二代測序技術(shù)檢測早期自然流產(chǎn)胚胎染色體異常

劉麗，徐鳳琴，邸建永，劉清華，李毅

二代測序技術(shù)檢測早期自然流產(chǎn)胚胎染色體異常

劉麗，徐鳳琴，邸建永，劉清華，李毅△

目的探討二代測序（NGS）技術(shù)檢測早期自然流產(chǎn)（SA）絨毛組織染色體異常的價(jià)值。方法選擇自然流產(chǎn)患者87例，其中復(fù)發(fā)性流產(chǎn)32例，偶發(fā)性流產(chǎn)55例。年齡≥35歲組35例，＜35歲組52例。取其流產(chǎn)絨毛組織，行NGS全基因組測序及G顯帶染色體核型分析，比較2種方法的檢測成功率和異常檢出率，比較不同流產(chǎn)類型及不同年齡患者的流產(chǎn)組織染色體異常率。結(jié)果NGS技術(shù)檢測流產(chǎn)絨毛組織的成功率（100.00%）高于G顯帶核型（74.71%），異常檢出率（58.62%）也高于G顯帶核型（50.77%）。NGS檢測的51例異常中染色體結(jié)構(gòu)異常3例（5.88%），染色體數(shù)目異常48例（94.12%），其中三體39例，雙重三體2例，三重三體1例，單體6例。G顯帶核型分析檢出的33例異常中染色體數(shù)目異常32例，其中三體24例，雙重三體2例，三重三體1例，單體5例；染色體結(jié)構(gòu)異常1例。NGS與G顯帶核型分析測序結(jié)果相符64例，不符1例。NGS技術(shù)檢測偶發(fā)性流產(chǎn)與復(fù)發(fā)性流產(chǎn)組織染色體異常率分別是60.00%和56.25%，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義?！?5歲組的染色體異常率（71.43%）高于＜35歲組（50.00%），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。結(jié)論NGS技術(shù)檢測染色體異常的分辨率好，準(zhǔn)確度高，有助于明確SA的病因，指導(dǎo)患者再次妊娠及優(yōu)生優(yōu)育。

二代測序技術(shù)；染色體畸變；流產(chǎn)，自然；絨毛膜絨毛；G顯帶核型；遺傳

自然流產(chǎn)（spontaneous abortion，SA）在妊娠中的發(fā)生率為10%～15%［1］。孕12周之前的流產(chǎn)稱為早期SA。與同一配偶發(fā)生連續(xù)2次或多次SA稱為復(fù)發(fā)性流產(chǎn)。早期SA的病因復(fù)雜，50%以上的胚胎是由染色體異常造成的［2］。發(fā)生SA時(shí)的孕周越短，染色體異常的可能性越大。G顯帶核型分析是檢測SA染色體異常的常規(guī)方法，但存在培養(yǎng)易失敗、結(jié)果不穩(wěn)定、分裂相少、染色體形態(tài)欠佳等問題。近年發(fā)展起來的二代測序（next generation sequencing，NGS）技術(shù)通過對樣本進(jìn)行全基因組掃描，可檢出染色體小片段的重復(fù)、缺失及基因組缺陷。但該技術(shù)應(yīng)用于早期自然流產(chǎn)絨毛組織的遺傳學(xué)診斷尚鮮見報(bào)道。為探討流產(chǎn)組織染色體檢測的最佳方法，本研究應(yīng)用NGS技術(shù)對SA患者的流產(chǎn)絨毛組織進(jìn)行全基因組測序，并與G顯帶核型分析對照，旨在尋找SA的遺傳學(xué)病因，探討NGS技術(shù)在流產(chǎn)組織檢測中的應(yīng)用價(jià)值。

1 對象與方法

1.1 研究對象2013年5月—2014年12月在我院生殖中心就診的不明原因的早期SA患者87例，年齡23～42歲，平均（32.4±4.7）歲，孕8～12周，B超診斷為胚胎停育，其中偶發(fā)性流產(chǎn)55例，復(fù)發(fā)性流產(chǎn)32例?；颊吒鶕?jù)年齡分為2組，年齡≥35歲組35例，＜35歲組52例。

1.2 方法

1.2.1 G顯帶核型分析絨毛染色體采用改良絨毛染色體直接法按文獻(xiàn)［3］中的步驟操作，取流產(chǎn)清宮的典型絨毛組織10 mg左右，立即在1640培養(yǎng)基中漂洗干凈，剪碎、低滲、固定，常規(guī)染色體制片，G顯帶。利用計(jì)算機(jī)染色體分析系統(tǒng)進(jìn)行核型分析。每份標(biāo)本至少計(jì)數(shù)20個(gè)分裂相，分析5個(gè)核型。

1.2.2 NGS技術(shù)檢測流產(chǎn)絨毛組織取流產(chǎn)的胎兒絨毛組織100 mg，用PBS或生理鹽水清洗3～5次，通過Qiagen QIAamp DNA Mini試劑盒提取全基因組DNA，應(yīng)用Qbuit、凝膠電泳技術(shù)對DNA質(zhì)量進(jìn)行檢測，確保DNA濃度不低于30 μg/L。將樣品DNA打碎至250 bp大小的片段。末端修復(fù)：3′端加堿基A，使DNA片段能與3′端帶有T堿基的特殊接頭連接，用磁珠法選擇需回收的目的片段產(chǎn)物。使用PCR技術(shù)擴(kuò)增兩端帶有接頭的DNA片段（10個(gè)循壞）。構(gòu)建好的文庫經(jīng)Agilent 2100 Bioanalyzer及實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測合格后，將一定量的文庫按照等物質(zhì)的量混合，上機(jī)測序?；诳截悢?shù)變異的檢測方法，用SOAP比對軟件，將每個(gè)讀長的測序堿基與人類基因組參考序列（hg19）進(jìn)行比對，通過唯一比對的讀長數(shù)據(jù)進(jìn)行染色體異常分析。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法使用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析，計(jì)數(shù)資料的組間比較采用χ2檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 NGS與G顯帶核型分析檢測結(jié)果比較絨毛膜染色體G顯帶核型分析87例，檢測成功65例，余22例鏡下未見染色體核型，檢測失敗。NGS技術(shù)檢測流產(chǎn)絨毛組織的成功率和異常檢出率均高于G顯帶核型（P＜0.05），見表1。

Tab.1Comparison of the positive detection rate and the abnormality detection rate of the two methods表1 2種方法檢測成功率與異常檢出率比較例（%）

2.2 NGS與G顯帶核型分析異常結(jié)果比較見表2。NGS檢測的51例異常中染色體數(shù)目異常48例，占94.12%，其中三體39例，雙重三體2例，三重三體1例，單體6例。染色體結(jié)構(gòu)異常3例，占5.88%。G顯帶核型分析檢出的33例異常中染色體數(shù)目異常32例，占96.97%，其中三體24例，雙重三體2例，三重三體1例，單體5例。染色體結(jié)構(gòu)異常1例，占3.03%。

Tab.2Comparison of the results of NGS and G-banding chromosome karyotypes表2 NGS與G顯帶核型分析異常結(jié)果比較（例）

2.3 NGS與G顯帶核型分析相符情況分析NGS與G顯帶核型分析測序結(jié)果相符64例，不符1例。該例G顯帶核型分析結(jié)果正常，NGS結(jié)果為15號染色體的長臂部分存在片段缺失，seq del（15）（q25.3q26.3）（88，336，448–102，447，173），長約14.11 Mb；8號染色體的短臂部分存在片段重復(fù)，seq dup（8）（p23.3p12）（10，132–31，651，181），長約31.64 Mb，見圖1。取夫妻外周血做G顯帶核型分析，示女方染色體平衡易位，46，XX，t（8；15）（p12；q25），見圖2。

Fig.1The result of NGS detection圖1 NGS技術(shù)檢測結(jié)果圖

Fig.2G-banding chromosome karyotype analysis圖2 G顯帶核型分析圖

2.4 不同組別的流產(chǎn)組織染色體異常率比較偶發(fā)性流產(chǎn)與復(fù)發(fā)性流產(chǎn)組織染色體異常率差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；≥35歲組的染色體異常率高于＜35歲組（P＜0.05），見表3。

Tab.3Comparison of the chromosomes abnormality in different groups表3 不同組別的流產(chǎn)組織染色體異常率比較例（%）

3 討論

3.1 染色體異常是早期SA的主要原因SA大多是遺傳因素導(dǎo)致，染色體異常的胚胎多數(shù)以流產(chǎn)結(jié)束。評估SA的病因和復(fù)發(fā)性流產(chǎn)的風(fēng)險(xiǎn)十分必要，NGS技術(shù)可對流產(chǎn)組織檢測23條染色體非整倍體及5 Mb以上片段的缺失及重復(fù)情況。本結(jié)果NGS檢出51例異常，異常率58.62%，與以往報(bào)道的異常率55%～66%［4］和5l%［5］基本相符。染色體數(shù)目異常48例，占異常的94.12%；其中三體39例，表明三體型異常為染色體非整倍性異常的主要類型，集中在13、14、15、16、18、21、22號染色體。5例X單體也是早期流產(chǎn)常見的染色體核型。與Stephenson等［6］報(bào)道的近90%染色體異常集中在三體異?；鞠喾ｋp重三體較少見，約占流產(chǎn)胚胎所有核型的0.21%～2.8%［7］。筆者發(fā)現(xiàn)2例雙重三體及1例三重三體，涉及11、18、20、21、22號。染色體數(shù)目異常的發(fā)生主要源自雙親之一的配子形成時(shí)或妊娠初期受精卵卵裂時(shí)出現(xiàn)染色體不分離，則導(dǎo)致該染色體增多或減少1條，導(dǎo)致三體或單體［8］。由于染色體數(shù)目異常，阻礙了胚胎的正常發(fā)育，大多數(shù)遭遇自然淘汰而流產(chǎn)，雖然少數(shù)染色體異?；純嚎梢宰阍路置?，但常常智力障礙。因此，妊娠物絨毛染色體檢測十分必要，尤其是對于早期SA患者，其有助于明確病因，避免不必要的檢查和治療，對再次妊娠提供生育指導(dǎo)。

3.2 流產(chǎn)組織染色體異常與流產(chǎn)次數(shù)無關(guān)本研究結(jié)果顯示復(fù)發(fā)性流產(chǎn)和偶發(fā)性流產(chǎn)患者的染色體異常率分別是56.25%和60.00%，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。Grande等［9］報(bào)道了96例復(fù)發(fā)性流產(chǎn)者的絨毛染色體異常率為60%，154例偶發(fā)性流產(chǎn)者的異常率為68%，差異也無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，與本研究結(jié)果基本一致，提示流產(chǎn)組織核型異常的風(fēng)險(xiǎn)與流產(chǎn)次數(shù)無關(guān)。

3.3 高齡孕婦非整倍體妊娠的風(fēng)險(xiǎn)較高本研究結(jié)果顯示年齡≥35歲組的染色體異常率高于＜35歲組，表明隨著女方年齡增大發(fā)生胚胎染色體異常導(dǎo)致流產(chǎn)的風(fēng)險(xiǎn)隨之增大。Li等［10］用單核苷酸多態(tài)性微陣列技術(shù)對SA流產(chǎn)組織進(jìn)行核型分析，發(fā)現(xiàn)年齡≥35歲組的非整倍體率（87.5%）明顯高于＜35歲組（61.4%），與本研究結(jié)果一致。隨著年齡的增長，卵細(xì)胞存在衰老退化的現(xiàn)象，受精卵細(xì)胞內(nèi)紡錘絲老化，導(dǎo)致功能不全或喪失，生殖細(xì)胞或受精卵在細(xì)胞減數(shù)分裂或有絲分裂時(shí)發(fā)生染色體不分離，導(dǎo)致染色體數(shù)目或結(jié)構(gòu)異常胎兒的發(fā)生［11］。因此高齡是引起胚胎染色體異常的高危因素。

3.4 NGS技術(shù)在早期SA遺傳學(xué)診斷中的優(yōu)勢有研究報(bào)道G顯帶核型分析的成功率只有66%［12］，本研究為74.71%，比文獻(xiàn)報(bào)道稍高。而NGS用于流產(chǎn)物遺傳學(xué)檢查的成功率為100%。G顯帶核型分析與NGS結(jié)果相符率達(dá)98.5%（64/65），不相符1例，筆者推斷夫妻雙方或一方可能為染色體異常攜帶者，進(jìn)一步取其外周血進(jìn)行G顯帶核型分析，發(fā)現(xiàn)女方為染色體平衡易位攜帶者，證實(shí)該流產(chǎn)兒染色體異常遺傳自母親，與NGS結(jié)果相符。

綜上，NGS技術(shù)的診斷成功率及染色體異常檢出率均較高，在早期SA妊娠物核型分析中具有顯著優(yōu)越性，可作為遺傳學(xué)檢測的一種補(bǔ)充技術(shù)，也可為流產(chǎn)夫婦進(jìn)行遺傳學(xué)病因分析，從而為再次妊娠提供指導(dǎo)，有較高的臨床應(yīng)用價(jià)值。

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（2015-01-16收稿2015-03-20修回）

（本文編輯閆娟）

Detection of chromosome abnormality by next-generation sequencing technology of miscarried embryo in the first-trimester

LIU Li，XU Fengqin，DI Jianyong，LIU Qinghua，LI Yi△
Department of Reproductive Medicine，F(xiàn)irst Center Hospital，Tianjin 300192，China△

ObjectiveTo investigate the clinical values of next-generation sequencing（NGS）technology in diagnosis of miscarried chorionic villi genetic disorders.MethodsPatients who underwent miscarriage（n=87）were enrolled in this study.Among all patients，32 cases were of recurrent miscarrage and 55 cases were of sporadic miscarriage.In all collected patients，35 women were 35 years or older while other 52 women were less than 35 years old.Positive detection rate and the abnormal detection rate were compared between these two methods.Chromosomes abnormal rates were also compared among different types of miscarrage and different ages.All aborted villi tissue were analyzed by NGS of whole genome and G-band?ing karyotype.ResultsThe successful detection rate of chorionic villi by NGS（100.00%）was higher than that of G-band?ing karyotype（74.71%），and the detection rate of abnormal chorionic villi by NGS（58.62%）was also higher than that of G-banding karyotype（50.77%）.Three cases of chromosome structure anomaly were found in those 51 chromosome anomalies（5.88%）.Other 48 cases of chromosome anomalies were aneuploidy anomalies（94.12%）include 39 cases of trisomy，2 cases of double trisomy and 1 case of triple trisomy and 6 cases of monomer.On the other hand，32 cases of chromosome aneuploi?dy anomalies were found in 33 chromosome anomalies by G-banding karyotype，which include 24 cases of trisomy，2 cases of double trisomy，1 case of triple trisomy，5 cases of monomer and 1 case of chromosome structure anomaly.Most NGS re?sults（n=64）were in agreement with G-banding karyotype but with 1 case of discrepancy.Chromosomal abnormality rate de?tected by NGS in sporadic miscarrage group and recurrent spontaneous miscarrage group were 60.00%and 56.25%respective?ly.There was no significant difference（P＞0.05）.Chromosomal abnormality rate picked by NGS in women aged≥35 years old（71.43%）was higher than that in women＜35 years old（50.00%）with statistically significant difference（P＜0.05）.ConclusionNGS technology showed highly accuracy in detecting chromosomal abnomality from villi tissue.Therefore，it could help to detect genetic disorders of miscarrage.It is useful to determine the reasons of miscarrage and guide the next pregnancy.

next generation sequencing；chromosome aberrations；abortion，spontaneous；chorionic villi；G-banding karyotype；genetics

R715.5

A

10.11958/j.issn.0253-9896.2015.08.028

天津市第一中心醫(yī)院生殖醫(yī)學(xué)科（郵編300192）

劉麗（1966），女，主任技師，碩士，主要從事醫(yī)學(xué)遺傳及生殖醫(yī)學(xué)研究

△通訊作者E-mail：liyi6656@163.com