禽內(nèi)源性反轉(zhuǎn)錄病毒ALVE1 LTR轉(zhuǎn)錄水平分析

胡序明，朱文奇，陳世豪，劉洋洋，孫 振，耿拓宇，宋成義，高 波，秦愛建，崔恒宓

（1. 揚(yáng)州大學(xué) 表觀遺傳學(xué)及表觀基因組學(xué)研究所，揚(yáng)州 225009；2. 揚(yáng)州大學(xué)動(dòng)物科學(xué)和技術(shù)學(xué)院，揚(yáng)州225009；3. 揚(yáng)州大學(xué) 教育部禽類預(yù)防醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，揚(yáng)州 225009；4. 江蘇省動(dòng)物重要疫病與人獸共患病防控協(xié)同創(chuàng)新中心，揚(yáng)州 225009）

禽內(nèi)源性反轉(zhuǎn)錄病毒ALVE1 LTR轉(zhuǎn)錄水平分析

胡序明1，2，朱文奇1，2，陳世豪1，2，劉洋洋1，2，孫 振1，2，耿拓宇1，2，宋成義1，2，高 波1，2，秦愛建3，4，崔恒宓1，2

（1. 揚(yáng)州大學(xué) 表觀遺傳學(xué)及表觀基因組學(xué)研究所，揚(yáng)州 225009；2. 揚(yáng)州大學(xué)動(dòng)物科學(xué)和技術(shù)學(xué)院，揚(yáng)州225009；3. 揚(yáng)州大學(xué) 教育部禽類預(yù)防醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，揚(yáng)州 225009；4. 江蘇省動(dòng)物重要疫病與人獸共患病防控協(xié)同創(chuàng)新中心，揚(yáng)州 225009）

本研究以禽內(nèi)源性反轉(zhuǎn)錄病毒ALVE1為研究對象，分析了ALVE1長末端重復(fù)序列（long terminal repeat，LTR）自身轉(zhuǎn)錄的變化規(guī)律。熒光定量PCR結(jié)果顯示LTR在2日齡SPF雞（發(fā)育早期）器官組織中轉(zhuǎn)錄水平高，而在35日齡SPF雞（發(fā)育晚期）器官組織中轉(zhuǎn)錄水平低。焦磷酸測序和熒光定量PCR關(guān)聯(lián)分析發(fā)現(xiàn)，ALVE1 LTR在雞巨噬細(xì)胞系HD11和雞T淋巴細(xì)胞系MSB1細(xì)胞中的轉(zhuǎn)錄水平可能受DNA甲基化調(diào)控，去甲基化處理HD11或MSB1 24 h后，LTR轉(zhuǎn)錄水平顯著增加。通過序列分析發(fā)現(xiàn)ALVE1 LTR高度保守且存在先天性免疫應(yīng)答激活轉(zhuǎn)錄因子如NF-AT、c-JUN等。本研究揭示了ALVE1 LTR自身轉(zhuǎn)錄的變化規(guī)律，為進(jìn)一步分析ALVE1 LTR功能奠定了基礎(chǔ)。

禽內(nèi)源性反轉(zhuǎn)錄病毒；長末端重復(fù)序列；DNA甲基化；表觀遺傳學(xué)

內(nèi)源性反轉(zhuǎn)錄病毒（Endogenous retroviruses）是基因組成分，約占基因組的5%～8%，多以其“前病毒”形式存在。內(nèi)源性反轉(zhuǎn)錄病毒幾乎在所有哺乳動(dòng)物（如人、鼠、貓和羊）和脊椎動(dòng)物（如雞）基因組中存在。研究表明，內(nèi)源性反轉(zhuǎn)錄病毒對胚胎發(fā)育、免疫應(yīng)答、病毒感染以及腫瘤形成具有作用［1-5］，有的與胚胎干細(xì)胞的多能性有關(guān)［4］。通常內(nèi)源性反轉(zhuǎn)錄病毒轉(zhuǎn)錄依賴于病毒長末端重復(fù)序列（long terminal repeats，LTRs），而這些LTRs可以應(yīng)答病毒和宿主的轉(zhuǎn)錄因子［5-7］。LTR具有轉(zhuǎn)錄內(nèi)源性反轉(zhuǎn)錄病毒序列的啟動(dòng)子和增強(qiáng)子功能，此外還有轉(zhuǎn)錄子加尾作用［6，8］。

禽內(nèi)源性反轉(zhuǎn)錄病毒ALVE1含有完整的LTR序列，其表達(dá)調(diào)控機(jī)制目前不是很清楚。本研究首先以SPF雞器官組織分析了LTR在SPF雞發(fā)育過程中的表達(dá)規(guī)律，并對LTR序列進(jìn)行保守性分析。然后，通過焦磷酸測序分析LTR甲基化。最后通過關(guān)聯(lián)分析得出LTR受DNA甲基化調(diào)控，并且去甲基化處理可以激活LTR轉(zhuǎn)錄。目前的研究主要是探索了ALVE1 LTR自身轉(zhuǎn)錄的變化規(guī)律，為進(jìn)一步分析ALVE1的功能奠定了基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 細(xì)胞 SPF白羽種雞蛋由北京梅里亞維通實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司提供，孵化至10日齡后，按常規(guī)方法制備雞胚成纖維細(xì)胞（chicken embryo fibroblast，CEF）；禽巨噬細(xì)胞系（HD11）由揚(yáng)州大學(xué)焦新安教授饋贈(zèng)；雞T淋巴細(xì)胞系（MSB1）由教育部禽類預(yù)防醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室秦愛建教授饋贈(zèng)。

1.2 主要試劑 全基因組提取試劑盒QIAGEN Blood& Tissue Kit、全基因DNA重亞硫酸鹽處理試劑盒EpiTect Fast DNA Bisulfite Kit、焦磷酸測序分析DNA甲基化試劑盒（PyroMark Q24 Advanced CpG Kit、PyroMark Denaturation Sol、PyroMark Wash Buffer和 PyroMark?PCR Kit）購自德國QIGEN公司；總RNA小量制備試劑盒購自美國Axygen公司；反轉(zhuǎn)錄試劑盒PrimeScript RT reagent Kit with gDNA Eraser 和熒光染料試劑SYBR Premix Ex Taq Ⅱ購自日本TaKaRa公司；1640培養(yǎng)基、DMEM和胎牛血清購自GIBCO公司；其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.3 組織收集 將出殼后2日齡和35日齡SPF雞隨機(jī)撲殺3只，迅速剝離新鮮完整的大腦、法氏囊、胸腺、脾臟、心臟、肝臟、腎臟、肺臟和皮膚組織，用冰冷的PBS（pH7.4）清洗以除去血漬，然后迅速放入液氮保存。從液氮中取出組織后迅速轉(zhuǎn)移到提前預(yù)冷清潔的研缽中，液氮環(huán)境下充分研磨后提取總RNA和基因組用于熒光定量和DNA甲基化分析。

1.4 去甲基化試劑AZA處理實(shí)驗(yàn) DNA甲基化抑制劑AZA（5-Aza-2-Deoxycytidine）處理是判斷基因是否受表觀遺傳學(xué)機(jī)制調(diào)控的依據(jù)之一。分別將雞巨噬細(xì)胞系HD11和雞T淋巴細(xì)胞系HD11接種在6孔細(xì)胞培養(yǎng)板里，AZA處理濃度為5 μmol/L，對照組用AZA溶劑DMSO處理，24 h后收集細(xì)胞，用于熒光定量PCR分析。

1.5 基因組提取和DNA甲基化分析 按照全基因組提取試劑盒操作步驟提取基因組DNA，測定濃度后用于DNA甲基化分析。LTR甲基化分析參考文獻(xiàn)［9］，簡要步驟如下：首先根據(jù)ALVE1 LTR序列，用甲基化引物設(shè)計(jì)軟件PyroMark Assay Design 2.0設(shè)計(jì)PCR引物和焦磷酸測序引物，檢測CpG甲基化位點(diǎn)。然后，基因組DNA經(jīng)PyroMark PCR Kit重亞硫酸鹽處理后，在PCR熱循環(huán)儀中擴(kuò)增目的片段。最后通過實(shí)時(shí)定量焦磷酸測序分析儀PyroMark Q24進(jìn)行測序。

1.6 總RNA提取、反轉(zhuǎn)錄和熒光定量PCR 按照Axygen總RNA小量制備試劑盒說明書操作步驟提取總RNA，然后用反轉(zhuǎn)錄試劑盒PrimeScript RT reagentKit with gDNA Eraser將1 μg總RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA產(chǎn)物。cDNA產(chǎn)物稀釋后通過ABI 7500實(shí)時(shí)定量PCR儀進(jìn)行定量分析。反應(yīng)體系：cDNA 模板1 μL、ROX II 0.4 μL、SYBR Green II 10μL、上游和下游引物各2 μL、超純水4.6 μL。反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性30 s；95℃變性5 s，60℃退火34 s，40個(gè)循環(huán)。引物序列參見文獻(xiàn)［9］，LTR為檢測基因，β-actin和GAPDH基因作為內(nèi)參照。

2 結(jié)果

圖1 ALVE1 LTR mRNA在SPF雞組織中的相對轉(zhuǎn)錄水平Fig. 1 Relative level of ALVE1 LTR mRNA in SPF chicken tissues

2.1 ALVE1 LTR在SPF雞發(fā)育過程中的轉(zhuǎn)錄水平規(guī)律熒光定量PCR結(jié)果顯示，ALVE1 LTR在雞大腦、法氏囊、胸腺、脾臟、心臟、肝臟、腎臟、肺臟和皮膚組織中均能表達(dá)且在發(fā)育早期轉(zhuǎn)錄水平很高（圖1）。出殼2日齡SPF雞脾臟、心臟和肺臟組織中，ALVE1 LTR轉(zhuǎn)錄水平偏高。與出殼2日齡SPF雞相比，35日齡SPF雞大多數(shù)組織中ALVE1 LTR轉(zhuǎn)錄水平偏低，而肝臟組織中LTR轉(zhuǎn)錄水平偏高。

2.2 ALVE1 LTR轉(zhuǎn)錄和甲基化關(guān)聯(lián)分析 LTR基因位于ALVE1序列的兩端，可能是控制病毒活性的啟動(dòng)子。我們通過Bisulfite-焦磷酸測序和熒光定量PCR關(guān)聯(lián)分析發(fā)現(xiàn)禽內(nèi)源性反轉(zhuǎn)錄病毒ALVE1 LTR在雞巨噬細(xì)胞系HD11細(xì)胞和雞T淋巴細(xì)胞系MSB1中的轉(zhuǎn)錄可能受到DNA甲基化調(diào)控（圖2）。LTR在MSB1細(xì)胞中的轉(zhuǎn)錄明顯高于其在HD11細(xì)胞，而LTR甲基化水平在MSB1細(xì)胞中明顯低于HD11細(xì)胞。

圖2 ALVE1 LTR轉(zhuǎn)錄水平與DNA甲基化關(guān)聯(lián)分析Fig.2 Association analysis of transcription level and DNA methylation of ALVE1 LTR

2.3 AZA處理激活A(yù)LVE1 LTR轉(zhuǎn)錄 內(nèi)源性反轉(zhuǎn)錄病毒的轉(zhuǎn)錄激活通常受到表觀遺傳調(diào)控，如DNA甲基化。由此，我們通過去甲基化處理實(shí)驗(yàn)觀察去甲基化是否會(huì)激活LTR轉(zhuǎn)錄。結(jié)果顯示：AZA處理雞巨噬細(xì)胞系HD11細(xì)胞24 h后，LTR轉(zhuǎn)錄水平顯著增加（圖3A）；雞T淋巴細(xì)胞系MSB1 經(jīng)AZA處理24 h后，其內(nèi)源性反轉(zhuǎn)錄病毒ALVE1 LTR轉(zhuǎn)錄水平亦顯著增加（圖3B）。這說明ALVE1 LTR的轉(zhuǎn)錄可能受DNA甲基化調(diào)控。

圖3 AZA處理誘導(dǎo)LTR轉(zhuǎn)錄Fig.3 Transcription of ALVE1 LTR induced by AZA treatment

2.4 ALVE1 LTR序列分析 假設(shè)LTR具備調(diào)控內(nèi)源性病毒的活性的能力，那么LTR序列可能存在一些調(diào)控元件或者轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)。利用ALGGENPROMO軟件分析禽內(nèi)源性反轉(zhuǎn)錄病毒ALVE1 5'端非編碼區(qū)LTR序列發(fā)現(xiàn)：ALVE1 LTR存在很多先天性免疫應(yīng)答激活轉(zhuǎn)錄因子如NF-AT、c-JUN、GATA、YY1、p300、SRF等結(jié)合位點(diǎn)（圖4），這與人內(nèi)源性反轉(zhuǎn)錄病毒HERVK LTR存在先天性免疫應(yīng)答激活轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)的分析結(jié)果類似［5］。另外，我們也將來自SPF雞器官組織、雞胚成纖維細(xì)胞CEF、雞巨噬細(xì)胞系HD11和雞T淋巴細(xì)胞系MSB1的LTR的熒光定量PCR產(chǎn)物克隆測序。測序結(jié)果顯示，113 bp LTR產(chǎn)物高度保守，序列同源性為100%（圖5）。

3 討論

研究表明，內(nèi)源性反轉(zhuǎn)錄病毒在宿主細(xì)胞中通過重組可產(chǎn)生獨(dú)立的LTR序列，這些LTR序列作為增強(qiáng)子、啟動(dòng)子等具有表觀遺傳調(diào)節(jié)基因表達(dá)的潛能［8］。本研究通過LTR轉(zhuǎn)錄水平和DNA甲基化關(guān)聯(lián)分析發(fā)現(xiàn)：ALVE1 LTR受到DNA甲基化調(diào)控，并且去甲基化處理誘導(dǎo)LTR轉(zhuǎn)錄。此外，ALVE1 LTR在SPF雞發(fā)育早期轉(zhuǎn)錄水平偏高，而發(fā)育晚期則偏低。然而，在肝臟組織則相反，其不一致可能與組織特異性或者表觀遺傳調(diào)控機(jī)制有關(guān)。

圖4 ALGGEN-PROMO 軟件分析ALVE1 5'LTR轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)Fig.4 Transcription factor binding sites analysis of ALVE1 5'LTR using ALGGEN-PROMO software

圖5 113 bp LTR序列分析Fig.5 Sequence analysis of 113 bp LTR

內(nèi)源性反轉(zhuǎn)錄病毒LTR轉(zhuǎn)錄不僅受到DNA甲基化調(diào)控，還能與先天性免疫系統(tǒng)和與炎癥相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合從而潛在調(diào)節(jié)內(nèi)源性反轉(zhuǎn)錄病毒的轉(zhuǎn)錄。ALGGEN-PROMO軟件分析發(fā)現(xiàn)禽內(nèi)源性反轉(zhuǎn)錄病毒ALVE1 LTR存在很多先天性免疫應(yīng)答激活轉(zhuǎn)錄因子如NF-AT、c-JUN等，這說明禽內(nèi)源性反轉(zhuǎn)錄病毒可能涉及宿主先天性免疫的激活反應(yīng)。據(jù)報(bào)道，Toll樣受體配體刺激可以激活內(nèi)源性反轉(zhuǎn)錄病毒的轉(zhuǎn)錄，而Nucleic Acid-Sensing Toll-樣受體對控制內(nèi)源性反轉(zhuǎn)錄病毒引起的病毒血癥和誘導(dǎo)的腫瘤是必須的［3］。在機(jī)體受到外源性病毒如反轉(zhuǎn)錄病毒（HIV-1和HTLV-1）、皰疹病毒（HSV-1和EBV）感染也可以激活內(nèi)源性反轉(zhuǎn)錄病毒轉(zhuǎn)錄［5，10，11］。這些病毒主要通過編碼的病毒蛋白增加轉(zhuǎn)錄因子與內(nèi)源性反轉(zhuǎn)錄病毒LTR序列上結(jié)合位點(diǎn)（如NF-κB和AP-1）的親和力，從而反式激活內(nèi)源性轉(zhuǎn)錄病毒轉(zhuǎn)錄［5，12］。

綜上所述，我們認(rèn)為LTR是控制禽內(nèi)源性反轉(zhuǎn)錄病毒ALVE1轉(zhuǎn)錄活性的一個(gè)關(guān)鍵因素，其自身轉(zhuǎn)錄受到DNA甲基化調(diào)控。當(dāng)然，ALVE1的轉(zhuǎn)錄活性可能還受到其他因素調(diào)控。目前的研究結(jié)果闡明了ALVE1 LTR自身轉(zhuǎn)錄的變化規(guī)律，為今后研究內(nèi)源性反轉(zhuǎn)錄病毒的功能及其表觀遺傳學(xué)調(diào)控機(jī)制奠定了基礎(chǔ)。

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TRANSCRIPTIONAL ANALYSIS OF AVIAN ENDOGENOUS RETROVIRUS ALVE1 LTR

HU Xu-ming1，2， ZHU Wen-qi1，2， CHEN Shi-hao1，2， LIU Yang-yang1，2， SUN Zhen1，2， GENG Tuo-yu1，2，SONG Cheng-yi1，2， GAO Bo1，2， QIN Ai-jian3，4， CUI Heng-mi1，2
（1. Institute of Epigenetics and Epigenomics， Yangzhou University， Yangzhou 225009， China； 2. College of Animal Science and Technology，Yangzhou University， Yangzhou 225009， China； 3. Ministry of Education Key Lab for Avian Preventive Medicine， Yangzhou University，Yangzhou 225009， China； 4. Jiangsu Co-innovation Center for Prevention and Control of Important Animal Infectious Diseases and Zoonoses， Yangzhou 225009， China）

The long terminal repeat （LTR） of Endogenous retroviruses （ERVs） contains many regulatory sequences， such as promoters，enhancers. Thus， the endogenous LTR activity may be tightly regulated. In this study， the expression pattern of ALVE1 LTR was explored by analyzing the transcription levels of avian Endogenous retroviruses ALVE1 LTR. Real-time PCR results showed that a relative highlevel transcription of ALVE1 LTR in SPF chicken tissues at 2 days （at the early development stages） while low at 35 days（at the late development stages）. Association analysis of LTR suggested that transcription of ALVE1 LTR in chicken macrophage cell line HD11 andchicken T-lymphocyte line MSB1 might be regulated by DNA methylation based on the pyrosequencing and fl uorescence quantitative PCR results. Moreover， transcription levels of LTR were signifi cantly increased in HD11 or MSB1 treated with AZA for 24 hours. The sequence of ALVE1 LTR is highly conserved and contains the activating transcription factor involved in innate immune response such as NF-AT， c-JUN， and so on. This study provided the expression pattern of ALVE1 LTR and the foundation for further research on the function of ALVE1 LTR.

Avian endogenous retroviruses； long terminal repeat （LTR）； DNA methylation； epigenetics

S852.659.3

A

1674-6422（2015）05-0027-05

2015-07-16

國家973項(xiàng)目（2012CB517605）；國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（81171965、81372237、91540117）；江蘇省畜牧學(xué)優(yōu)勢學(xué)科項(xiàng)目；中國博士后科學(xué)基金第57批面上資助項(xiàng)目（2015M571828）

胡序明，男，博士，主要從事內(nèi)源性反轉(zhuǎn)錄病毒功能及其表觀遺傳學(xué)機(jī)制研究

崔恒宓，E-mail：hmcui@yzu.edu.cn；秦愛建，E-mail：aijian@yzu.edu.cn