改良的差異裂解法提取混合斑中精子DNA

.泉州市公安局刑偵支隊(duì) .晉江市公安局刑事科學(xué)技術(shù)室 程 沖 王 芳

在強(qiáng)奸類案件中，含有精子的混合斑（陰道拭子、內(nèi)褲等等）是一種常見的檢材，一般采用差異裂解法[1]提取精子DNA。在實(shí)際檢案中，混合斑第一步消化時(shí)間、精子沉淀物洗滌時(shí)間以及純化的時(shí)間都較長，特別是遇到大量混合斑檢材時(shí)，耗費(fèi)時(shí)間更長，本文采用了改良的差異裂解法可以減少提取時(shí)間，并能保證提取結(jié)果。

1 材料與方法

1.1 樣本

本實(shí)驗(yàn)室日常受理的混合斑檢材34份（PSA試紙條檢測均為陽性），其中陰道拭子18例，內(nèi)褲13例，衛(wèi)生紙3例。

1.2 儀器和試劑

9700型擴(kuò)增儀（AB公司）；3130XL型測序儀（AB公司）；DNA IQTM系統(tǒng)（Promega公司）；Loopile First-hand PCR Kit試劑盒；Identifiler Plus試劑盒（AB公司）；磁力架。

1.3 方法

1.3.1 常規(guī)差異裂解法

內(nèi)褲襠部布片剪取約 1cm×1cm，衛(wèi)生紙剪取約1cm×1cm，陰道拭子剪取外層棉花一半，剪碎后放入 1.5ml離心管中，按文獻(xiàn)[1]中差異裂解法消化 34例混合斑檢材中女性成分，洗滌的沉淀物按照文獻(xiàn)[2]中磁珠法提取精子DNA，DNA溶液4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2 改良差異裂解法

（1）內(nèi)褲襠部布片剪取約 1cm×1cm，衛(wèi)生紙剪取約1cm×1cm，陰道拭子剪取外層棉花一半，剪碎后放入 1.5mL離心管中，加入1mL TNE溶液，100μL 10% SDS溶液，10μL 10mg/mL PK溶液，混勻后56℃恒溫保存2小時(shí)。（2）套管離心后轉(zhuǎn)移液體至另一1.5mL離心管，13000r/min 離心3分鐘后，將離心管置于磁力架上，打開蓋子，迅速、平穩(wěn)翻轉(zhuǎn)磁力架傾倒上清液。（3）傾倒后，沉淀物中加入1mL TNE溶液，振蕩后13000r/min 離心3分鐘，再將離心管置于磁力架上，打開蓋子，迅速、平穩(wěn)翻轉(zhuǎn)磁力架傾倒上清液，重復(fù)步驟（3）兩次。（4）TNE洗滌3次后，沉淀物中加入Loopile First-hand PCR Kit試劑盒A-裂解液，95℃ 3分鐘，加B液后振蕩混勻，13000r/min 離心3分鐘，上清液4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.3 DNA擴(kuò)增及產(chǎn)物檢測

采用Identifiler Plus試劑盒在9700型擴(kuò)增儀進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增體系為 10μL，DNA 模板為 1μL，擴(kuò)增參數(shù)參照Identifiler Plus試劑盒操作手冊。取上述 PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)3130XL型測序儀電泳，結(jié)果用GeneMapper ID v3.2軟件進(jìn)行分析，獲得等位基因分型圖譜。

2 結(jié)果

本文中，34例混合斑檢材經(jīng)不同提取方法檢驗(yàn)的結(jié)果見表1。采用改良的差異裂解法提取混合斑中精子 DNA，34例檢材中有 31例獲得了單一男性分型，2例檢材獲得混合STR分型，剩余1例未獲得分型，未獲得分型的檢材經(jīng)涂片鏡檢，未能發(fā)現(xiàn)精子細(xì)胞。比較不同提取方法的檢驗(yàn)結(jié)果，改良的差異裂解法檢出率高于常規(guī)差異裂解法，究其原因，56℃恒溫有助于提高PK消化效率，能進(jìn)一步去除女性成分。改良法在提取時(shí)間上較常規(guī)法將近減少一半，并且對(duì)不同混合斑檢材均有較好的適應(yīng)性。同時(shí)，改良法與常規(guī)法檢驗(yàn)結(jié)果在峰高、平衡性方面無顯著差異。

表1 不同提取方法檢驗(yàn)結(jié)果（檢出單一男性分型）

3 討論

用傳統(tǒng)的差異裂解法處理混合斑檢材時(shí)，上皮細(xì)胞與精子細(xì)胞的分離并不都是完全的，特別是在含有大量女性上皮細(xì)胞且精子細(xì)胞含量少的混合斑檢材中，一些上皮細(xì)胞在第一步消化時(shí)沒有消化干凈，使得精子 DNA溶液中出現(xiàn)女性成分，表現(xiàn)為混合分型，不利于結(jié)果判斷。本文中，由于采用了改良的差異裂解法，在第一步消化時(shí)采用56℃孵育，能提高蛋白酶K裂解效率，精子在二硫基的保護(hù)下不受影響，而女性上皮細(xì)胞則能夠基本消化干凈，因此，改良法在檢出單一男性分型的數(shù)量要高于傳統(tǒng)法，同時(shí)，在第一步消化完畢后，改良法在精子沉淀物的洗滌時(shí)間上也具有較大優(yōu)勢，由于采用磁力架傾倒的方式一步去除洗滌液，減少了移液器的手工操作，降低勞動(dòng)強(qiáng)度，在實(shí)際工作中具有重要意義。

綜上所述，改良的差異裂解法極大程度上減少了提取時(shí)間，提高了勞動(dòng)效率，此改良方法無需特殊設(shè)備，適用于常見的混合斑檢材，在日常檢案中具有較高的應(yīng)用價(jià)值。

[1]鄭秀芬.法醫(yī)DNA分析[M].北京∶中國人民大學(xué)出版社,2002.

[2]鄭秀芬,凌鳳俊,涂政.模板 DNA 磁珠提取法[J].中國法醫(yī)學(xué)雜志, 2003,18（2）∶107.