮；正交試驗；果膠

果膠是植物中的一種酸性多糖物質(zhì)，它通常為白色至淡黃色粉末，稍帶酸味，具有水溶性，其分子量約5萬～30萬，主要存在于植物的細(xì)胞壁和細(xì)胞內(nèi)層，為內(nèi)部細(xì)胞的支撐物質(zhì)。柑桔、蘋果、檸檬等果皮是果膠豐富的來源［1-2］。果膠是一種天然高分子化合物，具有良好的膠凝化和乳化穩(wěn)定作用，其用途廣泛，運用于食物、化妝品等各個領(lǐng)域［3-5］。

果膠提取的方法有：酸提取法、離子交換法、微波法、酶法和微生物法等［6-13］。其中酸提取法雖是工業(yè)提取果膠的主要手段，但酸提取法提取過程中果膠分子易發(fā)生部分水解和降解，這樣降低了果膠分子量，影響果膠的收率和質(zhì)量。而酶法就能克服這一缺陷。酶法提取果膠因酶作用的高效性和專一性，果膠收率高，生產(chǎn)工藝流程和設(shè)備簡單，工藝易于控制，且能夠更好地保持產(chǎn)品的膠凝度，目前酶解法提取果膠所用的酶主要有：纖維素酶、半纖維素酶、果膠酶，而植物蛋白酶卻鮮有研究［11-13］。從檸檬皮中提取果膠可以使大量的檸檬皮渣得以充分且高附加值地利用，又解決了檸檬果皮污染環(huán)境的問題，對檸檬的綜合利用和高效增值均具有十分重要的意義。所以，本文利用純天然植物蛋白酶提取檸檬皮果膠，以期提高果膠質(zhì)量，降低果膠生產(chǎn)成本。通過本研究可以推動酶法提取果膠的深入研究，為商業(yè)化生產(chǎn)提供更好的參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

菠蘿蛋白酶（生物試劑）：上海金穗生物科技有限公司；檸檬酸，檸檬酸三鈉，乙醇（均為分析純）：成都金山化學(xué)試劑有限公司；檸檬：四川安岳。

1.2 儀器與設(shè)備

TD5-I高速離心機(jī)：中國四川蜀科儀器有限公司；DF-101S集熱式恒溫加熱磁力攪拌器：中國鄭州英峪予華儀器有限公司；DHG-9070A電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱：中國上海鴻都電子科技有限公司；JA5002電子天平：中國上海精天電子儀器有限公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 試驗步驟

原料處理：將檸檬剔出果皮，并切成小塊，將其在沸水滅活5 min，用蒸餾水洗滌至無色，60℃干燥，粉碎備用。

酶提?。阂圆ぬ}蛋白酶用量為2 mg/g，提取緩沖液pH為5.6，提取溫度為45℃，提取時間45 min為基準(zhǔn)條件進(jìn)行單因素實驗。

菠蘿蛋白酶滅活：將溶液加熱至95℃左右，酶滅活約5 min。

分離：離心分離，收集上清液，沉淀用等體積水洗滌，離心，合并上清液。

沉淀：離心后，降溫，在攪拌下加入乙醇，直至果膠成海綿狀完全沉淀出來。

提純：抽濾后，用乙醇洗滌2次～3次，50℃干燥。

改變條件：菠蘿蛋白酶用量為1 mg/g～9 mg/g；pH為3～7；提取時間15 min～120 min；溫度35℃～60℃；料液比為1∶15～1∶40。

1.3.2 正交試驗設(shè)計

參照單因素實驗的結(jié)果，選擇提取溫度、提取時間、液料比、pH、酶添加量5個實驗因素為研究對象，每項因素選擇4個水平，選用L16（45）進(jìn)行正交試驗見表1。

表1 正交試驗因素與水平Table 1 Factors and levels in orthogonal design

1.3.3 果膠含量的測定

果膠產(chǎn)品分析根據(jù)國家標(biāo)準(zhǔn)GB 25533－2010《食品添加劑果膠》中方法進(jìn)行。

1.4 果膠得率的計算

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗

2.1.1 植物蛋白酶濃度果膠得率的影響

加酶量對果膠得率影響的結(jié)果如圖1所示。

圖1 植物蛋白酶濃度對果膠得率的影響Fig.1 Effect of plant protease concentration on the extraction rate of pectin

采用1 mg/g～7 mg/g蛋白酶提取時，果膠得率隨酶量的增加而增加，但繼續(xù)當(dāng)增加時，果膠得率則開始下降。這是因為酶用量低于7 mg/g時，酶解不徹底，釋放出來的果膠含量較少，使得提取率低；當(dāng)達(dá)到最佳值7 mg/g時，酶解進(jìn)行的較徹底，當(dāng)繼續(xù)增加酶用量時，過量的酶使果膠進(jìn)一步水解，生成的低分子量果膠增加，在過濾洗滌時會損失這部分［14］，使果膠得率降低。所以，7 mg/g為較佳酶濃度。

2.1.2 液料比對果膠得率的影響

液料比對果膠得率的影響見圖2。

圖2 液料比對果膠得率的影響Fig.2 Effect of ratio of raw liquid to material on the extraction rate of pectin

由圖2可知，液料比增加使果膠得率整體呈現(xiàn)增加趨勢，當(dāng)液料比小于30∶1（mL/g）時，果膠的得率隨液料比的增加而迅速增加。這是因為隨著液料比的增加，酶在檸檬皮細(xì)胞內(nèi)有更多的擴(kuò)散空間，使其對細(xì)胞壁纖維素的分解能力增強(qiáng)，從而快速破壞細(xì)胞壁，果膠得以提取出來。當(dāng)液料比大于30∶1時，果膠的得率趨于穩(wěn)定，即繼續(xù)增加溶液體積對果膠得率收益不大，且液料比大易造成浪費，投入工業(yè)生產(chǎn)成本增加。由此可確定30∶1為較佳液料比。

2.1.3 溫度對果膠得率的影響

溫度對果膠的提取影響比較大，有2個原因：一是高溫能增加果膠溶出的傳質(zhì)動力，二是酶具有最適作用溫度［1］。提取溫度對檸檬皮果膠得率的影響見圖3。

圖3 溫度對果膠得率的影響Fig.3 Effect of temperature on the extraction rate of pectin

由圖3可知，果膠在25℃～60℃之間得率變化為：先增加再平緩后降低，主要原因是植物蛋白酶在45℃～55℃之間時活性較高［15］，溫度過高或過低都會導(dǎo)致酶的活性下降，從而導(dǎo)致得率下降，因此酶的提取溫度可選擇在45℃～55℃之間。

2.1.4 提取時間對果膠得率的影響

提取時間對檸檬皮果膠提取率的影響見圖4。

圖4 提取時間對果膠得率的影響Fig.4 Effect of time on the extraction rate of pectin

由圖4可知，隨著時間的增加，果膠得率亦持續(xù)增加，但增加的速率亦呈現(xiàn)出逐步減小的趨勢，90 min到120 min的果膠得率幾乎無增加，因為隨著時間的延長，蛋白酶活力能得到充分的發(fā)揮，酶解反應(yīng)進(jìn)行的就較為完全，果膠溶出的較充分［15］，因此提取時間大于90 min對果膠的提取無實際意義。綜合考慮60 min左右為最佳提取時間。

2.1.5 緩沖液pH對果膠提取的影響

緩沖液pH對檸檬皮果膠得率的影響如圖5。

圖5 緩沖液pH對果膠得率的影響Fig.5 Effect of pH on the extraction rate of pectin

由圖5可知，緩沖液pH在低于5時，果膠得率很低，表明植物蛋白酶在pH＜5時活性很低。pH從5.0到6.0可看出果膠得率迅速增加，這是因為在此pH條件下酶活性迅速增加；在6.0至7.0之間，得率較穩(wěn)定，酶在此pH下活性最高［14］，故緩沖液pH在6.0至7.0之間最為合適。

2.2 植物蛋白酶提取檸檬皮果膠的正交試驗

植物蛋白酶提取檸檬皮中果膠的正交試驗結(jié)果及極差分析見表2。

表2 植物蛋白酶提取檸檬皮果膠的正交試驗結(jié)果Table 2 Orthogonal experiments results of extraction lemon peel pectin by plant protease

由表2的極差分析可知5個因素對果膠得率影響的主次關(guān)系依次為液料比＞酶用量＞pH＞溫度＞提取時間。果膠提取的最優(yōu)組合為A4B3C2D4E2，即最佳組合條件為提取時間50 min，溫度54℃，pH 7.0，酶用量3 mg/g，液料比20∶1。

2.3 最佳工藝條件驗證

按2.2確定的最佳工藝條件：提取時間50 min、溫度54℃、pH 7.0、酶用量3 mg/g、液料比20∶1進(jìn)行3次平行實驗，工藝重現(xiàn)性好，果膠平均得率為27.6%，高于正交試驗中的所有組合，因此該工藝條件為最佳工藝條件。果膠純度均達(dá)到國家標(biāo)準(zhǔn)，最佳工藝條件下果膠純度為70%。

3 結(jié)論

本文研究了采用純天然的植物蛋白酶提取檸檬皮中的果膠。通過單因素并結(jié)合正交試驗，得出植物蛋白酶提取檸檬皮果膠的優(yōu)化工藝為：液料比20∶1，蛋白酶用量3 mg/g，提取溫度54℃，提取時間50 min。該工藝穩(wěn)定可靠，產(chǎn)品符合國家食品安全標(biāo)準(zhǔn)。與其他酶法相比，采用從植物中提取的純天然植物蛋白酶，用量少，而且價格便宜，且其果膠得率高，質(zhì)量好，工業(yè)化應(yīng)用前景十分廣闊。

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Extraction Lemon Peel Pectin by Plant Protease

HAN Peng，HUANG Yu-xin，LI Xue-mei，YE Yan-mei，SONG Li-jie，LIU Yi-wu*
（College of Chemistry and Chemical Engineering，Neijiang Normal University，Neijiang 641199，Sichuan China）

Lemon peel pectin was extracted by using plant protease-alcohol precipitation method.The effect of extraction parameters such as liquid material ratio，pH，extraction time，temperature，enzyme concentration on pectin yield was investigated.The optimal extraction conditions of lemon peel pectin was obtained by orthogonal experimentation on the basis of a series of single-factor experiments.The optimal conditions of extraction was extraction time 50 min，temperature 54℃，pH 7.0，the amount of enzyme 3 mg/g and the ratio of liquid to solid 20∶1.The average extraction rate of pectin was achieved 27.60%under the best conditions．

plant protease；lemon peel；orthogonal experimentation；pectin

10.3969/j.issn.1005-6521.2015.04.014

2014-06-10

大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓(xùn)練計劃項目（X201316）；四川省教育廳培育項目（12ZZ012，14CZ0025）

韓鵬（1993—），男（漢），在讀本科，從事天然產(chǎn)物提取與分離。

*通信作者