草甘膦對油茶林土壤微生物數(shù)量及酶活性的影響

陳隆升， 陳永忠， 彭映赫， 李志剛， 彭邵鋒，唐 煒

(1.湖南省林業(yè)科學(xué)院， 湖南 長沙 410004； 2.國家油茶工程技術(shù)研究中心， 湖南 長沙 410004)

草甘膦對油茶林土壤微生物數(shù)量及酶活性的影響

陳隆升1，2， 陳永忠1，2， 彭映赫1，2， 李志剛1，2， 彭邵鋒1，2，唐 煒1，2

(1.湖南省林業(yè)科學(xué)院， 湖南 長沙 410004； 2.國家油茶工程技術(shù)研究中心， 湖南 長沙 410004)

以草甘膦為除草劑，研究其對油茶林土壤微生物及酶活性的影響。結(jié)果表明：草甘膦處理60天后，土壤真菌、細(xì)菌和放線菌的生長均受到極顯著的抑制，分別比對照減少了44.7%、58.2%和54.7%；草甘膦處理150天后，土壤真菌、放線菌的數(shù)量仍極顯著少于對照，但細(xì)菌數(shù)量顯著高于對照。土壤脲酶、磷酸酶和過氧化氫酶的活性在草甘膦處理60天后均顯著低于對照；草甘膦處理150天后，土壤脲酶的活性則由抑制轉(zhuǎn)變?yōu)榧せ?，高于對?%；土壤磷酸酶活性的抑制作用有所緩解，土壤過氧化氫酶活性的抑制作用則有所增加。草甘膦處理60天、150天后，土壤、油茶果實(shí)、葉片中均未檢測出有草甘膦殘留。

油茶； 除草劑； 草甘膦； 土壤微生物； 土壤酶活性

油茶(CamelliaoleiferaAbel.)是我國特有的重要木本油料樹種[1]，是我國經(jīng)濟(jì)大力發(fā)展的朝陽產(chǎn)業(yè)。目前全國現(xiàn)有油茶林面積400多萬hm2，主要分布在湖南、江西、廣西等南方14個(gè)省區(qū)。近幾年來，全國新造油茶良種林100多萬hm2，其中湖南省新造油茶良種林200多萬hm2。但是，由于勞動(dòng)力資源的短缺和勞動(dòng)力成本的大幅度上升，油茶林的撫育方式發(fā)生了巨大的變化，廣大企業(yè)、林農(nóng)開始使用除草劑代替?zhèn)鹘y(tǒng)的人工除草撫育，使得油茶林撫育成本大幅度降低。草甘膦(Glyphosate)為一種高效、低毒、廣譜的非選擇性除草劑，在油茶林撫育中得到了廣泛的應(yīng)用。眾多學(xué)者的研究結(jié)果表明，草甘膦顯著影響著土壤微生物環(huán)境[2-5]和土壤酶活性[6-7]。目前，國內(nèi)暫未開展草甘膦對油茶林的影響研究，除草劑對油茶林生態(tài)環(huán)境以及果實(shí)品質(zhì)的作用機(jī)制及影響程度尚無定論。作者研究了草甘膦對油茶林土壤環(huán)境的影響，并測定了其在土壤以及油茶植株體內(nèi)的殘留量，以期為油茶林綠色生產(chǎn)提供技術(shù)支撐。

1 試驗(yàn)區(qū)概況

試驗(yàn)地位于湖南省長沙市南郊雨花區(qū)湖南省林業(yè)科學(xué)院試驗(yàn)林場，其地理坐標(biāo)為113°01′30″E、28°06′40″N，屬低丘崗地地貌，最高海拔108 m，最低海拔50 m，坡度多在25°以下。該區(qū)年平均氣溫17.5 ℃，1月平均氣溫4.6 ℃，7月平均氣溫28.6 ℃，極端最高氣溫42.7 ℃，極端最低氣溫-10.4 ℃，年平均降水量1 378 mm，年平均相對濕度81%，年日照時(shí)數(shù)1 814.8 h，全年無霜期275天；氣候?qū)賮啛釒Ъ撅L(fēng)濕潤氣候，氣候溫和、四季分明。試驗(yàn)地土壤系第四紀(jì)紅色粘土網(wǎng)紋層母質(zhì)發(fā)育的酸性紅壤，土層較深厚，大多在1 m左右，但多石礫，pH值4.5～5.5。油茶林下雜草主要有的芒萁、蕨、硬骨草、野香茅、扛板歸等。

2 研究方法

2.1 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

選擇3～4年生油茶幼林為試驗(yàn)林，分別設(shè)置對照(人工除草)和噴施草甘膦除草劑2種處理，采用隨機(jī)區(qū)組試驗(yàn)設(shè)計(jì)，每個(gè)處理樣地0.1 hm2，樣地中間設(shè)置10 m隔離帶，3次重復(fù)。

(1)人工除草。于2014年5月16日和7月2日進(jìn)行人工除草，將油茶樹兜1 m范圍內(nèi)雜草人工除凈，并覆蓋于樹兜周圍。

(2)噴施草甘膦除草劑。2014年5月16日噴施除草劑(除草劑為金濃達(dá)41%草甘膦異丙胺鹽水劑；上海滬聯(lián)生物藥業(yè)(夏邑)有限公司生產(chǎn))，用量2.0 kg/hm2，按1.25%的濃度兌水均勻噴灑在雜草上。

2.2 樣品采集與預(yù)處理

于2014年7月15日(60天)、10月13日(150天)采集土壤樣品，取離地面5～15 cm的表土，按混合采樣法取10個(gè)點(diǎn)的混合樣，去除根系和石礫，過2 mm篩。將采集的土樣分成2份：1份4 ℃冰箱保存，用于土壤微生物數(shù)量及微生物種類的測定；另1份室內(nèi)風(fēng)干，用于土壤酶活性和草甘膦含量的測定。

采取土壤樣品的同時(shí)，采集油茶果實(shí)、葉片樣品，每個(gè)樣地隨機(jī)選擇20株樹，每株樹采20片葉、5個(gè)果；分別將果樣、葉樣混合于室內(nèi)風(fēng)干，用于測定草甘膦殘留量。

2.3 測定方法

2.3.1 土壤微生物數(shù)量測定 土壤微生物各類群數(shù)量的測定采用稀釋平板法。所用培養(yǎng)基：細(xì)菌為牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基；放線菌為改良高氏1號培養(yǎng)基；真菌為馬丁氏孟加拉紅培養(yǎng)基。每1類群設(shè)3個(gè)重復(fù)，3個(gè)稀釋度。于各類培養(yǎng)基分別接種后，細(xì)菌30 ℃培養(yǎng)2天、真菌和放線菌28 ℃培養(yǎng)4天和7天后進(jìn)行計(jì)數(shù)。

2.3.2 土壤酶活性測定 過氧化氫酶、脲酶和磷酸酶分別采用紫外分光光度法[8]、靛酚藍(lán)比色法[9]和對硝基苯磷酸二鈉比色法[10]測定。

2.3.3 草甘膦殘留量測定 草甘磷殘留量測定在中國廣州分析測試中心測定，采用LC-MS/MS測定方法。

(1)樣品處理。

樣品提取：取粉碎均勻樣本2 g(精確到0.01 g)置于50 mL聚丙烯(PP)塑料離心管中，加入20 mL超純水，渦旋混勻，超聲10 min，4 000 r/min離心10 min，取出收集上清液，待凈化。

SPE凈化：取Thermo PEP(60 mg/3mL)SPE小柱，依次加入3 mL甲醇、3 mL超純水、1 mL待凈化樣液，重力自流；再加入1 mL待凈化樣液，收集流出液，待衍生化。

衍生化：準(zhǔn)確移取1.00 mL待衍生液至2.00 mL進(jìn)樣瓶中，加入0.20 mL硼酸緩沖液(0.2 mol/L)及0.20 mL FMOC-Cl溶液(10 g/L)，渦旋混勻1 min；室溫放置2 h，在4 000 r/min離心10 min后取出；取上清液過0.22 μm濾膜，待進(jìn)行LC-MS/MS測定。

(2)LC-MS/MS測定

儀器型號：Agilent 1200LC/6410B MS液相色譜/串聯(lián)四級桿質(zhì)譜聯(lián)用儀。

色譜條件：色譜柱為Hypercarb柱(100 mm×2.1 mm，3.0 μm)；柱溫30 ℃；流速0.3 mL/min；進(jìn)樣量5 μL；流動(dòng)相A0.1%氨水(含有10 mM乙酸銨)，流動(dòng)相B乙腈；分析時(shí)間6.5 min。

質(zhì)譜條件：電噴霧離子源(ESI)；負(fù)離子掃描模式；多反應(yīng)監(jiān)測(MRM)采集方式；干燥氣溫度(GasTemp)350 ℃；干燥氣流量(Gas Flow)10.0 L/min；霧化氣壓力(Nebulizer)275.8 kPa(40.0 psi)；毛細(xì)管電壓(Capillary)5 500 V；質(zhì)量分析器分辨率均為Unit。

在上述條件下，取含有內(nèi)標(biāo)的對照品溶液和樣品溶液各5.0 μL注入液相色譜-串聯(lián)四極桿質(zhì)譜儀進(jìn)行測定，以對照溶液目標(biāo)峰的保留時(shí)間和MRM質(zhì)譜監(jiān)測離子對為依據(jù)進(jìn)行定性，以對應(yīng)的MRM離子對的峰面積按外標(biāo)法計(jì)算樣品中目標(biāo)物的含量。

2.4 數(shù)據(jù)分析

采用EXCELL進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。

3 結(jié)果與分析

3.1 草甘膦對油茶林土壤微生物數(shù)量的影響

由表1可知：與對照相比，油茶林地使用草甘膦除草劑60天后，土壤真菌、細(xì)菌和放線菌的數(shù)量均極顯著(p<0.01)減少，分別減少了44.7%、58.2%和54.7%。使用草甘膦除草劑150天后，土壤細(xì)菌的數(shù)量顯著(p<0.01)增加，增加了23.4%；土壤真菌和放線菌的數(shù)量均極顯著(p<0.01)減少，分別減少了69.8%和17.8%。上述結(jié)果表明，草甘膦對土壤微生物的生長存在長時(shí)間顯著的抑制作用，且不同種類的土壤微生物對草甘膦的敏感程度存在巨大差異。

表1 草甘膦對油茶林土壤微生物數(shù)量的影響Tab.1 EffectofglyphosateonnumberofsoilmicrobialofCamelliaforest(個(gè)/g)序號處理土壤真菌土壤細(xì)菌土壤放線菌60天150天60天150天60天150天1草甘膦4.71×1030.74×1031.28×10101.16×1057.34×1031.94×1042對照(CK)8.51×1032.45×1033.06×10100.94×1051.62×1042.36×104F值39.0**153.6**117.8**15.4*443.2**34.3**

3.2 草甘膦對油茶林土壤酶活性的影響

從表2中可以看出：與對照相比，油茶林地在噴施草甘膦除草劑60天后土壤脲酶、磷酸酶和過氧化氫酶的活性均顯著(p<0.05)降低，分別降低了16.2%、21.9%和29.3%。噴施草甘膦除草劑150天后土壤脲酶的活性極顯著(p<0.01)升高，比對照升高了7%；磷酸酶和過氧化氫酶的活性則均極顯著(p<0.01)降低，分別降低了11.2%和39.2%。上述結(jié)果表明，草甘膦對土壤過氧化氫酶活性的抑制作用最大，其次是磷酸酶；對土壤脲酶活性的抑制作用較小，而且隨著時(shí)間的延長反而有激活作用。

表2 草甘膦對油茶林土壤酶活性的影響Tab.1 EffectofglyphosateonsoilenzymeactivityofCamelliaforest序號處理脲酶活性(mg/(g·24h))磷酸酶活性(mg/(g·24h))過氧化氫酶活性(mL/(g·h))60d150d60d150d60d150d1草甘膦11.5918.3042.9337.810.290.172對照(CK)13.8317.1054.9942.570.400.28F值52.9**96**8844**130.5**8.47*1323**

3.3 草甘膦的殘留量

人工除草、噴施草甘膦除草劑處理60天、150天后，2個(gè)樣地的土壤、油茶果實(shí)、葉片中均未檢測出有草甘膦殘留。

4 結(jié)論與討論

眾多研究[11-12]表明，草甘膦對土壤微生物有明顯的抑制作用。本研究發(fā)現(xiàn)油茶林地使用草甘膦除草劑60天后土壤真菌、細(xì)菌和放線菌數(shù)量均受到明顯抑制，150天后土壤真菌和放線菌的數(shù)量仍然均極顯著少于對照，但土壤細(xì)菌數(shù)量則比對照顯著提高，表明草甘膦可對土壤真菌和放線菌產(chǎn)生長時(shí)間的持續(xù)抑制作用，而對細(xì)菌抑制時(shí)間相對較短，隨著時(shí)間的延長，反而促進(jìn)了細(xì)菌的生長，但從抑制到促進(jìn)的時(shí)間拐點(diǎn)有待進(jìn)一步的研究。

通過測定土壤脲酶、磷酸酶和過氧化氫酶的活性變化可有效評價(jià)土壤肥力水平、土壤污染狀況以及土壤對環(huán)境變化的響應(yīng)。本研究結(jié)果表明：油茶林地噴施草甘膦60天后，土壤脲酶、磷酸酶和過氧化氫酶的活性仍然受到較強(qiáng)的抑制作用，分別比對照降低了16.2%、21.9%和29.3%。噴施草甘膦150天后土壤脲酶的活性則由抑制轉(zhuǎn)變?yōu)榧せ?，高于對?%；土壤磷酸酶活性的抑制作用有所緩解，土壤過氧化氫酶活性的抑制作用則有所增加。許多研究表明，不同類型土壤、不同種類土壤酶的活性對草甘膦的敏感程度不同[13-15]，同時(shí)土壤酶活性也受溫度、水分、光照等各類外界因素的影響。本研究中草甘膦對土壤脲酶的活性總體上表現(xiàn)為先抑制后激活，對土壤磷酸酶和過氧化氫酶的活性則產(chǎn)生長時(shí)間的抑制作用；尤其對過氧化氫酶，在處理150天后，活性仍低于對照39.2%。

本研究中處理60天和150天后，在人工除草和草甘膦處理樣地的土壤、油茶果實(shí)、葉片中均未檢測出有草甘膦殘留，表明草甘膦在土壤中的有效成分已降解。許多研究也發(fā)草甘膦在土壤[16]、水中[17-18]6天就已基本降解完。草甘膦在油茶林土壤中的降解方式及殘留時(shí)間有待進(jìn)一步研究。另外，草甘膦是否進(jìn)入油茶樹體以及在油茶樹體的降解轉(zhuǎn)化方式以及是否轉(zhuǎn)化成其它有害物質(zhì)也有待進(jìn)一步研究。

[1] 何方，何柏.油茶栽培分布與立地分類的研究[J].林業(yè)科學(xué)，2002，38(5)：64-73.

[2] Widenfalk A，Bertilsson S，Sundh I，et al.Effects of pesticides on community composition and activity of sediment microbes-responses at various levels of microbial community organization[J].Environmental Pollution，2008，152：576-584.

[3] Sannino F，Gianfreda L.Pesticide influence on soil enzymatic activities[J].Chemosphere，2001，45：417-425.

[4] 鄧曉，李雅琦.草甘膦對土壤微生物影響的研究[J].農(nóng)藥，2005，44(2)：59-62.

[5] 陶波，蔣凌雪，沈曉峰，等.草甘膦對土壤微生物的影響[J].中國油料作物學(xué)報(bào)，2011，33(2)：162-168.

[6] 姜偉麗，馬小艷，彭軍，等.除草劑草甘膦對棉田土壤酶活性的影響[J].棉花學(xué)報(bào)，2014，26(5)：431-437.

[7] 呼蕾.草甘膦對土壤生化活性的影響研究[D].西安：西北農(nóng)林科技大學(xué)，2009.

[8] 楊蘭芳，曾巧，李海波，等.紫外分光光度法測定土壤過氧化氫酶活性[J].土壤通報(bào)，2011，42(1)：207-210.

[9] 關(guān)松蔭，張德生，張志明.土壤酶及其研究法[M].北京：農(nóng)業(yè)出版社，1986.

[10] 魯如坤.土壤農(nóng)業(yè)化學(xué)分析方法[M].北京：中國農(nóng)業(yè)科技出版社，2000：252-254.

[11] Dodor D E，Tabatabai M A.Effect of cropping system on phosphatase in soils[J].Plant Nutrition and Soil Science，2003(166)：7-13.

[12] Corstanje R，Reddy K R，Prenger J P，et al.Soil microbial ecophysiological response to nutrient enrichment in a subtropical wetland[J].Ecological Indicators，2007，7(2)：277-289.

[13] 郝愛平，楊基峰，彭超，等.草甘膦對土壤酶活性及呼吸強(qiáng)度的影響研究[J].安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，2009，37(20)：9592-9593

[14] 張宇，趙長山，丁偉.不同長殘留除草劑對大豆根際土壤脲酶活性的影響[J].大豆科學(xué)，2007，26(5)：781-783.

[15] 葉央芳，閔航，周湘池.苯噻草胺對水田土壤呼吸強(qiáng)度和酶活性的影響[J].土壤學(xué)報(bào)，2004，41(1)：93-96.

[16] 李水清，葉森林.草甘膦在土壤殘留動(dòng)態(tài)研究[J].長江大學(xué)學(xué)報(bào)，2006，3(1)：123-125.

[17] FELIX H，CARMEN H，JUAN V S.Determination of Glyphosate Residues in Plants byPrecolumn Derivatization and Coupled-column Liquid Chromatography with Fluorescence Detection[J].Journal of Aoac International，2000，83(3)：728-734.

[18] 張碩.高效液相色譜法和離子色譜法測定轉(zhuǎn)基因大豆中草甘膦含量的研究[D].南昌：南昌大學(xué)，2012.

(文字編校：唐效蓉)

EffectofglyphosateonnumberofsoilmicrobialandenzymeactivityofCamelliaforest

CHEN Longsheng1，2， CHEN Yongzhong1，2， LI Zhigang1，2， PENG Yinghe1，2， PENG Shaofeng1，2， TANG Wei1，2

(1.Hunan Academy of Forestry， Changsha 410004， China；2.National Engineering Research Center for Oil-tea Camellia， Changsha 410004， China)

Effect of glyphosateon soil microbial and enzyme activity of Camellia forest was studied in this article.The result showed that after glyphosate treatment 60 d，the number of soil fungi，bacteria and actinomycetes were subject to very significant growth inhibition，it decreased 44.7%，58.2% and 54.7% respectively，which compared with the control.After glyphosate treatment 150 d，the number of soil fungi and actinomycetes is still highly significant than the control，but the number of bacteria was significantly higher than the control.After glyphosate treatment 60 d ，soil urease，phosphatase and catalase activity were significantly than the control.After glyphosate treatment 150 d，soil ureaseactivity from inhibition to activation，7% higher than the control.The soil phosphatase activity inhibition eased，soil catalase activity inhibition is increased.After glyphosate treatment 60 d and 150 d，there were nono detectable residues of glyphosate in soil，camellia fruits and leaves.

CamelliaoleiferaAbel； herbicide； glyphosate； soil microbial； soil enzyme activity

2015-04-22

湖南省林業(yè)科技計(jì)劃“林地除草劑對油茶林影響的研究”(XLK201413)。

陳隆升(1983-)，男，福建省泉州市人，助理研究員，主要從事油茶栽培技術(shù)研究。

S 154.3

A

1003 — 5710(2015)04 — 0032 — 04

10. 3969/j. issn. 1003 — 5710. 2015. 04. 008