盤式固相萃取-液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法快速測定地表水中n-壬基酚、n-辛基酚和雙酚A

趙 彬，張 敏，張付海，胡雅琴，田丙正，王 鑫

內(nèi)分泌干擾物種類繁多，分布廣泛，會通過食物鏈在動物和人體內(nèi)富集。極低濃度的內(nèi)分泌干擾物就可能對動物和人的生殖系統(tǒng)、神經(jīng)系統(tǒng)和免疫系統(tǒng)造成嚴(yán)重的損害［1-3］。n-壬基酚(NP)、n-辛基酚(OP)和雙酚A(BPA)作為典型酚類內(nèi)分泌干擾物被廣泛用作工業(yè)和家用洗滌劑、農(nóng)藥和印染乳化劑等，大量用于合成非離子型表面活性劑和聚碳酸醋塑料和環(huán)氧樹脂［4］。歐盟、奧斯陸-巴黎公約OSPAR 也已將其列入優(yōu)先環(huán)境控制污染物質(zhì)名錄［5］。為了更好地評價該類物質(zhì)對生態(tài)環(huán)境的影響，建立這類物質(zhì)的快速、靈敏和高效的分析方法就顯得尤為重要。

目前測定該類化合物的方法主要有高效液相色譜法［5］、氣相色譜法［6］、氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法［7］、酶聯(lián)免疫吸附法［8］和液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法［9-11］等。氣相色譜法測定該類物質(zhì)需要衍生化處理樣品，步驟繁瑣。液相色譜法則由于環(huán)境水樣基質(zhì)復(fù)雜、背景干擾多等特點(diǎn)，不易定性，易出現(xiàn)假陽性。而免疫法往往只針對單一化合物進(jìn)行分析，難以滿足多組分同時檢測的要求。而液相色譜-質(zhì)譜串聯(lián)法檢測則能更好地應(yīng)對基質(zhì)復(fù)雜、背景干擾的樣品監(jiān)測要求。針對環(huán)境樣品的前處理方法主要有液-液萃?。?-10］、固相小柱萃?。?，7，10］、加速溶劑萃取法［11］等，而盤式固相萃取的方法報道較少。盤式固相萃取法則能夠快速萃取大體積水樣，同時消耗有機(jī)試劑少，操作儀器化程度高，簡單易操作。綜上所述，本文采用盤式固相萃取-超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜快速測定地表水中3 種內(nèi)分泌干擾物(n-壬基酚、雙酚A、n-辛基酚)，并對巢湖入湖河流河口水樣進(jìn)行了研究調(diào)查。該方法快速、靈敏、準(zhǔn)確，可有效應(yīng)用于環(huán)境水樣的實際監(jiān)測檢測。

1 實驗部分

1.1 儀器和試劑

超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜Waters TQ-S(美國);Masslynx4.1 工作站;膜盤萃取儀(Sepaths-6，美國);盤式固相萃取膜盤(C18，Φ47 mm 以下簡稱C18膜盤);定量平行濃縮儀(MultiVap-8，中國北京);超純水制備儀(Millipore Milli-Q Integral15，美國);色譜柱(Waters BEH C18，50 mm ×2.1 mm，1.7 μm)。

n-壬基酚(NP，標(biāo)準(zhǔn)品純度不低于99.9%);n-辛基酚(OP，標(biāo)準(zhǔn)品，純度不低于99.9%);雙酚A(BPA，標(biāo)準(zhǔn)品，純度不低于99.9%);二氯甲烷、甲醇、乙腈(色譜純);超純水;無水硫酸鎂(優(yōu)級純);0.22 μm 有機(jī)濾頭。

1.2 樣品的采集與保存

采集河流水樣儲存于5 L 棕色玻璃采樣瓶中，用H3PO4調(diào)pH 至2，加入0.01 ～0.02 g 抗壞血酸除去殘余氯。在4 ℃冷藏保存，24 h 內(nèi)分析。

1.3 樣品前處理

膜盤萃取:靜置水樣30 min 以上，使其自然沉降。然后取上層水樣1 L 于萃取瓶中，加入2 mL甲醇，用C18膜盤萃取。萃取條件:用10 mL體積比1∶1 的甲醇/二氯甲烷潤洗，10 mL 超純水平衡5 min，水樣流速約為100 mL/min，用10 mL甲醇/超純水(體積比1∶10)凈化，抽至近干后，用10 mL 甲醇/二氯甲烷(體積比1∶1)洗脫。加入0.5 g 無水硫酸鎂除水。洗脫液用濃縮氮吹儀(40 ℃下)，甲醇/水(體積比1∶1)分多次轉(zhuǎn)換溶劑定容至1 mL。用0.22 μm 有機(jī)濾頭過濾，待測。

1.4 色譜質(zhì)譜條件

超高效液相色譜條件:色譜分離采用線性梯度洗脫。流動相A 為甲醇，流動相B 為超純水-0.1%氨水。采用線性梯度洗脫條件(見表1)。進(jìn)樣量為10 μL，流速0.4 mL/min，樣品溫度10 ℃，色譜柱溫40 ℃。

表1 液相色譜線性梯度洗脫條件

質(zhì)譜條件:采用電噴霧離子源(ESI)負(fù)離子模式進(jìn)行監(jiān)測，監(jiān)測模式為多級反應(yīng)監(jiān)測模式(MRM)。噴射電壓2.8 kV，源溫度為150 ℃，脫溶劑氣溫度為400 ℃，流量為900 L/h，錐孔氣流速為150 L/h，錐孔電壓和碰撞能經(jīng)實驗優(yōu)化見表2。

表2 MRM 分析條件

2 結(jié)果與討論

2.1 樣品前處理條件的優(yōu)化

2.1.1 樣品萃取方法的優(yōu)化選擇

目前關(guān)于環(huán)境水樣的前處理方式，多采用液-液萃?。?0-11］、固相小柱萃取［6，8，11］等方法。液-液萃取方法前處理操作過程繁瑣，需要選擇合適極性的溶劑，調(diào)節(jié)適合的pH。同時，環(huán)境樣品基質(zhì)復(fù)雜，背景干擾物眾多，簡單的液-液萃取方式難以有效除去雜質(zhì)，影響了方法最終的檢出限及準(zhǔn)確性。固相小柱萃取方法是一種常用的樣品前處理技術(shù)，是液-固萃取和液相色譜柱技術(shù)相結(jié)合的產(chǎn)物。它能很好地實現(xiàn)目標(biāo)物與樣品基體和干擾物的分離。但由于其小柱本身的特性，不能夠?qū)崿F(xiàn)大體積樣品的快速上樣、富集及凈化。盤式固相萃取法的原理與固相小柱萃取類似。從圖1可見，盤式固相萃取法的回收率及凈化效果均與固相萃取小柱法一致。因此，選擇了更適合環(huán)境水體樣品大體積上樣的盤式固相萃取技術(shù)。

圖1 不同萃取方法的比較

2.1.2 盤式固相萃取條件的優(yōu)化

影響盤式固相萃取效果的主要因素有吸附劑類型及用量、樣品溶液體積、洗脫劑類型等。對于復(fù)雜基質(zhì)的樣品，復(fù)合型吸附劑被廣泛應(yīng)用。本文比較了固相萃取小柱(C18、HLB、自制氧化鋁小柱)與C18膜盤對目標(biāo)化合物的凈化和回收率效果。從圖2可見，采用C18膜盤能取得較好的回收率，同時可實現(xiàn)快速分析。

圖2 不同凈化方法的比較

2.1.3 萃取溶劑的優(yōu)化選擇

進(jìn)一步考察了洗脫溶劑種類及其混合比例、用量對實驗結(jié)果的影響。從圖3可見，C18膜盤萃取的最佳實驗條件:用10 mL 甲醇/二氯甲烷(體積比1∶1)潤洗，10 mL 超純水平衡5 min，水樣流速約為100 mL/min，用10 mL 甲醇/超純水(體積比1∶10)凈化，抽至近干后，用10 mL 甲醇/二氯甲烷(體積比1∶1)洗脫。

圖3 不同溶劑的優(yōu)化比較

2.2 色譜及質(zhì)譜條件的優(yōu)化

2.2.1 色譜條件的優(yōu)化

分別比較了不同類型的反相色譜柱(Waters BEH C18，Waters HSS T3，Waters HSS C8)對待測物質(zhì)的色譜分離效果。結(jié)果表明，n-辛基酚、n-壬基酚、雙酚A 在Waters BEH C18色譜柱(50 mm×2.1 mm，1.7 μm)上獲得了理想的分離效果。

甲醇和乙腈是液相色譜常用的流動相。在優(yōu)化的色譜分離條件下，考察了甲醇-水和乙腈-水流動相體系對目標(biāo)物離子化程度的影響。發(fā)現(xiàn)甲醇-水流動相的儀器響應(yīng)值高于乙腈-水流動相。這可能是由于甲醇比乙腈更易電離，目標(biāo)物離子化效率高，分析靈敏度高的原因。由于目標(biāo)物都帶有羥基，在負(fù)離子電離模式下溶液中能夠電離出H+。所以，在流動相中適當(dāng)加入堿性物質(zhì)可以促進(jìn)目標(biāo)物的電離，從而獲得較高的離子化效率。因此，選取0.1%氨水作為流動相進(jìn)行實驗，并獲得了最佳實驗結(jié)果。選擇梯度洗脫方式，優(yōu)化流動相梯度洗脫條件，在6 min 內(nèi)實現(xiàn)了目標(biāo)化合物的快速分離測定。

2.2.2 質(zhì)譜條件的優(yōu)化

根據(jù)酚類內(nèi)分泌干擾物具有酚羥基的化學(xué)電離性質(zhì)，選用負(fù)電離模式(ESI－)，采用蠕動泵直接進(jìn)樣的方式進(jìn)行質(zhì)譜條件優(yōu)化。通過儀器自帶軟件Masslynx4.1 的自動優(yōu)化軟件IntelliStart，對目標(biāo)物的錐孔電壓、碰撞能、定量離子和輔助定性離子進(jìn)行了優(yōu)化和確定。辛基酚、壬基酚和雙酚A 的MRM 色譜圖見圖4。

圖4 n-辛基酚、n-壬基酚和雙酚A 的MRM 色譜圖

2.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線、線性范圍及檢出限

將標(biāo)準(zhǔn)儲備液用流動相梯度稀釋成6 種不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液(1、5、10、50、100、400 μg/L)。然后上機(jī)測定，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。以標(biāo)準(zhǔn)物的質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)、對應(yīng)峰面積為縱坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸分析，得線性回歸方程及相關(guān)系數(shù)。并根據(jù)HJ 168—2010 中方法檢出限的一般確定方法，依據(jù)公式MDL =t(n－1，0.99)×S，通過重復(fù)空白實驗7次計算得各組分最低檢測濃度，結(jié)果見表3。

表3 標(biāo)準(zhǔn)曲線及檢出限

2.4 方法的回收率與精密度

對一已知實際環(huán)境樣品(未檢出目標(biāo)物)進(jìn)行添加回收率和精密度實驗，樣品分別添加低、中、高(5、50、200 ng/L)3 種質(zhì)量濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液(每個添加濃度平行測定6 次，并計算其相對標(biāo)準(zhǔn)偏差)，用液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜進(jìn)行測定。方法回收率及精密度結(jié)果見表4。

表4 3 種目標(biāo)物的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差和回收率(n=6)

2.5 樣品的測定

應(yīng)用該方法對環(huán)巢湖入湖河流河口水樣共9條河流(8 進(jìn)1 出)累計半年共計66 組(包含全程序空白、密碼樣和質(zhì)控)水樣進(jìn)行了分析測定。分析結(jié)果表明，7 組樣品中檢出雙酚A，含量為17.5 ～42.3 ng/L;12 組樣品中檢出n-壬基酚，含量為23.2 ～37.3 ng/L;9 組樣品中檢出n-辛基酚，含量為13.2 ～36.3 ng/L。3 種物質(zhì)的檢出率分別為10.6%、18.2%、13.6%。

3 結(jié)論

建立了盤式固相萃取-超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)同時快速測定環(huán)境水體中n-壬基酚、n-辛基酚和雙酚A 的方法。環(huán)境水樣經(jīng)膜盤萃取、超高效液相色譜分離、串聯(lián)質(zhì)譜(LC-MS/MS)多級離子監(jiān)測(MRM)方式檢測，外標(biāo)法定量。結(jié)果表明，該方法具有較高的準(zhǔn)確度和精密度，具有快速、靈敏、準(zhǔn)確和操作簡單等特點(diǎn)，可以作為環(huán)境水樣中內(nèi)分泌干擾物的監(jiān)測方法，很好地應(yīng)用于環(huán)境水樣中n-辛基酚、雙酚A 和n-壬基酚的含量分析。

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