豬源假結(jié)核耶爾森氏菌的分離與鑒定

石於友，陳汝琎，曾順玉，劉 寧，宋 聰，李美荃，李華春，趙德宏，姚 俊

（1. 云南省巍山縣動物疫病預防與控制中心，巍山 672400；2. 云南省富寧縣動物疫病預防與控制中心，富寧663400；3. 云南省雙江縣畜牧獸醫(yī)技術(shù)推廣中心，雙江 677300；4. 云南農(nóng)業(yè)大學動物科學技術(shù)學院，昆明

650201；5. 云南省畜牧獸醫(yī)科學院 云南省熱帶亞熱帶動物病毒病重點實驗室，昆明 650224）

豬源假結(jié)核耶爾森氏菌的分離與鑒定

石於友1，陳汝琎2，曾順玉3，劉 寧4，宋 聰4，李美荃4，李華春5，趙德宏5，姚 俊5

（1. 云南省巍山縣動物疫病預防與控制中心，巍山 672400；2. 云南省富寧縣動物疫病預防與控制中心，富寧663400；3. 云南省雙江縣畜牧獸醫(yī)技術(shù)推廣中心，雙江 677300；4. 云南農(nóng)業(yè)大學動物科學技術(shù)學院，昆明

650201；5. 云南省畜牧獸醫(yī)科學院 云南省熱帶亞熱帶動物病毒病重點實驗室，昆明 650224）

2014年8月26日云南省富寧縣某生豬散養(yǎng)戶飼養(yǎng)的中大豬群發(fā)生疑似豬丹毒疫情，送檢病死豬組織樣品經(jīng)豬繁殖與呼吸綜合征病毒、豬瘟病毒、偽狂犬病毒、豬圓環(huán)病毒II型的Real-time PCR檢測，結(jié)果均為陰性。同時進行病原體的分離培養(yǎng)，從淋巴結(jié)中分離獲得1株革蘭氏染色陰性桿菌，呈兩極濃染，經(jīng)昆明小白鼠致病性實驗、本動物回歸實驗、細菌生化實驗鑒定，該病原體為假結(jié)核耶爾森氏菌。藥敏實驗結(jié)果顯示該菌株對氧氟沙星、慶大霉素、諾氟沙星、頭孢噻肟高度敏感，對呋喃唑酮、頭孢曲松鈉、四環(huán)素中度敏感，對氨芐青霉素低度敏感，對青霉素耐藥。

假結(jié)核耶爾森氏菌；分離；鑒定；豬

假結(jié)核耶爾森氏菌（Yersinia pseudotuberculosis）屬于腸桿菌科、耶爾森菌屬，是該屬三種致病性菌之一，另兩種為鼠疫耶爾森菌（Yersinia pestis）與小腸結(jié)腸炎耶爾森菌（Yersinia enterocolitica）［1］。耶爾森菌屬細菌為革蘭氏陰性直桿菌或球桿菌，菌體大小（0.5～0.8）μm×（1～3）μm，散在排列，菌體染色呈現(xiàn)兩極濃染現(xiàn)象，無芽孢，周生鞭毛，無莢膜［1］。在營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基上25℃培養(yǎng)24 h后形成的菌落直徑約為0.3～0.6 mm，呈圓形、凸起、光滑、邊緣整齊、無色透明、無特殊氣味，48 h后可擴大到0.8～1.0 mm［1］。耶爾森氏菌在麥康凱及SS培養(yǎng)基上幾乎不生長［1］。假結(jié)核耶爾森氏菌是一種人獸共患的腸道病原菌，流行特點與小腸結(jié)腸炎耶爾森菌很相似，但假結(jié)核耶爾森氏菌能夠感染的動物種類更廣泛，感染率則低于小腸結(jié)腸炎耶爾森菌［1］。人感染假結(jié)核耶爾森氏菌后，臨床癥狀偏于淋巴結(jié)感染和敗血癥，也可形成回腸盲端炎［2］。假結(jié)核耶爾森氏菌感染可引起發(fā)熱、結(jié)節(jié)性紅斑、結(jié)膜炎、關(guān)節(jié)炎、腸系膜淋巴結(jié)炎、冠狀動脈瘤、急性腎炎等。國內(nèi)僅見敗血癥性肺炎、腸炎及腸系膜淋巴結(jié)炎報道［3］。假結(jié)核耶爾森菌感染母牛發(fā)生菌血癥時，可引發(fā)胎兒感染，從而導致流產(chǎn)［4-7］。

2014年8月26日，云南省富寧縣木央鎮(zhèn)睦倫村委會生豬散養(yǎng)戶飼養(yǎng)生豬發(fā)生疫情，發(fā)病豬精神萎頓，高燒不退，食欲廢絕并伴有嘔吐，結(jié)膜充血，糞便干硬并附有粘液，發(fā)病仔豬病程后期下痢。發(fā)病豬耳、頸、背部皮膚潮紅、發(fā)紫，臨死前腋下、股內(nèi)、腹內(nèi)有不規(guī)則暗紅色斑塊，指壓褪色而后又融合在一起（圖1），常于發(fā)病后3～4 d內(nèi)死亡，病死率80%左右，未死亡的發(fā)病豬轉(zhuǎn)為疹塊型或慢性型，臨床初步診斷為疑似豬丹毒。對病死豬進行解剖，經(jīng)病原菌分離培養(yǎng)、昆明小白鼠致病性實驗、本動物回歸實驗及細菌生化實驗等，最終鑒定為假結(jié)核耶爾森氏菌。根據(jù)藥敏實驗結(jié)果指導臨床用藥，迅速控制了疫情的蔓延。本文對假結(jié)核耶爾森氏菌引起豬群發(fā)病的報道在國內(nèi)尚屬首次。

圖1 發(fā)病及病死豬皮膚表面可見暗紅色斑塊（箭頭所示）Fig.1 Dark red patches interspersed on skin surface of infected pigs and dead pigs （indicated by the arrows）

1 材料與方法

1.1 病死豬解剖及樣品采集 病死豬解剖后可見頜下淋巴結(jié)腫大，肝臟、腎臟輕微腫大，肝臟表面有散在出血點，腎臟表面有出血斑，喉頭粘膜面可見出血點。采集股溝淋巴結(jié)、頜下淋巴結(jié)、腸系膜淋巴結(jié)、脾臟、肺臟和肝臟組織，進行Real-time PCR檢測，同時進行病原菌的分離培養(yǎng)。

1.2 主要試劑、菌種、培養(yǎng)基及儀器 營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基、麥康凱培養(yǎng)基、顯色指示劑購自杭州濱和微生物試劑有限公司；新生犢牛血清購自美國生命技術(shù)有限公司（Life Technologies）；革蘭氏染液、腸桿菌科細菌生化編碼鑒定管GYZ-15e、常用新藥敏紙片及細菌培養(yǎng)基購自杭州天和微生物試劑有限公司；假結(jié)核耶爾森氏菌ATCC標準菌株由云南省熱帶亞熱帶動物病毒病重點實驗室保存；病毒DNA提取試劑盒（Viral DNA Kit）、病毒RNA提取試劑盒（Viral RNA Kit）購自美國OMEGA生物技術(shù)有限公司；細菌基因組DNA抽提試劑盒、熒光定量qPCR及qRT-PCR試劑盒、2×Plus Taq酶、DNA Marker DL 2000均購自天根生物技術(shù)（北京）有限公司；一步法RT-PCR試劑盒（One Step RT-PCR Kit）購自大連寶生物（TaKaRa）生物技術(shù)有限公司；普通光學顯微鏡為OLYMPUS CX31顯微鏡；CO2培養(yǎng)箱購自THERMO SCIENTIFIC公司；生物安全柜為ESCO CLASS II TYPE A2；PCR 儀 Gene Amp PCR System 9700、實時熒光 PCR 儀7500 Fast Realtime PCR System、梯度PCR儀均購自 ABI（Applied Biosystems Inc.）公司。

1.3 引物設計 根據(jù)NCBI GenBank假結(jié)核耶爾森氏菌（Yersinia pseudotuberculosis）ATCC 6904株16S rRNA基因參考序列（Accession：NZ_ CP008943.1），設計了1對引物（P-382-F：5'-GGAGTTAGCCGGTGCTTCTT-3'；P-382-R：5'-TGCCTGATGGAGGGGGATAA-3'），PCR產(chǎn)物擴增長度為382 bp。

1.4 實驗動物 昆明成年小白鼠25只購自昆明醫(yī)科大學實驗動物中心。70日齡DLY三元雜仔豬5頭購自云南省畜牧獸醫(yī)科學院實驗豬場。

1.5 豬繁殖與呼吸綜合征病毒歐洲株及美洲株、豬瘟病毒、偽狂犬野毒株、豬圓環(huán)病毒II型Real-time PCR檢測 運用云南省熱帶亞熱帶動物病毒病重點實驗室建立的豬繁殖與呼吸綜合征病毒歐洲株及美洲株、豬瘟病毒、偽狂犬野毒株、豬圓環(huán)病毒II型實時熒光定量PCR檢測方法進行檢測。

1.6 細菌分離鑒定 將樣品劃線接種于血清瓊脂、營養(yǎng)瓊脂及麥康凱瓊脂平板后，置于37℃溫箱培養(yǎng)24～48 h，取少許菌落染色鏡檢觀察形態(tài)。將細菌純化后穿刺接種于TSI試管斜面及腸桿菌科細菌生化編碼鑒定管后，置于37℃培養(yǎng)24～48 h后加顯色劑判讀結(jié)果。

1.7 小白鼠致病性實驗 將純化后的細菌混懸于無菌生理鹽水中，經(jīng)菌數(shù)測定后稀釋為1.5×108個細菌/ mL濃度，每只小白鼠腹腔接種0.1 mL劑量，共接種20只作為實驗組；同時設立5只陰性對照，腹腔接種同等劑量無菌生理鹽水。接種后觀察、記錄發(fā)病及死亡情況，解剖死亡小白鼠觀察病理變化并無菌采集心血及肝臟回收分離病原菌。

1.8 本動物回歸實驗 將純化后的細菌混懸于無菌生理鹽水中，經(jīng)菌數(shù)測定后稀釋為1.5×108個細菌/mL濃度，每只仔豬頸部肌肉接種1mL劑量，共接種4只作為實驗組；同時設立1只陰性對照，頸部肌肉接種同等劑量無菌生理鹽水。接種后觀察、記錄發(fā)病及死亡情況，解剖病死仔豬觀察病理變化并無菌采集心血及肝臟回收分離病原菌。

1.9 基因組離子鑒定 應用細菌基因組DNA抽提試劑盒抽提分離菌株的基因組DNA進行PCR擴增，并切膠回收測序及序列分析。

1.10 藥敏實驗 將純化后的細菌均勻涂布于營養(yǎng)瓊脂平板上，貼上藥敏試紙于37℃培養(yǎng)24 h后取出觀察結(jié)果并測定抑菌圈直徑。

2 結(jié)果

2.1 豬繁殖與呼吸綜合征病毒歐洲株及美洲株、豬瘟病毒野毒株、偽狂犬野毒株、豬圓環(huán)病毒II型Realtime PCR檢測結(jié)果 送檢樣品經(jīng)云南省熱帶亞熱帶動物病毒病重點實驗室建立的豬繁殖與呼吸綜合征病毒歐洲株及美洲株、豬瘟病毒野毒株、偽狂犬野毒株、豬圓環(huán)病毒II型Real-time PCR法檢測，結(jié)果全為陰性。

2.2 細菌分離鑒定結(jié)果 送檢組織樣品經(jīng)接種環(huán)無菌采集樣品后，劃線接種于血清瓊脂、普通營養(yǎng)瓊脂及麥康凱瓊脂平板，37℃培養(yǎng)過夜，在血清瓊脂及普通營養(yǎng)瓊脂平板上形成圓形、凸起、光滑、邊緣整齊、無色透明、無特殊氣味的菌落（見圖2），在麥康凱瓊脂平板不生長。經(jīng)革蘭氏染色鏡檢呈革蘭氏陰性直桿菌，呈兩極濃染現(xiàn)象，散在排列，無芽孢，無莢膜（見圖3）。生化實驗結(jié)果為ONPG、尿素陽性，靛基質(zhì)、VP、苯丙氨酸、賴氨酸、鳥氨酸、枸櫞酸鹽、硫化氫、磷酶、戊唐、棉籽糖、山梨醇、側(cè)金盞花醇、二磷酶陰性，生化鑒定為假結(jié)核耶爾森氏菌。

2.3 小白鼠致病性實驗 接種細菌的20只昆明小白鼠精神萎頓，飲食欲廢絕，打堆，全部于接種后24～53 h內(nèi)死亡，解剖可見肺臟、肝臟、脾臟、腎臟腫大、淤血或出血，并從死亡小白鼠肝臟及心血回收到細菌。5只陰性對照昆明小白鼠無任何臨床癥狀。

圖2 普通營養(yǎng)瓊脂平板上形成的菌落Fig.2 Bacterial colonies on the surface of general nutrition agar plate

圖3 革蘭氏染色鏡檢結(jié)果Fig.3 The results of Gram staining

2.4 本動物回歸實驗 4只70日齡DLY三元雜仔豬接種細菌分離株18 h后表現(xiàn)出精神沉郁，飲食欲廢絕，打堆，部分豬發(fā)抖，嘔吐，糞便干硬，附有粘液，出現(xiàn)腹瀉，體溫升至40℃～42℃，體表及耳部可見不規(guī)則暗紅色淤血斑，指壓后可褪色（圖4）。接種后3～5 d內(nèi)死亡3頭，1頭耐過。1頭陰性對照仔豬無任何臨床癥狀。病死豬解剖后可見肺臟淤血、出血，脾臟腫大、腎臟包膜剝離表面可見有淤血斑，腸系膜淋巴結(jié)腫大、胃腸粘膜脫落，其余內(nèi)臟器官未見異常。

圖4 實驗組仔豬體表及耳部可見不規(guī)則紅色斑塊Fig.4 Irregular dark red patches scattered in the skin of experimental group piglets

2.5 分子鑒定結(jié)果 PCR擴增出大約382 bp的目的片段（圖5），并將測定序列在NCBI GenBank中進行Blast，測定出的序列與假結(jié)核耶爾森菌（Yersinia pseudotuberculosis）16S rRNA基因參考序列同源性高達99%（圖略）。

圖5 分離菌株基因組的PCR擴增結(jié)果Fig.5 PCR results of genome from bacteria isolates

2.6 藥敏實驗結(jié)果 藥敏實驗結(jié)果顯示，分離細菌對氧氟沙星、慶大霉素、諾氟沙星、頭孢噻肟高度敏感，對呋喃唑酮、頭孢曲松鈉、四環(huán)素中度敏感，對氨芐青霉素低度敏感，對青霉素耐藥。

3 討論

日本對假結(jié)核耶爾森氏菌的研究歷史悠久，1913年采澤氏曾對感染本菌而死于敗血癥的男人進行細菌的分離鑒定，以及動物實驗和病理學研究［4］。

圖6 分離菌株藥敏試驗結(jié)果Fig.6 The results of drug sensitive test for bacteria isolates

1973年坪倉等［4］從摘除的闌尾分離出該菌。目前人類假結(jié)核耶爾森氏菌病不僅是小兒科的重要疾病，在日本還發(fā)生過暴發(fā)流行［8］。我國對人的假結(jié)核耶爾森氏菌病報道較多，但對動物的假結(jié)核耶爾森氏菌病報道并不多見，僅見有犢牛、林麝、安哥拉兔及松鼠猴感染發(fā)病的報道［8，9］，目前該菌引起豬致病在國內(nèi)尚未見報道［10-13］。在日本，豬是假結(jié)核耶爾森菌的主要宿主動物，歐洲則以野兔和鳥為主，而國內(nèi)假結(jié)核耶爾森菌的自然宿主動物無從知曉。由于豬、狗、貓與人的日常生活接觸機會較多，因此應該密切注意并防范這些動物成為人感染假結(jié)核耶爾森氏菌的傳染源。動物主要是通過食入被污染的食物或飼料感染假結(jié)核耶爾森氏菌，本文報道的豬假結(jié)核耶爾森氏菌病的發(fā)生是通過食入受野生動物糞尿污染的飲水或飼料感染［14］，還是通過接觸發(fā)病豬或食入受攜帶病原菌豬排泄糞尿污染的飼草或飲水所致，其原因有待進一步調(diào)查。目前假結(jié)核耶爾森菌在日本至少存在有12種血清型，健康帶菌豬群主要以3型為主，另外4b型也是人及動物檢出率較高的血清型［8］，而我國的人及動物優(yōu)勢血清型仍然未知，有待于進一步開展血清學調(diào)查研究。本文報道的豬感染假結(jié)核耶爾森氏菌病例中，發(fā)病豬體溫升高，病死豬體表出現(xiàn)不規(guī)則的暗紅色淤血斑塊，指壓褪色后可融合在一起，與亞急性型（疹塊型）豬丹毒極其相似，因此臨床上很容易做出誤診，應該輔助于實驗室診斷才能做出確診。傳統(tǒng)的細菌分離鑒定方法耗時、費力，為了能在最短時間內(nèi)對該病進行確診，可針對細菌16S rRNA基因的保守區(qū)域設計合成通用引物，進行PCR擴增，對PCR擴增產(chǎn)物切膠回收后測序，在NCBI GenBank進行序列比對分析后，即可做出確診。本病例中，通過選用假結(jié)核耶爾森氏菌高敏的抗菌藥物氧氟沙星、慶大霉素等對發(fā)病豬進行治療，獲得了良好的治療效果。

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ISOLATION AND IDENTIFICATION OF YERSINIA PSEUDOTUBERCULOSIS FROM SWINE IN CHINA

SHI Yu-you1， CHEN Ru-jin2， ZENG Shun-yu3， LIU-Ning4， SONG-Cong4， LI Mei-quan4， LI Hua-chun5，ZHAO De-hong5， YAO Jun5
（1. Weishan Center for Prevention and Control of Animal Disease， Yunnan Province， Weishan 672400， China； 2. Funing Center for Prevention and Control of Animal Disease， Yunnan Province， Funing 663400， China； 3. Shuangjiang Center for Animal Husbandry and Veterinary Technology Promotion， Yunnan Province， Shuangjiang 677300， China； 4. College of Animal Science and Technology， Yunnan Agricultural University， Kunming 650201，China； 5.Yunnan Tropical and Subtropical Animal Virus Diseases Laboratory， Yunnan Animal Science and Veterinary Institute， Kunming 650224， China）

On August 26， 2014 in Funing County，Yunnan Province， many pigs suddenly died for unknown reason. The dead pigs were necropsied and tissue samples were collected for detection of Porcine reproductive and respiratory syndrome virus （PRRSV），Classical swine fever virus （CSFV）， Pseudorabies virus （PRV） and Porcine circovirus type II， （PCV II） as well as bacterial isolation and identifi cation. The results of the Real-time PCR for PRRSV， CSFV， PRV and PCV-II were all negative. Instead， one bacterial strain was obtained from mesenteric lymph node. The bacterial isolate was gram-negative， straight bacillus and strong polar dyeing. Furthermore，the bacterial isolate was examined for its biochemical reactions and pathogenecity in mice and pigs and fi nally identifi ed as Yersinia pseudotuberculosis. The drug susceptibility test showed that the bacterial isolated was highly susceptible to Ofloxacin， Gentamicin，Norfl oxacin and Cefotaxime， moderately susceptible to Furazolidone， Ceftriaxone sodium and Tetracycline， less susceptible to Ampicillin and resistant to Penicillin.

Yersinia pseudotuberculosis； isolation； identifi cation； pig

S852.61

A

1674-6422（2015）05-0036-05

2015-07-08

云南省科技廳科技專項（2012ZA017）

石於友，男，獸醫(yī)師，主要從事獸醫(yī)臨床及實驗室診斷檢測工作

姚俊，E-mail：810535839@qq.com