兔感染日本血吸蟲(chóng)后血漿中宿主源循環(huán)microRNAs變化研究

王宇清，刀金威，朱麗慧，杜曉利，陸 珂，李 浩，劉金明，程國(guó)鋒

（中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院上海獸醫(yī)研究所 農(nóng)業(yè)部動(dòng)物寄生蟲(chóng)學(xué)重點(diǎn)開(kāi)放實(shí)驗(yàn)室，上海200241）

兔感染日本血吸蟲(chóng)后血漿中宿主源循環(huán)microRNAs變化研究

王宇清，刀金威，朱麗慧，杜曉利，陸 珂，李 浩，劉金明，程國(guó)鋒

（中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院上海獸醫(yī)研究所 農(nóng)業(yè)部動(dòng)物寄生蟲(chóng)學(xué)重點(diǎn)開(kāi)放實(shí)驗(yàn)室，上海200241）

循環(huán)性microRNAs不僅參與生命體的重要活動(dòng)調(diào)控，還有望成為某些疾病診斷的新型標(biāo)志分子。為深入探討宿主與血吸蟲(chóng)之間的相互作用機(jī)制并發(fā)現(xiàn)新型診斷標(biāo)志分子，我們對(duì)前期獲得的感染和未感染新西蘭大白兔血漿小RNA的Solexia測(cè)序結(jié)果進(jìn)行生物信息學(xué)分析，對(duì)差異表達(dá)的microRNAs用實(shí)時(shí)定量PCR進(jìn)行驗(yàn)證，同時(shí)對(duì)這些差異表達(dá)的microRNAs的靶基因進(jìn)行了分析。在剔除蟲(chóng)源性序列后，我們發(fā)現(xiàn)了感染和未感染日本血吸蟲(chóng)的新西蘭大白兔體內(nèi)的循環(huán)性宿主源microRNAs 173條，選取了10個(gè)差異表達(dá)的microRNAs利用實(shí)時(shí)定量PCR進(jìn)行驗(yàn)證分析，結(jié)果表明所選取的10個(gè)microRNAs表達(dá)與Solex測(cè)序結(jié)果一致。靶基因的預(yù)測(cè)與分析結(jié)果表明感染血吸蟲(chóng)兔血漿中差異表達(dá)microRNAs的靶基因主要參與細(xì)胞進(jìn)程、代謝調(diào)控、生命調(diào)控、發(fā)育進(jìn)程等生命進(jìn)程調(diào)控。本研究結(jié)果為深入開(kāi)展日本血吸蟲(chóng)與宿主的互作及其寄生的分子機(jī)理提供了基礎(chǔ)。

日本血吸蟲(chóng)；循環(huán)microRNA；靶基因；功能分析

microRNAs（miRNAs）早在1990年就在線蟲(chóng)體內(nèi)被發(fā)現(xiàn)［1-4］，隨后大量研究表明不同物種和組織中均有miRNAs參與細(xì)胞功能調(diào)控［5，6］。最近研究表明miRNAs可在人體的血液、淋巴液和尿液中存在，且這些miRNAs可通過(guò)循環(huán)系統(tǒng)，遞送到機(jī)體的其他組織和器官，進(jìn)而發(fā)揮生物學(xué)調(diào)控功能［7-9］。因此，循環(huán)性miRNAs分子不僅可成為某些疾病診斷的新型標(biāo)志分子，也可能成為疾病病理?yè)p害的關(guān)鍵調(diào)控分子，故而循環(huán)miRNAs本身以及其所調(diào)控的靶基因都可能作為潛在的治療疾病的靶位點(diǎn)。

我們課題組前期研究表明日本血吸蟲(chóng)感染宿主后可在宿主血漿中檢測(cè)到血吸蟲(chóng)特異miRNAs（Bantam、miR-3479、miR-10、miR-3096和miR-0001）［10］。隨后，Hoy等［11］研究也表明感染曼氏血吸蟲(chóng)的小鼠血清中存在血吸蟲(chóng)特異的miRNAs（miR-277、miR-3479-3p和bantam）。He等［12］在感染了日本血吸蟲(chóng)的血清宿主中發(fā)現(xiàn)了miR-223表達(dá)量升高，經(jīng)過(guò)藥物治療后其表達(dá)水平降低，提示了miR-223可能是日本血吸蟲(chóng)診斷標(biāo)志物。Zhu等［13］進(jìn)一步研究表明在感染了日本血吸蟲(chóng)的小鼠血漿中有明顯的循環(huán)性miRNAs的變化，特別是miR-706以及miR-134-5p，并預(yù)測(cè)其參與Caspase-3、Creb1基因的調(diào)控，提示循環(huán)性microRNAs可能在血吸蟲(chóng)的病理?yè)p害中發(fā)揮重要作用。故而，針對(duì)感染日本血吸蟲(chóng)后宿主循環(huán)性miRNAs的研究不僅可發(fā)現(xiàn)血吸蟲(chóng)病診斷新的標(biāo)志分子，而且可從miRNAs視角闡述病原與宿主相互作用機(jī)制［14］。為此，我們利用生物信息學(xué)對(duì)前期獲得的新西蘭大白兔感染血吸蟲(chóng)后血漿miRNAs的Solexia測(cè)序結(jié)果進(jìn)行分析，研究在新西蘭大白兔體內(nèi)與血吸蟲(chóng)感染相關(guān)的宿主源循環(huán)性miRNAs，并預(yù)測(cè)這些miRNAs所調(diào)控的靶基因及其功能。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物以及生物耗材 本研究的動(dòng)物相關(guān)實(shí)驗(yàn)由中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院上海獸醫(yī)研究所動(dòng)物保健及倫理委員會(huì)許可。本研究所用的釘螺由上海獸醫(yī)研究所釘螺室提供，新西蘭大白兔購(gòu)自上海羅涇飛達(dá)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物公司。實(shí)時(shí)定量PCR所用的引物均由Sunny有限責(zé)任公司負(fù)責(zé)合成。

1.1.2 生化試劑及儀器 PCR Mix（2X）、PrimeScript RT reagent Kit（DRRO37A）和SYBR Premix Ex Taq（RR420A）購(gòu)自寶生物工程（大連）有限公司（大連TaKaRa公司）；血漿小RNA提取試劑盒mirVana Protein and RNA Isolation System購(gòu)自Invitrogen公司；PCR擴(kuò)增儀購(gòu)自伯樂(lè)生命醫(yī)學(xué)產(chǎn)品（上海）有限公司；離心機(jī)和Eppendorf 快速實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀購(gòu)自Eppendorf中國(guó)有限公司。

1.1.3 Solexia測(cè)序數(shù)據(jù)庫(kù) 本文分析的感染血吸蟲(chóng)后新西蘭大白兔血漿miRNA數(shù)據(jù)庫(kù)P1和P2以及未感染血吸蟲(chóng)的新西蘭大白兔血漿miRNA數(shù)據(jù)庫(kù)為本實(shí)驗(yàn)室通過(guò)建庫(kù)后測(cè)序獲得［11］，其中P1為感染后14、28 d的新西蘭大白兔混合血漿中的小RNA庫(kù)；P2為感染后10、14、28、32 d的新西蘭大白兔混合血漿的小RNA庫(kù)。

1.2 方法

1.2.1 血液收集、血漿RNA的提取和小RNA庫(kù)的構(gòu)建血液材料的收集、血漿的分離以及血漿RNA的提取和小RNA庫(kù)的構(gòu)建參照文獻(xiàn)［11］。

1.2.2 感染和未感染新西蘭大白兔宿主源循環(huán)小RNA分析 將Solexia測(cè)序數(shù)據(jù)庫(kù)P1和P2以及未感染血吸蟲(chóng)的新西蘭大白兔血漿miRNA數(shù)據(jù)庫(kù)數(shù)據(jù)利用SOAP（http∶//soap.genomics.org.cn/soap1/）與家兔基因組數(shù)據(jù)庫(kù)（ftp∶//ftp.ensembl.org/pub/release-65/fasta/ oryctolagus_cuniculus）進(jìn)行匹配，列出與基因組完全匹配的序列。在Rfam（Version 10.1，http∶//rfam. xfam.org/）中收集的非編碼RNA數(shù)據(jù)庫(kù)與NCBI中GeneBank數(shù)據(jù)（http∶//www.ncbi.nlm.nih.gov/）進(jìn)行BLAST分析，剔除所有與血吸蟲(chóng)序列同源的序列后對(duì)這些小RNA進(jìn)行分類，比如rRNA，tRNA，snRNA以及snoRNA，對(duì)那些沒(méi)有匹配的小RNA進(jìn)一步與miRbase（http∶//www.mirbase.org/，Vision 20）進(jìn)行比對(duì)，以確定其中哪些是已知的miRNA或是同源的miRNA，并將沒(méi)有注釋的小RNAs進(jìn)行新miRNA的預(yù)測(cè)。然后將感染日本血吸蟲(chóng)的新西蘭大白兔血漿的測(cè)序結(jié)果與未感染的大白兔血漿的小RNA測(cè)序結(jié)果進(jìn)行比較分析，找到P1和P2中特有的小RNA。

1.2.3 MicroRNAs靶基因的預(yù)測(cè)和功能分析 利用miRWalk 在線工具（http∶//www.umm.uni-heidelberg. de/apps/zmf/mirwalk/）預(yù)測(cè)miRNAs的靶基因；利用DAVID（http∶//david.abcc.ncifcrf.gov/）數(shù)據(jù)庫(kù)分析其靶基因的功能。

1.2.4 差異miRNAs的qRT-PCR驗(yàn)證分析 將新西蘭大白兔感染了約1000條日本血吸蟲(chóng)尾蚴，參考文獻(xiàn)［11］方法收集感染日本血吸蟲(chóng)后7、14、28、32 d的新西蘭大白兔血液并提取血漿RNA，反轉(zhuǎn)錄所使用的特異性引物以及實(shí)時(shí)定量PCR引物見(jiàn)表1。實(shí)時(shí)定量PCR通用下游引物：5'-GCAGGGTCCGAGGTATTC-3'。逆轉(zhuǎn)錄所使用的反應(yīng)體系：5×PrimeScriptTMBuffer （for Real Time）2μL、PrimeScriptTMRT Enzyme MixⅠ0.5 μL、Specific primer 0.5 μL、Total RNA 25 ng，然后用RNase free H2O 補(bǔ)充至10 μL；反應(yīng)條件：42℃ 30 min，85℃ 5 s，4℃保存。實(shí)時(shí)定量PCR的反應(yīng)體系：cDNA 1μL，SBYR?Premix Ex TaqTMⅡ（2X）10 μL，上游特異性引物0.5 μL，通用下游引物0.5 μL，然后用RNase free H2O 定容至20 μL；反應(yīng)條件：95℃ 30 s，然后（95℃ 5 s，60.5℃ 30 s）45個(gè)循環(huán)。

表1 逆轉(zhuǎn)錄和實(shí)時(shí)定量PCR引物Table 1 Primers for reverse PCR and Real-Time PCR

2 結(jié)果

2.1 感染和未感染兔差異表達(dá)循環(huán)性宿主源已知小

RNA 將兩個(gè)生物學(xué)重復(fù)P1和P2的Solexa數(shù)據(jù)分別與未感染的陰性對(duì)照血漿小RNA測(cè)序結(jié)果比較分析。結(jié)果表明：P1中有721條已知miRNAs，P2中有1101條。其中，在P1和P2兩次實(shí)驗(yàn)中共有的miRNAs 為173條。進(jìn)一步分析表明感染后有64個(gè)已知miRNAs在P1和P2呈現(xiàn)差異表達(dá)（差異倍數(shù)在兩倍以上），其中12個(gè)下調(diào)，52個(gè)上調(diào)（圖1）。

2.2 感染后宿主源特異性循環(huán)miRNAs分布 將P1與P2分別與未感染的家兔血漿小RNAs庫(kù)進(jìn)行比對(duì)，獲得感染后特有的小RNAs并進(jìn)行分類分析（圖2A和2B）。對(duì)未注釋的特異性的小RNA進(jìn)行新miRNAs預(yù)測(cè)，結(jié)果表明P1有191條新miRNAs，P2中有190條新miRNAs。

圖1 宿主血漿中已知miRNAs的差異表達(dá)Fig. 1 Differential levels of circulating miRNAs associated with Schistosoma japonicum

2.3 感染兔特異性循環(huán)miRNAs靶基因預(yù)測(cè) 對(duì)感染兔特異性表達(dá)的宿主源循環(huán)miRNAs以人的數(shù)據(jù)庫(kù)為參考進(jìn)行靶基因預(yù)測(cè)，按五個(gè)軟件都能預(yù)測(cè)到的靶基因?yàn)闃?biāo)準(zhǔn)，結(jié)果在124個(gè)miRNAs中，共獲得了18個(gè)miRNAs以及它們所調(diào)控的共416條靶基因（表2）。

圖2 P1（A）和P2（B）中宿主源特異性小RNA分布Fig. 2 The distribution of specifi c miRNAs from P1（A） and P2（B）

表2 差異表達(dá)的miRNAs靶基因預(yù)測(cè)Table 2 Target genes prediction for differentially expressed miRNAs

2.4 靶基因功能的生物信息學(xué)分析 利用David數(shù)據(jù)庫(kù)提供的在線工具Pather進(jìn)行了靶基因GO聚類分析，結(jié)果他們表明主要參與包括細(xì)胞進(jìn)程、代謝調(diào)控、生命調(diào)控、發(fā)育進(jìn)程等生物學(xué)進(jìn)程。分子功能分析表明他們主要參與結(jié)合、催化活性等分子功能（圖3A、B）。KEGG代謝調(diào)控分析表明，這些miRNAs主要與信號(hào)調(diào)節(jié)通路相關(guān)，13個(gè)靶基因參與了整聯(lián)素信號(hào)通路，9個(gè)參與了p53 通路，8個(gè)參與了促性腺釋放激素受體通路等（圖4）。

圖 3 生物學(xué)進(jìn)程GO聚類分析（A）和分子功能GO聚類分析（B）Fig. 3 GO analysis of biological process （A） and molecular function （B）

圖4 KEGG代謝通路分析Fig.4 The KEGG pathway analysis

2.5 qRT-PCR的驗(yàn)證 將選取的10個(gè)（9個(gè)上調(diào)和1個(gè)下調(diào)miRNAs）與血吸蟲(chóng)感染相關(guān)的宿主源miRNAs利用qRT-PCR進(jìn)行驗(yàn)證分析。結(jié)果表明這些miRNAs的表達(dá)變化均與Solexia測(cè)序結(jié)果相一致（圖5）。

3 討論

圖5 差異表達(dá)的miRNAs的qRT-PCR驗(yàn)證分析Fig. 5 The qRT- PCR result of selected differentially expressed miRNAs

宿主在感染了日本血吸蟲(chóng)之后其體內(nèi)會(huì)發(fā)生一系列的變化，其中宿主體內(nèi)循環(huán)miRNA的變化就是其中之一［12，15］。通過(guò)生物信息學(xué)分析我們篩選出感染兔和未感染兔差異表達(dá)的miRNAs以及特異表達(dá)的miRNAs，總共64條miRNAs，其中上調(diào)52條，下調(diào)12條。通過(guò)實(shí)時(shí)定量PCR，進(jìn)一步驗(yàn)證了一些miRNAs的確在感染后宿主體內(nèi)存在差異表達(dá)。對(duì)這些miRNAs進(jìn)行了靶基因的預(yù)測(cè)，發(fā)現(xiàn)其中18個(gè)miRNA的預(yù)測(cè)靶基因共416個(gè)。Zhu等［13］研究了感染日本血吸蟲(chóng)后小鼠體內(nèi)循環(huán)性miRNAs的變化，發(fā)現(xiàn)總共有11個(gè)miRNAs下調(diào)，25個(gè)miRNAs上調(diào)，其中miR-125b-1-3p在感染后上調(diào)，但本研究發(fā)現(xiàn)它在感染血吸蟲(chóng)的新西蘭大白兔中為下調(diào)，二者剛好相反，提示宿主感染血吸蟲(chóng)后循環(huán)性miRNAs可能存在宿主間的差異性，這有待后續(xù)研究進(jìn)一步查明。

為了更好的推測(cè)這些miRNAs的功能，我們預(yù)測(cè)了miRNAs的靶基因并進(jìn)行了KEGG代謝通路分析，發(fā)現(xiàn)這些差異表達(dá)的循環(huán)性miRNAs主要參與許多重要的信號(hào)傳導(dǎo)調(diào)控，比如p38 MAPK、P53 pathway等，這些信號(hào)通路與多種疾病的發(fā)展進(jìn)程密切相關(guān)。測(cè)序結(jié)果和qRT-PCR驗(yàn)證均表明在感染日本血吸蟲(chóng)的新西蘭大白兔的循環(huán)性miRNAs中miR-10是上調(diào)的，有研究指出在多種癌癥病理過(guò)程中miR-10是上調(diào)的，比如miR-10a在結(jié)腸癌中被發(fā)現(xiàn)，miR-10b在胰腺癌和乳腺癌中被發(fā)現(xiàn)［16］。因此對(duì)感染日本血吸蟲(chóng)的宿主體內(nèi)循環(huán)microRNAs的研究，不僅為發(fā)現(xiàn)血吸蟲(chóng)病的新標(biāo)志物提供線索，進(jìn)而被應(yīng)用于診斷，同時(shí)也加深了我們對(duì)宿主與寄生蟲(chóng)之間相互作用機(jī)制的理解。

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STUDIES ON RABBIT CIRCULATING MICRORNAS ASSOCIATED WITH SCHISTOSOMA JAPONICUM INFECTION

WANG Yu-qing， DAO Jin-wei， ZHU Li-hui， DU Xiao-li， LU Ke， LI Hao，LIU Jin-ming， CHENG Guo-feng
（Key Laboratory of Animal Parasitology， Ministry of Agriculture， Shanghai Veterinary Research Institute， CAAS， Shanghai 200241， China）

Circulating microRNAs are not only involved in the regulation of many life processes， but also considered to be a novel class of biomarkers for diagnosis of diseases. To better understand the interaction mechanisms between hosts and Schistosoma japonicum，the microRNA populations in infected New Zealand rabbits were further analyzed based on our previous Solexia data from infected and uninfected rabbits. Total 173 rabbit microRNAs associated with Schistosoma japonicum infection were obtained， from which 10 microRNAs different between infected and uninfected rabbits were verifi ed in a qRT-PCR. Bioinformatical analysis also indicated that the target genes of these altered microRNAs were putatively involved in many biological processes such as cellular process， metabolic process， biological regulation， developmental process and catalytic activity. The results obtained here provided a basis for further research on interaction between hosts and schistosomes.

Schistosoma japonicum； circulating microRNAs； target genes； functional analysis

S852.735

A

1674-6422（2015）05-0058-07

2015-05-22

國(guó)家自然科學(xué)基金（30901068）

王宇清，男，碩士研究生，預(yù)防獸醫(yī)學(xué)專業(yè)

程國(guó)鋒，E-mail：chenggfeng@yahoo.com.cn