禽內(nèi)源性反轉(zhuǎn)錄病毒ALVE表觀遺傳學(xué)分析方法的建立及應(yīng)用

朱文奇，胡序明，陳世豪，劉洋洋，孫 振，耿拓宇，宋成義，高 波，王宵燕，秦愛(ài)建，崔恒宓

（1. 揚(yáng)州大學(xué) 表觀遺傳學(xué)及表觀基因組學(xué)研究所，揚(yáng)州225009；2. 揚(yáng)州大學(xué) 教育部禽類預(yù)防醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，揚(yáng)州225009；3. 江蘇省動(dòng)物重要疫病與人獸共患病防控協(xié)同創(chuàng)新中心，揚(yáng)州225009）

禽內(nèi)源性反轉(zhuǎn)錄病毒ALVE表觀遺傳學(xué)分析方法的建立及應(yīng)用

朱文奇1，胡序明1，陳世豪1，劉洋洋1，孫 振1，耿拓宇1，宋成義1，高 波1，王宵燕1，秦愛(ài)建2，3，崔恒宓1

（1. 揚(yáng)州大學(xué) 表觀遺傳學(xué)及表觀基因組學(xué)研究所，揚(yáng)州225009；2. 揚(yáng)州大學(xué) 教育部禽類預(yù)防醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，揚(yáng)州225009；3. 江蘇省動(dòng)物重要疫病與人獸共患病防控協(xié)同創(chuàng)新中心，揚(yáng)州225009）

根據(jù)NCBI公布的禽內(nèi)源性反轉(zhuǎn)錄病毒ALVE1序列設(shè)計(jì)引物，以SPF雞胚制備的成纖維細(xì)胞為生物材料，建立了ALVE基因序列分析、甲基化水平和轉(zhuǎn)錄表達(dá)檢測(cè)方法。以雞胚成纖維細(xì)胞（chicken embryo fibroblast cell，CEF）和巨噬細(xì)胞系（HD11）兩種細(xì)胞的基因組為模板，通過(guò)常規(guī)PCR擴(kuò)增獲得了1912 bp的擴(kuò)增產(chǎn)物，測(cè)序后與內(nèi)源性ALVE1序列比對(duì)，核苷酸同源性高達(dá)98%以上，說(shuō)明擴(kuò)增產(chǎn)物為內(nèi)源性病毒序列。同時(shí)，利用焦磷酸測(cè)序分析LTR片段甲基化水平，結(jié)果顯示，LTR在非免疫細(xì)胞CEF中的甲基化水平顯著高于巨噬細(xì)胞系HD11。利用常規(guī)RT-PCR和熒光定量PCR在兩種細(xì)胞均檢測(cè)到禽內(nèi)源性反轉(zhuǎn)錄病毒LTR基因、gag基因、pol基因和env基因的轉(zhuǎn)錄表達(dá)。本研究為今后分析禽內(nèi)源性反轉(zhuǎn)錄病毒ALVE功能提供了方法，同時(shí)也為深入研究禽內(nèi)源性反轉(zhuǎn)錄病毒ALVE表觀遺傳學(xué)調(diào)控機(jī)制奠定了基礎(chǔ)。

禽內(nèi)源性反轉(zhuǎn)錄病毒；DNA甲基化；表觀遺傳學(xué)

內(nèi)源性反轉(zhuǎn)錄病毒（Endogenous retroviruses）是基因組成分，以其“前病毒”形式存在于宿主基因組中，大部分不表達(dá)，功能很大程度上未知，幾乎在所有哺乳動(dòng)物（如人、鼠、貓和羊）和脊椎動(dòng)物（如雞）基因組中都存在。近年來(lái)，關(guān)于禽內(nèi)源性反轉(zhuǎn)錄病毒的研究主要集中在序列鑒定、分析及其在染色體上的分布［1-3］。人們?cè)陔u基因組上已鑒定出多種雞內(nèi)源性反轉(zhuǎn)錄病毒［4，5］，如E亞群禽白血病病毒（subgroup E avian leukosis viruses，ALVE）或稱ev位點(diǎn)（ev loci）和內(nèi)源性禽反轉(zhuǎn)錄病毒（Endogenous avian retrovirus，EAV）（如EAV-0、EAV-51和EAV-HP）。其中，對(duì)ALVE的關(guān)注和研究最多。

研究表明，ALVE有可能與宿主遺傳抗性和免疫應(yīng)答有關(guān)。然而，其潛在的功能及機(jī)制仍不清楚。表觀遺傳學(xué)是與DNA序列無(wú)關(guān)但能調(diào)節(jié)基因表達(dá)、影響表型的一種遺傳現(xiàn)象。DNA甲基化是一種重要的表觀遺傳機(jī)制，在調(diào)節(jié)基因表達(dá)和維持細(xì)胞功能中起著十分關(guān)鍵的作用。研究發(fā)現(xiàn)，與ALV抗性品系雞line 72（含有ALVE1和2基因）相比，內(nèi)源性ALVE基因在ALV易感品系雞line 63（含有ALVE1和ALVE3基因）中的甲基化水平偏低［6］，這暗示禽內(nèi)源性反轉(zhuǎn)錄病毒ALVE表觀遺傳規(guī)律可能與雞的遺傳抗性有關(guān)。

本研究以SPF雞胚制備的成纖維細(xì)胞為生物材料，建立了ALVE基因序列分析、甲基化水平和轉(zhuǎn)錄表達(dá)檢測(cè)方法。同時(shí)，我們發(fā)現(xiàn)ALVE在兩種細(xì)胞中的表觀遺傳信息存在明顯差異。研究結(jié)果為今后分析禽內(nèi)源性反轉(zhuǎn)錄病毒ALVE表觀遺傳規(guī)律提供了方法，同時(shí)也為深入研究禽內(nèi)源性反轉(zhuǎn)錄病毒ALVE表觀遺傳學(xué)調(diào)控機(jī)制奠定了基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 細(xì)胞 SPF白羽種雞蛋由北京梅里亞維通實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司提供，孵化至10日齡后，按常規(guī)方法制備雞胚成纖維細(xì)胞（chick embryo fibroblast， CEF）。禽巨噬細(xì)胞系（HD11）由揚(yáng)州大學(xué)焦新安教授饋贈(zèng)。

1.2 主要試劑 Axygen總RNA小量制備試劑盒購(gòu)自美國(guó)Axygen公司；反轉(zhuǎn)錄試劑盒PrimeScript RT reagent Kit with gDNA Eraser 和熒光染料試劑SYBR Premix Ex Taq Ⅱ購(gòu)自日本TaKaRa公司；全基因組提取試劑盒QIAGEN Blood& Tissue Kit 、全基因DNA重亞硫酸鹽處理試劑盒EpiTect Fast DNA Bisulfite Kit、焦磷酸測(cè)序分析DNA甲基化試劑盒（PyroMark Q24 Advanced CpG Kit、 PyroMark Denaturation Sol、PyroMark Wash Buffer和PyroMark?PCR Kit）購(gòu)自德國(guó)QIGEN公司；1640培養(yǎng)基、DMEM和胎牛血清購(gòu)自GIBCO公司；其他試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.3 引物設(shè)計(jì)與合成 根據(jù)NCBI公布的禽內(nèi)源性反轉(zhuǎn)錄病毒ALVE1序列（登錄號(hào)：AY013303.1），依次設(shè)計(jì)了1對(duì)PCR擴(kuò)增引物用于檢測(cè)env基因序列，1對(duì)焦磷酸測(cè)序引物用于分析LTR片段甲基化水平，5對(duì)常規(guī)RT-PCR引物和5對(duì)Real-time PCR引物用于檢測(cè)LTR片段、gag、pol和env基因轉(zhuǎn)錄表達(dá)水平。引物委托Invitrogen公司合成，序列見(jiàn)表1。

1.4 基因組DNA提取和PCR擴(kuò)增 分別將CEF和HD11細(xì)胞接種在6孔細(xì)胞培養(yǎng)板里，24 h后收集細(xì)胞。按照全基因組提取試劑盒說(shuō)明書(shū)分別提取基因組DNA，測(cè)定濃度后分兩份保存，一份用于檢測(cè)env基因序列，一份用于DNA甲基化分析。按常規(guī)方法進(jìn)行PCR擴(kuò)增，env引物序列參見(jiàn)文獻(xiàn)［7］。PCR擴(kuò)增體系：cDNA 模板1 μL、5×SF Buffer 4 μL、DNTP mix 0.4 μL、PhantaTMSuper-Fidelity DNA Polymerase 0.4 μL、上下游引物各1μL、超純水12.2μL。反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性3 min，35個(gè)循環(huán)（95℃變性10 s ，68℃退火30 s，72℃延伸2 min），72℃延伸10 min。最后，用3%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物。

1.5 焦磷酸測(cè)序引物設(shè)計(jì) 首先根據(jù)ALVE1 LTR基因序列設(shè)計(jì)PCR引物和焦磷酸測(cè)序引物用于檢測(cè)CpG甲基化位點(diǎn)，引物序列見(jiàn)表1。然后，使用PyroMark Q24 Advanced Software 設(shè)計(jì)測(cè)序目的序列。測(cè)序目的序列：ACGCAAGGACATATGGGCGTAG ACGAAGCTATGCACGATTATATAAGCTGTTGCC ACCATCAAATAAACGCCATTTTACCATTCACCA CATTGG；重亞硫酸鹽轉(zhuǎn)化序列：AYGTAAGGAT ATATGGGYGTAGAYGAAGTTATGTAYGATTATA TAAGTTGTTGTTATTATTAAATAAAYGTTATTTT ATTATTTATTATATTGG在測(cè)序的靶向序列中添加一個(gè)C（紅色標(biāo)記），以檢測(cè)該位置的胞嘧啶是否完全轉(zhuǎn)化。如圖1所示。

1.6 焦磷酸測(cè)序分析LTR甲基化水平 DNA模板經(jīng)PyroMark PCR Kit重亞硫酸鹽處理后，在PCR熱循環(huán)儀中擴(kuò)增目的片段。反應(yīng)體系：LTR上游引物（10 μmol/mL）1 μL、LTR下游引物（10 μmol/ mL）1 μL、重亞硫酸鹽處理后DNA（約 500 ng）2 μL、PyroMark PCR Master Mix 12.5 μL、CoralLoad Concentrate 2.5 μL、滅菌ddH2O 6 μL。反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性15 min，45個(gè)循環(huán)（94℃變性30 s，56℃退火30 s，72℃延伸30s），72℃延伸10 min。最后，利用瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行驗(yàn)證并將條帶大小正確的PCR產(chǎn)物上機(jī)測(cè)序。

表1 本文所使用的引物Table 1 Primers used in this study

圖1 PyroMark Q24 Advanced Software自動(dòng)生成的堿基圖譜Fig. 1 Base map automatically generated by PyroMark Q24 Advanced Software

1.7 總RNA提取和反轉(zhuǎn)錄 分別將CEF和HD11細(xì)胞接種在6孔細(xì)胞培養(yǎng)板里，24 h后收集細(xì)胞并按照Axygen總RNA小量制備試劑盒說(shuō)明書(shū)操作步驟提取總RNA，然后用反轉(zhuǎn)錄試劑盒PrimeScript RT reagent Kit with gDNA Eraser將1 μg總RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA產(chǎn)物。產(chǎn)物于-70℃保存，用于常規(guī)RT-PCR和Realtime PCR分析。

1.8 常規(guī)RT-PCR和RT-qPCR 將CEF和HD11細(xì)胞cDNA產(chǎn)物稀釋后分別用于常規(guī)RT-PCR和Realtime PCR。常規(guī)RT-PCR反應(yīng)體系：cDNA 模板1 μL、Taq酶（Mix）10 μL、上下游引物各1 μL、滅菌ddH2O 7 μL。反應(yīng)條件：94℃預(yù)變性5 min，30個(gè)循環(huán)（94℃變性30 s ，58℃退火30 s，72℃延伸30s），72℃ 10 min。Real-time PCR反應(yīng)體系：cDNA 模板1 μL、ROX II 0.4 μL SYBR Green II 10 μL、上下游引物各2 μL、滅菌ddH2O 4.6 μL。反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性30 s；95℃變性5 s，60℃退火34 s，40個(gè)循環(huán)。

2 結(jié)果

2.1 禽內(nèi)源性反轉(zhuǎn)錄病毒ALVE基因env序列擴(kuò)增 首先以CEF和HD11全基因組DNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增env基因，瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果表明，成功地?cái)U(kuò)增出相應(yīng)產(chǎn)物（圖2），產(chǎn)物片段大小為1912 bp，測(cè)序后與內(nèi)源性ALVE1序列比對(duì)，核苷酸同源性高達(dá)98%以上，說(shuō)明擴(kuò)增產(chǎn)物為內(nèi)源性病毒序列（測(cè)序數(shù)據(jù)未公開(kāi)）。與已發(fā)表的ALVE1基因env序列比對(duì)結(jié)果顯示：在CEF和HD11兩種細(xì)胞基因組中，禽內(nèi)源性反轉(zhuǎn)錄病毒env序列不完全一致，多個(gè)位點(diǎn)呈現(xiàn)單核苷酸多態(tài)性。

圖2 ALVE env基因PCR擴(kuò)增產(chǎn)物電泳圖Fig.2 PCR-amplifi ed products of env gene from ALVE M： DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)（DL2000）； 1： CEF細(xì)胞基因組DNA； 2： HD11細(xì)胞基因組DNA

2.2 禽內(nèi)源性反轉(zhuǎn)錄病毒ALVE基因DNA甲基化水平分析 LTR基因是長(zhǎng)末端重復(fù)序列，位于ALVE1序列的兩端，控制病毒序列的啟動(dòng)子、增強(qiáng)子和多腺苷酸化信號(hào)區(qū)域，所以選擇檢測(cè)兩種細(xì)胞的LTR基因的甲基化水平。用于DNA甲基化分析的擴(kuò)增引物可擴(kuò)增出145 bp產(chǎn)物（圖3）。CEF細(xì)胞基因組和HD11細(xì)胞基因組LTR甲基化圖譜結(jié)果分別如圖4A和圖4B所示。兩種細(xì)胞基因組LTR 4個(gè)CpG位點(diǎn)呈高度甲基化狀態(tài)并存在顯著差異，其中CEF細(xì)胞基因組LTR甲基化程度要高于HD11細(xì)胞。

圖3 ALVE LTR基因PCR擴(kuò)增產(chǎn)物電泳圖Fig.3 PCR-amplifi ed products of LTR gene from ALVE

2.3 禽內(nèi)源性反轉(zhuǎn)錄病毒ALVE基因轉(zhuǎn)錄表達(dá)水平分析 利用常規(guī)RT-PCR和Real-time PCR分別檢測(cè)了禽內(nèi)源性反轉(zhuǎn)錄病毒ALVE在兩種細(xì)胞中的轉(zhuǎn)錄表達(dá)。常規(guī)RT-PCR結(jié)果如圖5A所示，在CFE和HD11細(xì)胞中均能檢測(cè)到禽內(nèi)源性反轉(zhuǎn)錄病毒ALVE LTR、gag、pol和env（GP85和GP37）基因的轉(zhuǎn)錄表達(dá)，其中LTR在CEF細(xì)胞中的轉(zhuǎn)錄水平明顯高于HD11細(xì)胞。通過(guò)Real-time PCR進(jìn)一步分析ALVE在兩種細(xì)胞中的相對(duì)表達(dá)含量發(fā)現(xiàn)，LTR轉(zhuǎn)錄表達(dá)水平在CEF細(xì)胞中比其在HD11細(xì)胞中的轉(zhuǎn)錄表達(dá)水平高61.9倍，而gp85和gp37在HD11細(xì)胞中的轉(zhuǎn)錄表達(dá)比在CEF細(xì)胞中分別高256.6和3.8倍（見(jiàn)圖5）。

3 討論

本研究通過(guò)DNA甲基化分析發(fā)現(xiàn)，與非免疫細(xì)胞CEF相比，LTR甲基化水平在巨噬細(xì)胞系HD11中偏低。定量PCR分析發(fā)現(xiàn)，LTR在巨噬細(xì)胞系HD11中的轉(zhuǎn)錄表達(dá)水平顯著低于非免疫細(xì)胞CEF，而gp85和gp37則顯著高于非免疫細(xì)胞CEF。這一現(xiàn)象與LTR自身的轉(zhuǎn)錄表達(dá)并非一致，而是與gp85和gp37的轉(zhuǎn)錄表達(dá)一致，即LTR高甲基化伴隨gp85和gp37低轉(zhuǎn)錄水平表達(dá)（CEF細(xì)胞），而LTR低甲基化伴隨gp85和gp37高轉(zhuǎn)錄水平表達(dá)（HD11細(xì)胞）。這些結(jié)果說(shuō)明禽內(nèi)源性反轉(zhuǎn)錄病毒ALVE LTR甲基化水平可能與gp85和gp37轉(zhuǎn)錄表達(dá)有關(guān)。

禽內(nèi)源性反轉(zhuǎn)錄病毒ALVE可能在外源性ALV病毒感染過(guò)程中發(fā)揮著一定作用［8，9］。研究發(fā)現(xiàn)，缺乏ALVE基因的品系雞ADOL line 0盡管對(duì)內(nèi)源性ALVE具有抗性（由于缺乏ALVE受體），但是對(duì)外源性ALVA、B、C和J均易感。與原代CEF（含有內(nèi)源性ALVE基因）相比，雞胚成纖維細(xì)胞系DF-1（無(wú)內(nèi)源性ALVE基因）對(duì)ALV感染敏感，并且ALV-A、ALV-B 和 ALV-J均能誘導(dǎo)DF-1形成細(xì)胞病變而原代CEF無(wú)明顯細(xì)胞病變形成［10］。此外，禽內(nèi)源性反轉(zhuǎn)錄病毒在B15I5品系雞（含有ALVE1、ALVE6和ALVE10）中的存在可能降低了宿主對(duì)ALV-J的免疫（與line 0品系雞相比）［11］。胚胎時(shí)期感染內(nèi)源性ALV（RAV0）提高雞對(duì)外源性ALV的易感性即減弱雞對(duì)外源性ALV的抵抗力［12］。與ALV抗性品系雞line 72（含有ALVE1和2基因）相比，內(nèi)源性ALVE基因在ALV易感品系雞line 63（含有ALVE1和ALVE3基因）中的甲基化水平偏低［6］?；谶@些研究，可以看出禽內(nèi)源性反轉(zhuǎn)錄病毒ALVE很有可能與遺傳抗性有關(guān)聯(lián)。

假設(shè)ALVE與遺傳抗性有關(guān)，那么具有ALVE基因的品系雞呈現(xiàn)出不同的遺傳抗性能力，表明其可能與內(nèi)源性反轉(zhuǎn)錄病毒ALVE的表觀遺傳有關(guān)。本研究建立了ALVE表觀遺傳學(xué)分析方法，為今后深入研究禽內(nèi)源性反轉(zhuǎn)錄病毒ALVE的功能及其表觀遺傳學(xué)調(diào)控機(jī)制奠定了基礎(chǔ)。

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DEVELOPMENT AND APPLICATION OF ANALYTICAL METHODS FOR THE EPIGENETIC ALTERATIONS OF AVIAN ENDOGENOUS RETROVIRUS ALVE

ZHU Wen-qi1， HU Xu-ming1， CHEN Shi-hao1， LIU Yang-yang1， SUN Zhen1， GENG Tuo-yu1，SONG Cheng-yi1， GAO Bo1， WANG Xiao-yan1， QIN Ai-jian2，3， CUI Heng-mi1
（1. Institute of Epigenetics and Epigenomics， Yangzhou University， Yangzhou 225009， China； 2.Ministry of Education Key Lab for Avian Preventive Medicine， Yangzhou University， Yangzhou 225009， China； 3. Jiangsu Co-innovation Center for Prevention and Control of Important Animal Infectious Diseases and Zoonoses， Yangzhou 225009， China）

In the present study， methods for analysis of genomic sequence， evaluation of DNA methylation and expression level of Avian endogenous retroviruses ALVE1 were established using chicken embryo fi broblast （CEF） cells and published NCBI information. A product of 1912 bp was amplifi ed from CEF and avian macrophage （HD11） genomes using conventional PCR. The results showed that their sequences shared at least 98% homology to Avian endogenous retroviruses ALVE1， indicating that the amplifi cation product was endogenous viral sequences. In addition， the expression of endogenous viral LTR， gag， pol and env genes were detected in CEF and HD11 cells using conventional RT-PCR and RT-qPCR. Methylation levels of LTR gene in CEF cells were signifi cantly higher than those in HD11. The establishment of methods for analyzing the epigenetic pattern of Avian endogenous retrovirus ALVE would benefi t to further research of its regulatory mechanisms.

Avian endogenous retroviruses； methylation； epigenetics

S852.659.3

A

1674-6422（2015）05-0015-06

2015-07-15

國(guó)家973項(xiàng)目（2012CB517605）；國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（81171965，81372237、91540117）；江蘇省畜牧學(xué)優(yōu)勢(shì)學(xué)科項(xiàng)目；中國(guó)博士后科學(xué)基金第57批面上資助項(xiàng)目（2015M571828）

朱文奇，男，碩士研究生，動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)專業(yè)；胡序明，男，博士，主要從事內(nèi)源性反轉(zhuǎn)錄病毒功能及其表觀遺傳學(xué)機(jī)制研究

崔恒宓，E-mail：hmcui@yzu.edu.cn；秦愛(ài)建，E-mail：aijian@yzu.edu.cn