重組豬瘟病毒C株E2蛋白的豬繁殖與呼吸綜合征病毒的構(gòu)建及鑒定

高 飛，曲澤慧，姜一峰，李麗薇，虞凌雪，周艷君，楊 莘，夏天奇，鄭海紅，童光志

（1. 中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院上海獸醫(yī)研究所，上海 200241；2. 江蘇省動(dòng)物重要疫病與人獸共患病防控協(xié)同創(chuàng)新中心，揚(yáng)州 225009）

·研究論文·

重組豬瘟病毒C株E2蛋白的豬繁殖與呼吸綜合征病毒的構(gòu)建及鑒定

高 飛1，2，曲澤慧1，姜一峰1，2，李麗薇1，虞凌雪1，周艷君1，楊 莘1，夏天奇1，鄭海紅1，童光志1，2

（1. 中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院上海獸醫(yī)研究所，上海 200241；2. 江蘇省動(dòng)物重要疫病與人獸共患病防控協(xié)同創(chuàng)新中心，揚(yáng)州 225009）

本研究在豬繁殖與呼吸綜合征病毒（Porcine reproductive and respiratory syndrome virus，PRRSV）弱毒株（HuN4-F112）感染性克隆的基礎(chǔ)上，在其基因組ORF1b和ORF2之間插入（classical swine fever，CSF）疫苗毒C株的E2基因，并在E2基因3'端下游插入PRRSV的轉(zhuǎn)錄調(diào)控序列6（transcription regulatory sequence 6，TRS6），構(gòu)建成重組全長(zhǎng)感染性克?。╬A-C-E2）。用Swa I線性化該質(zhì)粒，并體外轉(zhuǎn)錄后，將RNA轉(zhuǎn)染MARC-145細(xì)胞并傳代1次，即可拯救出重組病毒vA-C-E2，在至少20代的傳代過(guò)程中能夠保持遺傳穩(wěn)定性。重組病毒與親本病毒vHuN4-F112在病毒滴度、空斑形態(tài)、蛋白表達(dá)等方面沒(méi)有明顯差異；多步生長(zhǎng)曲線結(jié)果顯示，該重組病毒與親本毒具有相似的生長(zhǎng)特性。間接免疫熒光（indirect immunofl uorescence，IFA ）結(jié)果顯示，重組病毒不僅能夠表達(dá)PRRSV N蛋白，也可以表達(dá)豬瘟病毒E2蛋白。本研究結(jié)果為研制CSF和PRRS新型基因重組疫苗奠定了堅(jiān)實(shí)物質(zhì)基礎(chǔ)。

豬繁殖與呼吸綜合征病毒；豬瘟病毒；重組病毒；E2蛋白

豬繁殖與呼吸綜合征病毒（Porcine reproductive and respiratory syndrome virus，PRRSV）屬于套式病毒目、動(dòng)脈炎病毒科、動(dòng)脈炎病毒屬，同屬的成員還包括馬動(dòng)脈炎病毒（Equine arteritis virus，EAV）、猴出血熱病毒（Simian hemorrhagic fever virus，SHFV）、鼠乳酸脫氫酶升高癥病毒（Lactate dehydrogenase elevating virus，LDV）［1，2］。PRRSV給全世界養(yǎng)豬業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失［2］。中國(guó)自2006年爆發(fā)高致病性豬繁殖與呼吸綜合征（highlypathogenic PRRS， HP-PRRS）之后［3-5］，該病一直在我國(guó)豬場(chǎng)中肆虐，區(qū)域性的爆發(fā)時(shí)有發(fā)生。PRRSV基因組為單股正鏈RNA，5'端有5'非翻譯區(qū)（5' UTR）和5'帽結(jié)構(gòu)，3'端有3'非翻譯區(qū)（3' UTR）和3' poly（A）尾，編碼至少10個(gè)讀碼框（open reading frames，ORFs）［1，6］。與其他套式病毒目成員一樣，PRRSV也采用非連續(xù)性轉(zhuǎn)錄的方式轉(zhuǎn)錄出一系列具有5'和3'共末端的亞基因組mRNA（subgenomic mRNA，sg mRNA），用以翻譯結(jié)構(gòu)蛋白GP2a、2b、3、4、5a、5、M和N。在這個(gè)過(guò)程中發(fā)揮重要調(diào)控作用的順式作用元件為病毒的轉(zhuǎn)錄調(diào)控序列（transcription regulatory sequence，TRS），通過(guò)位于5'UTR中的Leader TRS和下游基因編碼區(qū)中的Body TRS的互補(bǔ)配對(duì)，發(fā)揮其調(diào)控作用［6］。由于PRRSV中RNA依賴(lài)的RNA聚合酶（RNA dependent RNA polymerase，RdRp）的自我糾錯(cuò)能力差以及RNA重組的頻繁發(fā)生，PRRSV具有易突變的特性［1］。目前，利用反向遺傳操作系統(tǒng)研究PRRSV病毒分子病毒學(xué)，尤其是病毒變異以及致病性對(duì)于能夠有效防控PRRS變得越來(lái)越迫切。另一方面，基于反向遺傳操作技術(shù)，PRRSV基因組也可以被用作外源基因表達(dá)的載體。病毒基因組ORF7、Nsp2、ORF1b和ORF2的基因間區(qū)，ORF7和3'UTR的基因間區(qū)都曾被用作外源基因插入的位點(diǎn)。插入的基因包括流感的血凝素抗原（hemagglutinin，HA）、綠色熒光蛋白（green fluorescence protein，GFP）、PCV2的衣殼蛋白（Capsid）［7-11］。然而，單純?nèi)诤贤庠椿驑?gòu)建的重組病毒通常并不具備遺傳穩(wěn)定性，在連續(xù)的細(xì)胞傳代過(guò)程中會(huì)丟失一部分外源基因的編碼序列或者發(fā)生堿基突變。但是如果將外源基因置于TRS控制下，使其作為一個(gè)新的亞基因組進(jìn)行轉(zhuǎn)錄及之后的表達(dá)，由此構(gòu)建的突變病毒則具有遺傳穩(wěn)定性［8，10］。PRRSV基因組具有很多重疊的基因編碼區(qū)，這些重疊區(qū)對(duì)于外源基因的插入表達(dá)造成一定的困難。有研究通過(guò)反向遺傳操作將重疊區(qū)拉開(kāi)，但所獲得的病毒在病毒滴度、空斑形態(tài)等病毒學(xué)特性上與親本毒有差異［12］。因此，插入位點(diǎn)的選擇至關(guān)重要。在2型PRRSV基因組中，ORF1b/ORF2、ORF4/ORF5這兩個(gè)位點(diǎn)的相鄰基因編碼區(qū)是有間隔的，成為外源基因插入的較好選擇［8，12］。

豬瘟（classical swine fever，CSF）也是臨床上嚴(yán)重威脅養(yǎng)豬業(yè)的一種嚴(yán)重的接觸性傳染病，造成的經(jīng)濟(jì)損失巨大。其病原豬瘟病毒（Classical swine fever virus，CSFV）的囊膜糖蛋白E2（gp55）是一種重要的保護(hù)性抗原，具有高度的免疫原性，可以誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生高水平的中和抗體［13］。目前已被批準(zhǔn)生產(chǎn)的豬瘟標(biāo)記疫苗是Advasure（Pfizer，UK）和Porcilis Pesti（ntervet，the Netherlands），二者均是以豬瘟病毒E2蛋白為基礎(chǔ)研發(fā)的亞單位疫苗。臨床上，PRRSV和CSFV兩種疫苗均被廣泛應(yīng)用于豬場(chǎng)免疫中，但是由于二者免疫反應(yīng)的相互干擾，很難獲得較好的免疫效果。因此，通過(guò)反向遺傳操作技術(shù)，研發(fā)一種新型基因工程重組疫苗，使其能夠同時(shí)對(duì)兩種病原產(chǎn)生免疫反應(yīng)變得至關(guān)重要。

基于以上研究背景，在高致病性豬繁殖與呼吸綜合征病毒細(xì)胞致弱疫苗株vHuN4-F112［5，14］感染性克隆基礎(chǔ)上，插入CSFV疫苗株C株的E2蛋白基因，獲得能夠穩(wěn)定表達(dá)豬瘟C株E2蛋白的重組PRRSV，對(duì)其進(jìn)行一系列病毒學(xué)特性分析及遺傳穩(wěn)定性檢測(cè)，并在病毒復(fù)制、轉(zhuǎn)錄、翻譯水平對(duì)其與親本病毒進(jìn)行比較分析，初步評(píng)估其作為疫苗候選株的可行性。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細(xì)胞與病毒 非洲綠猴腎細(xì)胞（MARC-145）由中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院上海獸醫(yī)研究所豬病實(shí)驗(yàn)室（以下簡(jiǎn)稱(chēng)本實(shí)驗(yàn)室）保存；高致病性豬繁殖與呼吸綜合征病毒（GenBank登錄號(hào)：EF635006）的細(xì)胞傳代致弱株vHuN4-F112［5，14］在本實(shí)驗(yàn)室中作為親本病毒對(duì)照與嵌合突變病毒作比較；文中所用到的豬瘟病毒C株來(lái)源于豬瘟弱毒疫苗株［13］（GenBank登錄號(hào)：AF091507）。

1.1.2 試劑 限制性內(nèi)切酶購(gòu)自NEB和TaKaRa公司；TOP10感受態(tài)細(xì)胞購(gòu)自TIANGEN公司；化學(xué)轉(zhuǎn)染試劑DMRIE-C試劑購(gòu)自Invitrogen公司；突變PCR用聚合酶為pfu II DNA Polymerase購(gòu)自Strategene公司；OPTI-MEM購(gòu)自Invitrogen公司；RT-PCR反轉(zhuǎn)錄酶為AMV購(gòu)自TaKaRa公司；PRRSV的N蛋白的單抗由本實(shí)驗(yàn)室保存；CSFV E2蛋白的單抗由中國(guó)獸醫(yī)藥品監(jiān)察所王琴研究員惠贈(zèng)；熒光二抗Alexa Fluor 488/568-labeled goat anti-mouse IgG（H+L）購(gòu)自Invitrogen公司。

1.1.3 主要儀器 超凈工作臺(tái)為上海三超凈化設(shè)備有限公司產(chǎn)品；DNA Thermal Cycler480 PCR儀為美國(guó)PERKIN ELMER公司產(chǎn)品；恒溫培養(yǎng)搖床（型號(hào)THZ-C）為江蘇太倉(cāng)實(shí)驗(yàn)設(shè)備廠產(chǎn)品；恒溫培養(yǎng)箱為上海醫(yī)療器械七廠產(chǎn)品；水平電泳儀（型號(hào)DY-a）為上?？颠_(dá)電子儀器廠產(chǎn)品；熒光倒置顯微鏡為Olympas公司產(chǎn)品；離心機(jī)（型號(hào)5415D）為Eppendorf公司產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 重組質(zhì)粒構(gòu)建 高致病性PRRSV細(xì)胞傳代致弱株感染性克隆pHuN4-F112由中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院上海獸醫(yī)研究所豬病室構(gòu)建和保存。通過(guò)SOE PCR的方法獲得重組豬瘟病毒C株的E2蛋白基因的PRRSV突變片段，其中一個(gè)模板為從豬瘟疫苗毒中抽提的病毒RNA?；厥找院笥肁sc I 和EcoR V雙酶切，酶切回收產(chǎn)物通過(guò)T4連接酶連接至經(jīng)同樣雙酶切的pHuN4-F112，由此構(gòu)建全長(zhǎng)突變克隆pA-C-E2。用Asc I和EcoR V對(duì) pA-C-E2進(jìn)行雙酶切鑒定，檢驗(yàn)其在ORF1b和ORF2之間是否成功插入豬瘟病毒C株的E2蛋白基因。本文中所用到的引物見(jiàn)表1，構(gòu)建方法示意圖見(jiàn)圖1。

1.2.2 病毒拯救及純化傳代 待六孔板的MARC-145細(xì)胞長(zhǎng)到密度大約80%時(shí)，用DMRIE-C轉(zhuǎn)染試劑（Ambion，Austin，TX）以等量（2 μg）pA-C-E2和pHuN4-F112的體外轉(zhuǎn)錄RNA轉(zhuǎn)染MARC-145細(xì)胞［14］，在5%CO2、37℃溫箱中培養(yǎng)，轉(zhuǎn)染72 h后，收集上清，作為初次拯救的第一代病毒，命名為vAC-E2，標(biāo)記為P1并接種于MARC-145細(xì)胞，每天觀察細(xì)胞病變（cytopathic effect，CPE）。當(dāng)出現(xiàn)80%的病變時(shí)，收集上清并保存于-80℃，作為第二代病毒，標(biāo)記為P2。P2代病毒液稀釋1000倍后，接種于新鮮的MARC-145細(xì)胞，感染后72 h收集病毒上清，標(biāo)記為P3，以相同的方式收集P2～P5代病毒（稀釋傳代）［15，16］。從第6代病毒（P6）開(kāi)始，每代進(jìn)行空斑純化傳代，一直傳代至第20代（P20）。具體操作步驟見(jiàn)參考文獻(xiàn)［7］。

1.2.3 傳代病毒突變位點(diǎn)的鑒定 將感染MARC-145細(xì)胞的病毒上清用QIAamp Viral RNA Mini Kit（QIAgen，Hilden，Germany）提取病毒RNA，參考說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作。以提取好的RNA為模板，使用Thermo公司的反轉(zhuǎn)錄試劑盒進(jìn)行RNA反轉(zhuǎn)錄，得到相應(yīng)的cDNA，利用該模板及相應(yīng)的引物（HF11805與HR12100見(jiàn)表1）得到突變位點(diǎn)所在的PCR片段，PCR產(chǎn)物經(jīng)1%的瓊脂糖凝膠電泳鑒定及純化后，送Invitrogen公司進(jìn)行測(cè)序，測(cè)序結(jié)果用DNAStar軟件與HuN4-F112基因進(jìn)行比對(duì)分析。

表1 本研究所用引物Table 1 Primers used in this study

1.2.4 間接免疫熒光（indirect immunofluorescence analysis，IFA） 將P20代的病毒感染MARC-145細(xì)胞48 h后，棄去維持液培養(yǎng)基。冰甲醇固定10 min，1% BSA室溫封閉30 min，用1∶600倍比稀釋的PRRSV N蛋白的特異性單抗（SR30A，Rural Technology，LTD）或1∶1000倍比稀釋的CSFV E2蛋白的特異性單抗，37℃孵育2 h，再分別加入Alexa Fluor 488/568 -labeled羊抗鼠的熒光二抗（1∶800倍比稀釋?zhuān)?7℃孵育1 h，PBS洗5遍后［15，16］，用1 μ g/mL的4'，6'-diamidino-2-phenylindole （DAPI）對(duì)細(xì)胞核進(jìn)行染色，孵育5 min。用PBS對(duì)細(xì)胞單層進(jìn)行最后3次洗滌，在倒置熒光顯微鏡下觀察結(jié)果，并拍照。

1.2.5 嵌合病毒遺傳穩(wěn)定性 將P5、P10、P15、P20代的vA-C-E2病毒培養(yǎng)上清抽提RNA，反轉(zhuǎn)錄后擴(kuò)增突變區(qū)域并測(cè)序，鑒定外源基因的完整性及周邊序列有無(wú)突變位點(diǎn)的引入［15，16］，并對(duì)以上4個(gè)代次的vA-C-E2進(jìn)行N蛋白和豬瘟E2蛋白間接免疫熒光鑒定用以重組豬瘟C株E2蛋白的PRRSV的遺傳穩(wěn)定性鑒定。

1.2.6 拯救病毒vA-C-E2的生物學(xué)特性分析

1.2.6.1 空斑形態(tài)學(xué)分析 將本研究中所有的第六代（P6）拯救病毒用DMEM系列稀釋后，用300 μL感染六孔板中的MARC-145細(xì)胞，37℃孵育1 h后，棄掉病毒液，加入等比例的2%低熔點(diǎn)瓊脂糖與2×MEM，再加入4%FBS（終濃度為含2%FBS的MEM，含1%的瓊脂糖），5 mL/孔鋪到6孔細(xì)胞板中。室溫凝固后，于37℃培養(yǎng)箱倒置培養(yǎng)4～5 d，待出現(xiàn)空斑后，在孔中加入2 mL 4%的甲醛溶液固定1 h，甩掉凝膠，用5%結(jié)晶紫溶液（溶于20%乙醇溶液）染色［7，12，15，16］。

1.2.6.2 多步生長(zhǎng)曲線的繪制 將300 μL系列傳代的P20代病毒上清（0.01MOI）接種于MARC-145細(xì)胞，37℃孵育1 h后，棄掉病毒液，每孔補(bǔ)充3 mL含有2% FBS的MEM培養(yǎng)基，置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中，并在不同時(shí)間點(diǎn)（6、12、24、36、48、60、72、84、96、108、120 h）收集200 μL細(xì)胞上清，同時(shí)補(bǔ)充200 μL新的含2% FBS的MEM培養(yǎng)基。測(cè)定每個(gè)時(shí)間點(diǎn)的病毒滴度并以TCID50表示［17］，用GraphPad軟件繪出病毒的多步生長(zhǎng)曲線［7，15，16］。

2 結(jié)果

2.1 表達(dá)豬瘟C株E2蛋白的PRRSV全長(zhǎng)感染性克隆的構(gòu)建與MARC-145細(xì)胞感染性檢測(cè) 基于北美型（type 2） 全長(zhǎng)感染性克隆pHuN4-F112，在其ORF1b的終止密碼子和ORF2的起始密碼子之間通過(guò)SOEPCR的方法插入豬瘟C株E2蛋白基因和TRS6。具體構(gòu)建方法如圖1，將構(gòu)建好的感染性克隆pA-C-E2進(jìn)行EcoR V和Asc I雙酶切，可以看出pA-C-E2出現(xiàn)大小約為1363 bp的條帶，說(shuō)明豬瘟病毒C株E2蛋白基因成功插入，結(jié)果見(jiàn)圖2。將重組突變體克隆pA-C-E2及親本全長(zhǎng)克隆pHuN4-F112進(jìn)行線性化體外轉(zhuǎn)錄，將體外轉(zhuǎn)錄的RNA轉(zhuǎn)染MARC-145細(xì)胞并傳代，二者成功拯救出病毒并依次命名為vA-C-E2和vHuN4-F112，因此，說(shuō)明pA-C-E2和pHuN4-F112在MARC-145細(xì)胞上拯救出相應(yīng)病毒vA-C-E2和vHuN4-F112（圖3）。

圖1 重組突變?nèi)L(zhǎng)克隆pA-C-E2的構(gòu)建示意圖Fig.1 Schematic for construction of recombinant full-length cDNA clone pA-C-E2

圖2 重組突變?nèi)L(zhǎng)克隆pA-C-E2的EcoR V和Asc I 雙酶切鑒定圖譜Fig.2 Electrophoresis identifi cation of recombinant full-length cDNA clone pA-C-E2 with EcoR V and Asc I digestion

圖3 重組突變?nèi)L(zhǎng)pA-C-E2和親本pHuN4-F112的拯救Fig.3 The infectious identifi cation for the mutant pA-C-E2 and the pHuN4-F112

2.2 重組突變病毒與親本病毒N蛋白表達(dá)水平的比較 將等量（0.01 MOI）的重組病毒vA-C-E2與親本毒vHuN4-F112感染MARC-145細(xì)胞后，收上清，并接種于新鮮MARC-145，由2.1中所得的結(jié)果得知，接種第60～72 h病毒量達(dá)到峰值。取接種病毒第60 h細(xì)胞上清進(jìn)行間接免疫熒光檢測(cè)PRRSV核衣殼蛋白（N）和CSFV囊膜糖蛋白E2的表達(dá)。由圖4可見(jiàn)，重組突變病毒vA-C-E2轉(zhuǎn)染孔中與親本毒vHuN4-F112轉(zhuǎn)染孔中均檢測(cè)大范圍抗N蛋白的特異性熒光，并且熒光水平相當(dāng)，說(shuō)明重組病毒vAC-E2和親本病毒vHuN4-F112具有相似的復(fù)制能力。另外，在CSFV E2蛋白的檢測(cè)中，發(fā)現(xiàn)重組突變病毒vA-C-E2感染孔中出現(xiàn)了大量的針對(duì)豬瘟E2蛋白的特異性熒光。而親本毒和空白對(duì)照孔中無(wú)任何熒光信號(hào)，說(shuō)明vA-C-E2能夠表達(dá)豬瘟E2蛋白。對(duì)P5、P10、P15、P20代的vA-C-E2進(jìn)行了相同的IFA檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)隨著傳代次數(shù)的增加，vA-C-E2表達(dá)E2蛋白的水平并無(wú)明顯差異，由此說(shuō)明在蛋白表達(dá)層面上重組突變病毒具有遺傳穩(wěn)定性（圖略）。2.3 重組突變病毒的遺傳穩(wěn)定性分析 選取P5、P10、P15、P20的突變病毒vA-C-E2進(jìn)行基因組RNA的抽提，反轉(zhuǎn)錄后擴(kuò)增突變區(qū)域，克隆測(cè)序以檢測(cè)插入的豬瘟C株E2蛋白基因的遺傳穩(wěn)定性。圖5結(jié)果顯示，vA-C-E2至少可以在連續(xù)20次的傳代過(guò)程中保持遺傳穩(wěn)定。

圖4 免疫熒光分析vA-C-E2重組突變病毒感染MARC-145細(xì)胞后的蛋白表達(dá)Fig.4 IFA for structural protein expression in MARC-145 cells infected with vA-C-E2

圖5 重組突變病毒的遺傳穩(wěn)定性分析Fig.5 Genetic stability analysis for vA-C-E2

2.4 重組病毒與親本毒在病毒生物學(xué)特性水平的比較對(duì)突變病毒vA-C-E2和親本病毒vHuN4-F112（選取P20病毒）進(jìn)行空斑形態(tài)學(xué)比較（圖6），結(jié)果表明突變病毒在空斑形態(tài)、數(shù)目上均與親本病毒無(wú)顯著差異多步生長(zhǎng)曲線結(jié)果（圖7）顯示，vA-C-E2和vHuN4-F112也無(wú)明顯差異，證明了重組突變病毒與親本病毒在病毒學(xué)特性水平差異不顯著。vHuN4-F112在病毒學(xué)特性方面無(wú)顯著差異，并且同時(shí)可以表達(dá)PRRSV的N蛋白和CSFV的E2蛋白，可以作為一種能夠同時(shí)為PRRSV和CSFV感染提供保護(hù)的疫苗候選株，能夠突破臨床上兩個(gè)病毒疫苗同時(shí)使用所造成的相互影響，減少免疫次數(shù)，達(dá)到一針?lè)纼刹〉男Ч?/p>

圖6 突變病毒與親本病毒的空斑形態(tài)學(xué)比較Fig.6 Plaque morphology comparison for the mutant virus and parental virus

圖7 重組突變病毒與親本病毒的多步生長(zhǎng)曲線Fig.7 The multi-step growth curves of the mutant virus and the parental virus

3 討論

通過(guò)反向遺傳操作技術(shù)，在PRRSV感染性克隆的基礎(chǔ)上，插入外源基因，使PRRSV基因組成為外源基因表達(dá)的載體，目前已有不少報(bào)道和研究［7-11］。本研究通過(guò)SOE PCR的方法，獲得融合豬瘟C株E2蛋白基因的突變片段，并在外源基因3端下游插入此病毒的TRS6，然后利用HuN4-F112基因組上的兩個(gè)單酶切位點(diǎn)Asc I和EcoR V，通過(guò)雙酶切突變片段替換全長(zhǎng)感染性克隆pHuN4-F112上的相應(yīng)片段，構(gòu)建了PRRSV重組豬瘟C株E2蛋白的突變?nèi)L(zhǎng)克隆pAC-E2，經(jīng)過(guò)MARC-145細(xì)胞的轉(zhuǎn)染與傳代之后，發(fā)現(xiàn)pA-C-E2可以拯救出活病毒vA-C-E2，此病毒在病毒滴度、空斑形態(tài)等與親本病毒vHuN4-F112無(wú)顯著差異，并且能夠穩(wěn)定表達(dá)豬瘟E2蛋白。對(duì)其遺傳穩(wěn)定性分析發(fā)現(xiàn)，該病毒能夠在至少20代的連續(xù)細(xì)胞傳代過(guò)程中保持遺傳穩(wěn)定，插入的E2蛋白基因未發(fā)生缺失或插入突變，也未被檢測(cè)到有堿基突變的引入。這種構(gòu)建的方法較之前的研究［8，10］免去了外源酶切位點(diǎn)的插入，降低了與親本病毒的差異，減少了外源基因的引入，從而提高了病毒的穩(wěn)定性。PRRSV基因組是高度濃縮的RNA，許多臨近的ORF之間有重疊區(qū)，而ORF1b與ORF2之間存在1 bp的間隔（A），不存在重疊基因，更有利于外源基因的插入［8，12］。另外使外源基因作為一個(gè)新的亞基因組mRNA進(jìn)行轉(zhuǎn)錄和表達(dá)［8，10］，能夠最大程度上維持外源基因的遺傳穩(wěn)定性。本研究中所獲得的表達(dá)豬瘟病毒C株E2蛋白的重組病毒vA-C-E2與親本疫苗毒

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CONSTRUCTION AND ANALYSIS OF RECOMBINANT PORCINE
REPRODUCTIVE AND RESPIRATORY SYNDROME VIRUS EXPRESSING E2
PROTEIN OF CLASSICAL SWINE FEVER VIRUS C STRAIN

GAO Fei1，2， QU Ze-hui1， JIANG Yi-feng1，2， LI Li-wei1， YU Ling-xue1， ZHOU Yan-jun1，YANG Shen1，XIA Tian-qi1， ZHENG Hai-hong1， TONG Guang-zhi1，2
（1. Shanghai Veterinary Research Institute， CAAS， Shanghai 200241， China； 2. Jiangsu Co-innovation Center for Prevention and Control of Important Animal Infectious Diseases and Zoonoses， Yangzhou 225009， China）

Based on type 2 Porcine reproductive and respiratory syndrome virus （PRRSV） full-length infectious cDNA clone pHuN4-F112， using SOE PCR， the E2 gene of Classical swine fever virus （CSFV） C strain was inserted between ORF1b and ORF2. An extra transcription regulatory sequence 6 （TRS6） was inserted behind the exogenous gene in order to make E2 gene expression as an unique sg mRNA expression， then the recombinant pA-C-E2 were constructed. After Swa I linearization， in vitro transcription， synthetic RNA was transfected into MARC-145 cells， and viable virus vA-C-E2 could be rescued. vA-C-E2 was conducted for genetic stabilityidentifi cation， and the result showed that recombinant virus could maintain genetically stable in at least 20 times cell passage processes. Indistinguishable virologic characteristics of vA-C-E2 were verifi ed compared with the parental virus vHuN4-F112 in viral propagation，plaque morphology， protein expression. Multi-step growth curve showed that the peak titer and the propagation tendency were similar. The results of IFA shown that recombinant virus could not only produce PRRSV N protein， but also the E2 protein of CSFV. The recombinant vA-C-E2 would become an important tool for further PRRSV research and the bivalence vaccine innovation and development afterwards.

Porcine reproductive and respiratory syndrome virus； Classical swine fever virus； recombinant virus； E2 protein

S852.659.6

A

1674-6422（2015）05-0001-09

2015-07-15

國(guó)家自然科學(xué)基金（31300140、31302098）；973計(jì)劃項(xiàng)目（2014CB542701）；863計(jì)劃（2011AA10A208-2）歐盟Horizon 2020項(xiàng)目SAPHIR（633184）；國(guó)家科技支撐計(jì)劃項(xiàng)目（2015BAD121301-1）

高飛，女，博士，助理研究員，主要從事PRRSV分子病毒學(xué)分析

童光志，E-mail：gztong@shariac.cn