苝酐衍生物功能化空心納米金電致化學(xué)發(fā)光鉛離子傳感器的研究

李雪+陳安懿+卓穎+袁若

摘 要 基于目標(biāo)物循環(huán)放大策略及苝酐衍生物功能化納米探針，構(gòu)建了超靈敏的電致化學(xué)發(fā)光（ECL）傳感器用于Pb2+檢測。將發(fā)卡型DNA底物鏈通過分子自組裝固載于沉積納米金的玻碳電極表面，當(dāng)目標(biāo)物Pb2+及脫氧核酶（DNAzyme）存在時，底物鏈被剪切，在電極上留下單鏈DNA，同時釋放出的Pb2+和DNAzyme可進(jìn)入下一個循環(huán)，繼續(xù)對未剪切的底物鏈進(jìn)行剪切。剪切得到的單鏈DNA可與輔助探針H1的一端雜交，H1的另一端可與標(biāo)記有苝酐衍生物功能化空心納米金的發(fā)夾探針H2雜交。隨著Pb2+濃度的增加，更多的信號探針被捕獲，使得電極上產(chǎn)生的ECL信號逐漸增強(qiáng)。在Pb2+不存在時，底物鏈不能被剪切，信號探針不能被捕獲，ECL信號低。本傳感器在1×10

2 ～1×106 mol/L的濃度范圍內(nèi)對Pb2+有良好的線性響應(yīng)，檢出限為1×1012 mol/L（S/N=3）。傳感器對常見的金屬離子表現(xiàn)出良好的選擇性。

關(guān)鍵詞 電致化學(xué)發(fā)光； Pb2+； S2O28/O2； 苝酐衍生物； 空心納米金

1 引 言

Pb2+是一種廣泛分布在環(huán)境及水體中的重金屬污染物，攝入過量Pb2+對人體尤其是兒童的神經(jīng)系統(tǒng)、免疫系統(tǒng)造成損傷，導(dǎo)致智力發(fā)育延遲[1，2]。目前，在國家標(biāo)準(zhǔn)方法[3，4]的基礎(chǔ)上，已發(fā)展了許多新的Pb2+檢測方法，包括流動注射火焰爐原子吸收光譜法[5，6]、電感耦合等離子發(fā)射法[7，8]、熒光光譜法[9]、表面增強(qiáng)拉曼散射光譜法[10]等。然而，這些檢測方法通常需要精密的儀器、熟練的技術(shù)人員，不適于推廣使用。因此，發(fā)展低成本、簡單靈敏的Pb2+檢測方法具有重要實(shí)際意義。

電致化學(xué)發(fā)光（ECL）是一種背景信號低、靈敏度高、可控性強(qiáng)、選擇性好、動力學(xué)響應(yīng)范圍寬、重現(xiàn)性好、檢出限低的分析檢測技術(shù)。近年來，ECL技術(shù)在環(huán)境分析領(lǐng)域受到廣泛關(guān)注。例如，Huang等[11]基于“T-Hg2+-T”的特異性結(jié)合和四氟硼酸二（2，2′-聯(lián)吡啶）（二吡啶并吩嗪）合釕 [Ru（bpy）2（dppz）]（BF4）2（bpy=bipyridine，dppz=dipyrido [3，2-a：2′，3′-c] phenazine）嵌入DNA骨架，構(gòu)建了一個簡單靈敏的檢測Hg2+的ECL生物傳感器；Qiu等[12]基于點(diǎn)擊反應(yīng) “銅催化疊氮-炔丙基反應(yīng)”，通過炔丙基功能化的釕摻雜的二氧化硅納米顆粒與修飾在金電極上的疊氮化合物的反應(yīng)，設(shè)計(jì)了一個檢測Cu2+的高靈敏高選擇性的ECL傳感器。現(xiàn)有的ECL發(fā)光體系[13～15]主要有Ru（bpy）2+3及其衍生物、Luminol及其衍生物、量子點(diǎn)和S2O2

8/O2體系。其中，S2O2

8/O2發(fā)光體系是近年來發(fā)展起來新的發(fā)光體系，具有反應(yīng)試劑價廉易得的優(yōu)點(diǎn)，已被用于檢測凝血酶[16]、促甲狀腺激素（TSH）[17]等生物大分子。但是基于S2O2

8/O2的ECL體系檢測Pb2+的方法還未見報道。

研究發(fā)現(xiàn)苝酐衍生物功能化空心納米金能極大增強(qiáng)S2O2

8/O2體系的ECL信號[18]。本研究利用以Pb2+為輔酶因子的脫氧核酶實(shí)現(xiàn)目標(biāo)物循環(huán)，將苝酐衍生物功能化空心納米金標(biāo)記在發(fā)夾型探針H2上作為信號探針，構(gòu)建了一種超靈敏的ECL傳感器用于Pb2+的檢測。首先在玻碳電極表面沉積納米金，固定含有Pb2+特異性識別位點(diǎn)的發(fā)夾型DNA底物鏈H0。在Pb2+存在時， H0被剪切，在電極上留下單鏈DNA片段，同時目標(biāo)物被釋放， 對余下底物鏈進(jìn)行循環(huán)剪切。剪切后留在電極上的單鏈DNA片段能夠打開發(fā)夾型輔助探針H1，進(jìn)而結(jié)合信號探針H2-HGNPs-PTCA-L-Cys。Pb2+濃度越大，傳感器表面的捕獲信號探針越多，在S2O2

8底液中的ECL信號越強(qiáng)。

2 實(shí)驗(yàn)部分

2.1 儀器與試劑

MPI-E型電致化學(xué)發(fā)光分析系統(tǒng)（西安瑞邁分析儀器有限責(zé)任公司）；CHI660C電化學(xué)工作站（上海辰華儀器有限公司）；S4800 掃描電子顯微鏡（日本日立有限公司）。電致化學(xué)發(fā)光采用三電極系統(tǒng)：玻碳電極（GCE， Φ=4.0 mm）及其修飾電極作工作電極，鉑絲為對電極，Ag/AgCl（飽和KCl）參比電極。

苝四甲酸二酐（3，4，9，10-perylenete-tracarboxylic dianhydride，PTCDA，純度98%， 遼寧聯(lián)港染料化工有限公司）；L-半胱氨酸L-Cys，純度99%），6-巰基己醇（MCH，純度97%， 購于北京百靈威科技有限公司）；氯金酸（HAuCl4· 2O，純度99.9%）為沈陽有色金屬研究院試劑；N-（3-二甲基氨丙基）-N-2-乙基碳二亞胺鹽酸鹽（EDC，純度99%），N-羥基琥珀酰亞胺（，NHS，純度98%）購于上海共價化學(xué)科技有限公司；Pb（NO3）2（純度99%），三羥甲基氨基甲烷（Tris，純度99.5%），檸檬酸鈉（純度99%），NaBH4（純度97%），六水合氯化鈷（CoCl2·6H2O，純度99%），Na2S2O8（純度98%），NaOH（純度98%， 購于成都科龍化工。實(shí)驗(yàn)用水均為 Milli-Q 超 純水（電阻率 18.2 MΩ cm）。核酸序列由上海生工生物工程有限公司合成，如表1 所示。

2.2 實(shí)驗(yàn)方法

2.2.1 空心納米金（HGNPs）的制備 參考文獻(xiàn)[19]方法制備空心納米金。在N2氛圍中，持續(xù)攪拌，以1 min的時間間隔依次將200 μL檸檬酸鈉溶液（0.1 mol/L）、200 μL 新制的NaBH4溶液（1 mol/L）、50 μL CoCl2·6H2O溶液（0.5 mol/L），加入到50 mL去離子水中。45 min后，以2 min的時間間隔加3次1% HAuCl4溶液（每次50 μL），反應(yīng)15 min，移去開N2氛圍直到溶液顏色由黑褐色變?yōu)樯钏{(lán)色離心并用去離子水洗滌沉淀3次，最終所得沉淀加1 mL去離子水分散，4℃保存?zhèn)溆谩ndprint

2.2.2 苝四甲酸和L-半胱氨酸復(fù)合物（PTCA-L-Cys）的制備 稱取苝四甲酸二酐（PTCDA） 0.09 g，加6 mL NaOH 溶液（1 mol/L）溶解，用HCl調(diào)至pH 4～6，加入新制的1mL EDC-NHS溶液（0.04 mol/L EDC， 0.01 mol/L NHS），4℃下活化100 min。再加入L-Cys 0.1 g， 持續(xù)攪拌36 h，溶液離心，用去離子水洗滌3次，所得沉淀用5 mL 去離子水分散，4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

2.2.3 信號探針（H2-HGNPs-PTCA-L-Cys）的制備 取2 mL HGNPs溶液，攪拌下加入PTCA-L-Cys溶液 10 μL，10 min后加入10 μL核苷酸序列 H2，在4℃下攪拌過夜，收集溶液，4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

2.2.4 ECL傳感器制備過程 首先將玻碳電極（GCE）用Al2O3粉拋光，清洗后晾干。浸入1% HAuCl4溶液， 0.2 V恒電位沉積30 s，得到納米金修飾電極（depAu/GCE）。滴加10 μL 發(fā)夾型底物鏈H0 （1×10

6 mol/L） 孵育過夜，通過H0的3′端氨基與納米金形成的AuN鍵[20]作用固定H0鏈，得到H0修飾電極（H0/depAu/GCE）；隨后電極表面用1×10

3 mol/L MCH封閉0.5 h，得到MCH修飾電極（MCH 0/depAu/GCE）。

3 結(jié)果與討論

3.1 傳感器的工作原理

在組裝的傳感器表面滴加上樣品溶液（含1×10

6 mol/L 脫氧核酶（DNAzyme）和不同濃度的Pb（NO3）2標(biāo)準(zhǔn)溶液的pH 8.0的Tris-HCl（0.1 mol/L））孵育1 h。當(dāng)Pb2+存在時，以Pb2+為輔酶因子的脫氧核酶（DNAzyme）可以對嵌入腺嘌呤核苷的發(fā)夾型底物鏈H0在Pb2+特異性識別位點(diǎn)進(jìn)行剪切[10]，從而在電極表面留下能打開輔助探針H1的單鏈DNA片段，并釋放出目標(biāo)物Pb2+和脫氧核酶（DNAzyme），使之進(jìn)入下一個剪切循環(huán)。經(jīng)過N次循環(huán)剪切后，用超純水清洗電極表面，再與輔助探針H1孵育1 h，最后與信號探針H2孵育1 h，然后在S2O2

8溶液中進(jìn)行ECL檢測，ECL信號大小與Pb2+濃度成正比。傳感器工作過程如圖1所示。

3.2 HGNPs和HGNPs-PTCA-L-Cys復(fù)合物的SEM表征

圖2A為 HGNPs的SEM圖像，可以看到HGNPs的邊緣比中心要亮很多，是表面光滑的空心球體；圖2B為HGNPs-PTCA-L-Cys復(fù)合物的SEM圖像，可以清楚的看到球體表面被一些小顆粒覆蓋，不再是光滑的球面，表明空心納米金的表面被PTCA-L-Cys功能化。

3.3 電極表面電活性面積表征

當(dāng)玻碳電極表面修飾上物質(zhì)時，其電活性面積會發(fā)生變化。電活性面積的計(jì)算的依據(jù)是Randles-Sevcik方程[21]：

ip=2.69×105n3/2D1/2v1/2Ac（1）

式中ip為峰電流（A），n為電子轉(zhuǎn)移數(shù)，D為擴(kuò)散系數(shù)（在25℃ 時為6.7±0.2×106 cm2/s），v為電位掃描速率（V/s），A為電極表面積（cm2），c為被測物質(zhì)的濃度（mol/L）。如圖3所示，采用循環(huán)伏安法（CV）對裸電極（圖3A）與沉積納米金（圖3B）后的電極在pH為7.4的磷酸鹽緩沖溶液中（含有5×103 mol/L的[Fe（CN）6]3/4和0.1 mol/L KCl），以0.035 V/s的梯度從0.02～0.3 V/s在

0.2～0.6 V的電位范圍內(nèi)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。得到的還原峰電流值（ip）與掃速的平方根（v1/2）在0.02～0.3 V/s的梯度掃速有良好的線性響應(yīng)，裸電極和沉積納米金的電極的線性方程分別為： ip=0.0005055υ1/2+0.000049和ip=0.0007044v1/2+0.000025。根據(jù)Randles-Sevcik方程計(jì)算，得到電活性面積分別為14.5 mm2和20.2 mm2，由此表明， 納米金成功的修飾在了電極上。

3.4 修飾電極的CV表征

ECL傳感器的構(gòu)建過程采用循環(huán)伏安法（CV）表征。如圖4所示，裸電極上顯示了一對準(zhǔn)可逆的氧化還原峰（曲線a）。在裸電極上沉積金（depAu）后，由于納米金能夠增加電極的有效表面積，峰電流增大（曲線b）；接著將發(fā)卡型底物鏈H0孵育在電極上，電極表面的負(fù)電荷增多，阻礙探針與電極間的電子轉(zhuǎn)移，峰電流值下降（曲線c）；滴加MCH封閉非特異性結(jié)合位點(diǎn)，進(jìn)一步了阻礙電子傳遞，電流繼續(xù)下降（曲線d）。與含有脫氧核酶（DNAzyme）和不同濃度Pb2+的樣品溶液孵育后，發(fā)生剪切反應(yīng)，使得發(fā)卡型底物鏈H0變?yōu)檩^短的DNA單鏈片段，電極表面的負(fù)電荷減少，對[Fe（CN）6]3/4

的排斥作用減弱，探針與電極間的電子轉(zhuǎn)移阻礙減小，電流略有增加（曲線e）； 與H1育后，它的一端與電極上殘留的單鏈DNA片段發(fā)生雜交，生成雙鏈DNA，電極表面物質(zhì)量增加，且負(fù)電荷增多，進(jìn)一步阻礙探針與電極間的電子轉(zhuǎn)移，峰電流降低（曲線f）加入納米信號探針H2-HGNPs-PTCA-L-Cys孵育后，H1的另一端與有標(biāo)記物的H2雜交生成DNA雙鏈，更進(jìn)一步阻礙電子傳遞，峰電流也隨之降低（曲線g）。

3.5 修飾電極的ECL表征

采用ECL對傳感器的組裝過程做了表征（圖5）。電致化學(xué)發(fā)光參數(shù)設(shè)置為：光電倍增管高壓800 V，掃描速率0.2 V/s，掃描電位

1.5～0 V，放大級數(shù)為3級。如圖5A所示，裸玻碳電極在表現(xiàn)出明顯的ECL信號（曲線a）；在電極表面沉積納米金后，電極的有效比表面積增加，ECL響應(yīng)信號增強(qiáng)（曲線b）；修飾上H0后，由于負(fù)電性DNA阻礙電子傳遞，ECL響應(yīng)信號降低（曲線c）；接著用MCH封閉非特異性結(jié)合位點(diǎn)，進(jìn)一步阻礙了電子的傳遞，使得ECL響應(yīng)信號繼續(xù)降低（曲線d）。將上述電極與DNAzyme和Pb2+孵育后，發(fā)卡型底物鏈被剪切，在電極上留下單鏈DNA片段，，ECL信號強(qiáng)度略有增加（曲線e）；加入H1與，與電極上殘留的單鏈DNA片段發(fā)生雜交，生成雙鏈DNA進(jìn)一步阻礙電子傳遞，ECL響應(yīng)信號降低（曲線f）。加入信號探針H2-HGNPs-PTCA-L-Cys為最佳，由于苝四甲酸復(fù)合物功能化的空心納米金能增強(qiáng)過硫酸根體系的ECL信號，ECL信號極大增加（曲線g）。圖5B對比了在H2上標(biāo)記空心納米金和PTCA-L-Cys功能化空心納米金產(chǎn)生的ECL信號。當(dāng)信號探針H2上標(biāo)記了HGNPs時，ECL信號明顯增強(qiáng)；而標(biāo)記PTCA-L-Cys- HGNPs后，ECL信號顯著增強(qiáng)，從而提高了Pb2+檢測的靈敏度。endprint

圖5 不同修飾電極的ECL表征。0.1 mol/L PBS （pH 7.4，含0.1 mol/L K2S2O8）底物溶液，電位范圍為1.5～0 V時。A為電極的修飾過程表征： a. GCE，b.depAu/GCE，c. H0/depAu/GCE，d. MCH 0/depAu/GCE，e. DNAzyme+Pb2+/MCH 0/depAu/GCE，f. H1/DNAzyme+ Pb2+/MCH 0/depAu/GCE，g. H2-HGNPs 1/DNAzyme+Pb2+/MCH 0/depAu/GCE， h. H2-HGNPs-PTCA- L-Cys 1/DNAzyme+ Pb2+/MCH 0/depAu/GCE； B為不同信號標(biāo)記物的ECL信號對比。

Fig.5 ECL characterization of different electrodes in 0.1 mol/L K2S2O8 . （A） modification process of electrode. a. GCE， b. depAu/GCE， c. H0/depAu/GCE， d. MCH 0/depAu/GCE， e. DNAzyme+Pb2+/MCH 0/depAu/GCE， f. H1/DNAzyme +Pb2+/MCH 0/depAu/GCE， g. H2-HGNPs-PTCA-L-Cys 1/DNAzyme+ Pb2+/MCH 0/depAu/GCE；（B） comparison of ECL signals with different singal label. Potential scan range is from

1.5 V to 0 V.

3.6 ECL傳感器的響應(yīng)性能

配制不同濃度的Pb2+標(biāo)準(zhǔn)溶液，在其它條件不變的情況下進(jìn)行ECL檢測。實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖6所示，以ECL強(qiáng)度變化值ΔI對Pb2+濃度的對數(shù)值lgc作圖，可見Pb2+濃度在1012～106 mol/L范圍內(nèi)與ECL響應(yīng)信號呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系，線性方程為ΔI=451.5lgc/（mol/L）+ 6861（r=0.9908），檢出限為10

12 mol/L（S/N=3）。將本方法和其它的Pb2+檢測方法進(jìn)行了對比（表2），可以看出，本實(shí)驗(yàn)中設(shè)計(jì)的Pb2+ ECL傳感器具有較寬的檢測范圍，可用于檢測微量Pb2+。

電感耦合等離子體發(fā)射光譜法

Inductively coupled plasma optical emission spectrometry，ICP OES2.4×107～2.4×106

熒光光譜法 Fluorescent spectrometry， FL3.3×1010～8.0×109表面增強(qiáng)拉曼散射法 Surface-Enhanced Raman Scattering， SERS109～105致化學(xué)發(fā)光 Electrochemiluminescence， ECL1012～106This work

3.7 ECL傳感器的穩(wěn)定性

對不同濃度的Pb2+標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行ECL檢測，如圖7所示，從a到g的曲線依次代表濃度從1×10

12～1×106 mol/L的Pb2+標(biāo)準(zhǔn)溶液，每個濃度下選取連續(xù)3圈掃描得到的ECL信號強(qiáng)度基本沒有變化，說明我們制備的ECL傳感器具有較好的穩(wěn)定性。

圖6 傳感器在不同鉛離子濃度下的ECL信號（從下向上： 10

12 mol/L，1011 mol/L，1010 mol/L，109 mol/L，108 mol/L，107 mol/L，106 mol/L），插圖為線性關(guān)系曲線。

Fig.6 ECL signal of sensors in different concentrations of lead ions （from bottom to up： 1012 mol/L， 1011 mol/L， 1010 mol/L，109 mol/L，108 mol/L， 107 mol/L， 6 mol/L）. Inset shows the linear calibration curve.

3.8 ECL傳感器的選擇性

如圖8所示，在各干擾離子濃度均為104 mol/L時，106 mol/L Pb2+的ECL響應(yīng)信號遠(yuǎn)高出其它金屬離子，表明所構(gòu)建的傳感器具有良好的選擇性。

4 結(jié) 論

本研究通過Pb2+引發(fā)脫氧核酶剪切底物核酸鏈，實(shí)現(xiàn)目標(biāo)物循環(huán)，并基于苝酐衍生物功能化空心納米金信號探針，建立了一種Pb2+ ECL傳感器。該傳感器具有價廉、靈敏度高、選擇性高的特點(diǎn)，其檢測線性范圍為1×1012～1×106 mol/L，而且一些常見的金屬離子對此Pb2+傳感器不會造成干擾，可望用于實(shí)際樣品中微量Pb2+的檢測。

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