液質(zhì)法同時(shí)測(cè)定嬰幼兒乳粉中7種有毒及禁用物質(zhì)殘留

于曉瑾，王浩，楊紅梅，郭啟雷，史海良

（北京市海淀區(qū)產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)所，國(guó)家食品質(zhì)量安全監(jiān)督檢驗(yàn)中心，北京100094）

液質(zhì)法同時(shí)測(cè)定嬰幼兒乳粉中7種有毒及禁用物質(zhì)殘留

于曉瑾，王浩，楊紅梅，郭啟雷，史海良

（北京市海淀區(qū)產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)所，國(guó)家食品質(zhì)量安全監(jiān)督檢驗(yàn)中心，北京100094）

黃曲霉毒素M1、雙酚A、醋酸甲孕酮、己烯雌酚、苯甲酸雌二醇、氯丙嗪和塞拉嗪是嬰幼兒配方乳粉中可能存在的有毒及禁用物質(zhì)。樣品經(jīng)過(guò)復(fù)溶后，采用含1%氨水的乙腈超聲提取，使用MGⅢ-C18色譜柱，經(jīng)梯度洗脫分離，用多反應(yīng)監(jiān)測(cè)正離子或負(fù)離子模式，可以一次性對(duì)嬰幼兒配方乳粉中的7種有毒及禁用物質(zhì)進(jìn)行定性和定量測(cè)定。通過(guò)對(duì)100種市售嬰幼兒配方奶粉進(jìn)行分析，表明該方法可用于嬰幼兒配方奶粉中黃曲霉毒素M1、雙酚A、醋酸甲孕酮、己烯雌酚、苯甲酸雌二醇、氯丙嗪和塞拉嗪殘留的同時(shí)測(cè)定。

嬰幼兒配方乳粉；黃曲霉毒素M1；雙酚A；醋酸甲孕酮；己烯雌酚；苯甲酸雌二醇；氯丙嗪；塞拉嗪

嬰幼兒配方乳粉是以乳類(lèi)及乳蛋白制品為主要原料，加入適量的維生素、礦物質(zhì)和/或其他成分，僅用物理方法生產(chǎn)加工制成的液態(tài)或粉狀產(chǎn)品，適于正常嬰幼兒食用，其能量和營(yíng)養(yǎng)成分能夠滿足嬰幼兒的正常營(yíng)養(yǎng)需要。

黃曲霉毒素M1是動(dòng)物攝入黃曲霉毒素B1后在動(dòng)物體內(nèi)經(jīng)羥基化形成的代謝產(chǎn)物，主要存在于動(dòng)物的乳、腎臟、肝臟、蛋、肉和尿液中，其中以乳中最為常見(jiàn)。黃曲霉毒素M1具有劇毒性和致癌性，WHO將其列為ⅡB類(lèi)致癌物，其性質(zhì)相對(duì)穩(wěn)定，在超高溫牛奶中也能存在。長(zhǎng)時(shí)間食用含低濃度黃曲霉毒素的食物被認(rèn)為是導(dǎo)致肝癌、胃癌、腸癌等疾病的主要原因。雙酚A具有雌激素樣活性，會(huì)造成人類(lèi)內(nèi)分泌、免疫、神經(jīng)系統(tǒng)異常，還會(huì)嚴(yán)重干擾生殖遺傳功能。雙酚A常用來(lái)作為單體合成聚碳酸酯塑料，可用來(lái)加工成食品接觸材料，材料中殘留的雙酚A會(huì)遷移到接觸的食品中，袋裝嬰幼兒食品中有可能會(huì)由于包裝中遷移含有雙酚A殘留。醋酸甲孕酮、苯甲酸雌二醇、己烯雌酚等雌性激素進(jìn)入人體不僅可以導(dǎo)致與內(nèi)分泌相關(guān)的腫瘤、出生缺陷和生育缺陷，還會(huì)對(duì)嬰兒、青少年的生長(zhǎng)發(fā)育造成嚴(yán)重影響，例如，現(xiàn)在兒童出現(xiàn)性早熟現(xiàn)象，就可能是和食物中性激素殘留密切相關(guān)。氯丙嗪、塞拉嗪等藥物由于其較強(qiáng)的毒副作用，國(guó)家規(guī)定其允許作治療用，用于產(chǎn)奶動(dòng)物的治療，但不得在奶中檢出。因此，為了保護(hù)廣大嬰幼兒的健康和利益，應(yīng)及時(shí)建立簡(jiǎn)便、快速、準(zhǔn)確、靈敏度高的嬰幼兒配方乳粉中黃曲霉毒素M1、雙酚A、醋酸甲孕酮、己烯雌酚、苯甲酸雌二醇、氯丙嗪、塞拉嗪殘留的檢測(cè)方法，用以保障嬰幼兒配方乳粉的質(zhì)量安全。

通過(guò)文獻(xiàn)查閱獲知，測(cè)定黃曲霉毒素M1、雙酚A、醋酸甲孕酮、己烯雌酚、苯甲酸雌二醇、氯丙嗪、塞拉嗪的文獻(xiàn)比較多，方法主要是酶聯(lián)免疫法［1-2］、氣質(zhì)聯(lián)用法［3-5］、液相色譜法［6-9］和液質(zhì)聯(lián)用法等［10-14］。由于酶聯(lián)免疫法存在不能定性，假陽(yáng)性等情況；氣質(zhì)聯(lián)用法前處理步驟繁瑣、試劑消耗量大、測(cè)定周期長(zhǎng)；液相色譜法的檢出限較高，且不能進(jìn)行確證；液質(zhì)聯(lián)用技術(shù)是近年來(lái)新興的檢測(cè)技術(shù)，由于其的準(zhǔn)確性、高效性和高靈敏度，符合食品安全檢測(cè)快速高效的要求。

目前，乳粉中雙酚A、醋酸甲孕酮、己烯雌酚、苯甲酸雌二醇、氯丙嗪、塞拉嗪還沒(méi)有的相關(guān)的國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)檢測(cè)方法，也還鮮見(jiàn)液質(zhì)聯(lián)用法同時(shí)檢測(cè)黃曲霉毒素M1、雙酚A、醋酸甲孕酮、己烯雌酚、苯甲酸雌二醇、氯丙嗪、塞拉嗪殘留的報(bào)道。本文中嬰幼兒配方乳粉樣品經(jīng)過(guò)復(fù)溶后，采用含1%氨水的乙腈超聲提取，采用高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜儀進(jìn)行檢測(cè)，可以一次性對(duì)嬰幼兒配方乳粉中的7種有毒及禁用物質(zhì)進(jìn)行定性和定量測(cè)定。

1 材料與方法

1.1 試劑

標(biāo)準(zhǔn)樣品：黃曲霉毒素M1（純度≥98%），雙酚A、醋酸甲孕酮、己烯雌酚、苯甲酸雌二醇、氯丙嗪、塞拉嗪（純度≥99%）：美國(guó)Sigma公司；甲醇和乙腈（色譜純）：德國(guó)Fisher公司；其他試劑均為分析純，國(guó)產(chǎn)。

1.2 儀器

Agilent 6410型串聯(lián)三重四極桿質(zhì)譜儀；Agilent1200型液相色譜儀；RE-2000型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器：上海市亞榮生化儀器廠；KQ-5200型超聲波清洗儀：昆山市超聲儀器有限公司；TGL-16M型高速臺(tái)式冷凍離心機(jī)：湘儀離心機(jī)儀器有限公司；Milli-Q去離子水發(fā)生器：美國(guó)Milli-Q公司。

1.3 標(biāo)準(zhǔn)溶液

標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液：分別稱(chēng)取黃曲霉毒素M1、雙酚A、醋酸甲孕酮、己烯雌酚、苯甲酸雌二醇、氯丙嗪、塞拉嗪標(biāo)準(zhǔn)樣品2 mg（精確至0.1 mg），分別用甲醇溶解，定容至20 mL，配成0.1 mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，放置于-18℃保存。

標(biāo)準(zhǔn)工作溶液：分別吸取1mL雙酚A、己烯雌酚、苯甲酸雌二醇的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液于100mL容量瓶中，用水定容至刻度，配成標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，濃度分別為1 000 ng/mL。分別吸取0.1 mL黃曲霉毒素M1、醋酸甲孕酮、氯丙嗪、塞拉嗪的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液于100 mL容量瓶中，用水定容至刻度，配成標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，濃度分別為100 ng/mL。

1.4 樣品前處理?xiàng)l件

準(zhǔn)確稱(chēng)取5.0 g樣品（精確至0.01 g），置于100 mL比色管中，用40 mL溫水充分溶解后，再用1%氨水的乙腈溶液定容。超聲提取20 min后，上清液經(jīng)濾紙過(guò)濾，吸取25 mL濾液至100 mL蒸發(fā)瓶?jī)?nèi)，于45℃水浴旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至1 mL左右，用2%氨水的甲醇溶液充分溶解后定容至5 mL，0.22 μm有機(jī)相濾膜過(guò)濾。

1.5 液相色譜條件

色譜條件：色譜柱，CAPCELL PAK MGⅢ-C18柱，1.8 μm，150 mm×2.1 mm（i.d.）；流速，0.25 mL/min；柱溫，25℃；進(jìn)樣量，20 μL。

流動(dòng)相體系：流動(dòng)相A，甲醇；流動(dòng)相B，10 mmoL/L乙酸銨緩沖溶液；梯度洗脫程序見(jiàn)表1。

1.6 質(zhì)譜分析條件

離子源，電噴霧離子源（ESI）；掃描方式，黃曲霉毒素M1、醋酸甲孕酮、氯丙嗪、塞拉嗪、苯甲酸雌二醇為正離子模式，雙酚A、己烯雌酚為負(fù)離子模式；檢測(cè)方式，多反應(yīng)檢測(cè)；干燥氣，N2；霧化氣壓力，275.8 kPa；干燥氣溫度，325℃；干燥氣流速，8 L/min；汽化溫度，340℃。

表1 液相色譜流動(dòng)相梯度洗脫程序Table 1 HPLC mobile gradient elution program

2 結(jié)果與分析

2.1 樣品前處理?xiàng)l件選擇

為了充分提取樣品中7種目標(biāo)化合物，分別選擇了乙腈、甲醇、乙酸乙酯做為樣品提取溶液，加標(biāo)回收率均＜50%。隨后發(fā)現(xiàn)含有1%氨水的乙腈能有效地提取樣品中目標(biāo)化合物，而且乙腈也可以有效的去除樣品中的蛋白質(zhì)，因此，選擇1%氨水的乙腈作為樣品提取液。此外，只有當(dāng)定容溶液為堿性時(shí)，目標(biāo)化合物才能充分溶解，因此選擇含2%氨水的甲醇溶液作為定容溶液。

2.2 色譜條件的優(yōu)化

色譜柱的選擇：分別采用了CAPCELL PAK MGⅢ-C18色譜柱、ZORBAX Eclipse XDB-C18色譜柱和ZORBAX SB-Aq色譜柱進(jìn)行分離試驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)CAPCELL PAK MGⅢ-C18色譜柱（1.8 μm，150 mm×2.1 mm）分離效果較好。

流動(dòng)相的選擇：黃曲霉毒素M1、雙酚A、醋酸甲孕酮、己烯雌酚、苯甲酸雌二醇、氯丙嗪、塞拉嗪等7種化合物結(jié)構(gòu)差異較大，且需要正負(fù)兩種電離模式，因此采用10 mmoL/L乙酸銨溶液-甲醇為流動(dòng)相，利用梯度洗脫的方法提高分離及檢測(cè)效果效果。流動(dòng)相10 mmoL/L乙酸銨溶液-甲醇的比例為80∶20，可以去除測(cè)定液中的雜質(zhì)；15 min時(shí)改變比例為5∶95，可以洗脫出測(cè)定液中7種目標(biāo)化合物。通過(guò)上述兩步梯度，在25 min內(nèi)可以較好的分離黃曲霉毒素M1等7種目標(biāo)化合物。

2.3 質(zhì)譜條件的優(yōu)化

采用直接進(jìn)樣方式將標(biāo)準(zhǔn)工作溶液注入離子源中，在負(fù)離子檢測(cè)方式下進(jìn)行母離子全掃描，得到雙酚A和己烯雌酚的分子離子峰，在正離子檢測(cè)方式下進(jìn)行母離子全掃描，得到黃曲霉毒素M1、醋酸甲孕酮、苯甲酸雌二醇、氯丙嗪、塞拉嗪的分子離子峰。根據(jù)歐盟2002/657/EC指令規(guī)定，質(zhì)譜確證方法必須達(dá)到4個(gè)確證點(diǎn)，應(yīng)在確定母離子的基礎(chǔ)上選擇2個(gè)以上的子離子。以該離子峰為母離子，進(jìn)行二級(jí)質(zhì)譜掃描，采集全掃描的二級(jí)質(zhì)譜圖，得到碎片離子信息，再對(duì)得到的二級(jí)質(zhì)譜參數(shù)（如破碎電壓、碰撞能量等）進(jìn)行優(yōu)化，使定性離子與定量離子產(chǎn)生的離子對(duì)強(qiáng)度比例達(dá)到最大，從而得到目標(biāo)化合物的最佳質(zhì)譜參數(shù)，結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 7種化合物的質(zhì)譜參數(shù)Table 2 Parameters of mass spctra of seven compounds

2.4 線性關(guān)系及檢出限

用空白樣品提取溶逐級(jí)稀釋的標(biāo)準(zhǔn)工作液，獲得不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)樣品溶液，依次進(jìn)樣測(cè)定，以目標(biāo)化合物的峰面積為縱坐標(biāo)，其對(duì)應(yīng)的濃度為橫坐標(biāo)制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，并計(jì)算線性方程和相關(guān)系數(shù)。同時(shí)用空白樣品進(jìn)行加標(biāo)實(shí)驗(yàn)，根據(jù)信噪比s/N=3計(jì)算出方法的檢出限，根據(jù)信噪比s/N=10計(jì)算出方法的定量限，結(jié)果見(jiàn)表3。

表3 7種化合物的線性方程、線性關(guān)系、相關(guān)系數(shù)、檢出限及定量限Table 3 The linaer equation，correlation coefficient，limits of detection，LOQ for seven compounds

2.5 回收率和精密度

分3組準(zhǔn)確稱(chēng)取空白樣品6份，每份5.0 g，按照表4分別加入標(biāo)準(zhǔn)樣品。按照前處理方法分別處理后，在相同條件下進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果見(jiàn)表5。

表4 7種標(biāo)準(zhǔn)樣品添加濃度Table 4 The added concentration of seven standard samples

由表5可知，添加了不同濃度的樣品的加標(biāo)回收率介于76.7%～102.9%之間，平均相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為1.29%～8.83%（n=6）?？瞻讟悠分刑砑?種化合物的MRM色譜圖見(jiàn)圖1。

表5 加標(biāo)樣品回收率與相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（n=6）Table 5 Recovery and relative standard deviation（RSD）of in spiled sample（n=6）

圖1 空白樣品中添加7種化合物的MRM色譜圖Fig.1 MRM chromatogram of a blank sample spiled with seven compounds

3 實(shí)際樣品分析及評(píng)價(jià)

利用建立的方法對(duì)市場(chǎng)銷(xiāo)售的100種嬰幼兒配方乳粉進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果顯示僅有一個(gè)樣品中含有黃曲霉毒素M1（濃度為0.31 μg/kg），兩種含有雙酚A（濃度分別為5.1 μg/kg和5.6 μg/kg），其余樣品中7種目標(biāo)物質(zhì)均未檢出。黃曲霉毒素M1的污染來(lái)源是飼料，對(duì)市面上的奶粉檢測(cè)并僅檢出黃曲霉毒素M1一例，可以推斷我國(guó)飼料質(zhì)量穩(wěn)定，未有劣質(zhì)飼料真菌污染的現(xiàn)象；其次由于國(guó)家對(duì)嬰幼兒乳粉的監(jiān)控，使得企業(yè)對(duì)飼料質(zhì)量、成品檢測(cè)建立了規(guī)范流程，有效控制了黃曲霉毒素M1的產(chǎn)生。中國(guó)衛(wèi)生部自2011年6月1日起宣布，禁止雙酚A用于嬰幼兒食品容器的生產(chǎn)和進(jìn)口，有效控制了雙酚A在嬰幼兒乳粉中的遷移。氯丙嗪、醋酸甲孕酮、塞拉嗪、己烯雌酚、苯甲酸雌二醇均為獸藥，100個(gè)樣品均未檢出以上物質(zhì)，可見(jiàn)獸藥物質(zhì)的使用和管理已經(jīng)逐步規(guī)范。

近幾年我國(guó)嬰幼兒配方食品的質(zhì)量管理比較嚴(yán)格，從2009年國(guó)家食品安全法出臺(tái)以后，國(guó)家質(zhì)檢總局又在2010年發(fā)布了《關(guān)于企業(yè)生產(chǎn)嬰幼兒配方奶粉許可條件審查細(xì)則和企業(yè)生產(chǎn)乳制品許可條件審查細(xì)則》，2011年國(guó)家工商總局又下發(fā)了《關(guān)于進(jìn)一步與規(guī)范流通環(huán)節(jié)乳制品市場(chǎng)主體準(zhǔn)入有關(guān)工作的通知》，之后國(guó)務(wù)院辦公廳又下發(fā)了《關(guān)于嚴(yán)厲打擊非法食品添加行為，切實(shí)加強(qiáng)食品添加劑監(jiān)管的通知》。相關(guān)法規(guī)頻頻出臺(tái)，為整頓嬰幼兒乳粉市場(chǎng)，保障嬰幼兒乳粉安全起到了至關(guān)重要的作用。在國(guó)家質(zhì)檢總局2010年發(fā)布生產(chǎn)嬰幼兒配方奶粉許可條件審查細(xì)則后，對(duì)嬰幼兒乳粉的生產(chǎn)企業(yè)重新進(jìn)行了的生產(chǎn)許可申請(qǐng)審核，提高了嬰幼兒乳粉行業(yè)的準(zhǔn)入門(mén)檻，從企業(yè)設(shè)施等基本生產(chǎn)條件的角度為嬰幼兒乳粉質(zhì)量安全提供了基本保證。

4 結(jié)論

建立了嬰幼兒配方乳粉中黃曲霉毒素M1、雙酚A、醋酸甲孕酮、己烯雌酚、苯甲酸雌二醇、氯丙嗪和塞拉嗪的液相色譜-質(zhì)譜測(cè)定方法。該方法樣品加標(biāo)回收率為76.7%～102.9%，平均相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為1.29%～8.83%（n=6）。并利用該方法對(duì)市場(chǎng)銷(xiāo)售的100種嬰幼兒配方乳粉中7種有毒及禁用物質(zhì)殘留情況進(jìn)行檢測(cè)，檢測(cè)結(jié)果表明該方法的靈敏度和準(zhǔn)確度均滿足實(shí)際樣品檢測(cè)的需要。

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Simultaneous Determination of Seven Kinds of Toxic and Prohibited Substances Residues in Infant Milk Powder by LC-MS/MS

YU Xiao-jin，WANG Hao，YANG Hong-mei，GUO Qi-lei，SHI Hai-liang
（Beijing Haidian District Institute of Products Quality Supervision and Inspection，China National Food& safety Supervision and Inspection Center，Beijing 100094，China）

Aflatoxin M1，bisphenol A，medroxyprogesterone acetate，diethylstilbestrol，estradiol benzoate，chlorpromazine and xylazine are toxic and prohibited substances maybe present in infant milk powder.The samples were reconstituted，were ultrasonic extracted with alkaline acetonitrile，the HPLC separation was carried out on a MGⅢ-C18column，with gradient elution.The detection of seven toxic and prohibited substances were carried out in the positive or negative multi-reaction monitoring（MRM）mode.The analysis results of one hundred commercially available infant milk powders can simultaneous determining the residues of aflatoxin M1，bisphenol A，medroxyprogesterone acetate，diethylstilbestrol，estradiol benzoate，chlorpromazine and xylazine in infant milk powder.

infant milk powder；aflatoxin M1；bisphenol A；medroxyprogesterone acetate；diethylstilbestrol；estradiol benzoate；chlorpromazine；xylazine

10.3969/j.issn.1005-6521.2015.04.034

2014-04-28

于曉瑾（1982—），女（漢），工程師，碩士，研究方向：食品工程。