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    基于介觀量子理論的最佳PCR引物濃度計算

    2017-10-31 06:17:16周德良劉明坤葉鋒
    關(guān)鍵詞:量子區(qū)間關(guān)聯(lián)

    周德良,劉明坤,葉鋒

    基于介觀量子理論的最佳PCR引物濃度計算

    周德良,劉明坤,葉鋒

    (北京旌準(zhǔn)醫(yī)療科技有限公司,北京 100176)

    對PCR反應(yīng)體系而言,引物濃度過高或過低對反應(yīng)體系都存在嚴(yán)重的影響,只有合理的濃度區(qū)間才能對整個反應(yīng)高效有序地進行發(fā)揮重要的作用.降低PCR引物間的量子效應(yīng)有利于提高引物間PCR反應(yīng)的獨立性和確定性,故粒子自由程至少是相位關(guān)聯(lián)長度的10倍,并由此可以得到引物反應(yīng)濃度的上限;粒子非彈性散射的最大自由程是粒子運動的極限自由程,依此可以得到引物反應(yīng)濃度的下限,從而確定了引物的有效濃度區(qū)間;引物濃度-擴增效率曲線一般呈單峰分布,利用黃金分割法可以精準(zhǔn)、迅速地確定引物最佳濃度?;谏鲜鲇嬎惴椒?,長20、25、30 nt的引物有效濃度區(qū)間分別為0.027~5.280、0.019~7.310、0.015~9.461 umol·L-1。引物有效濃度區(qū)間及最佳濃度對PCR反應(yīng)體系的反應(yīng)效率與速率、PCR產(chǎn)物質(zhì)量等具有決定性的作用,而應(yīng)用理論方法確定它們將對理論指導(dǎo)實驗具有重要的意義。

    量子相干長度;相位關(guān)聯(lián)長度;引物量子濃度;黃金分割法;PCR

    量子力學(xué)是研究微觀粒子(如電子、原子、分子等)運動規(guī)律及其性質(zhì)的物理理論,通過該理論可以獲知物質(zhì)的原子結(jié)構(gòu)、分子結(jié)構(gòu)、分子間作用力、電子運動規(guī)律等,從而可以對物質(zhì)的物理性質(zhì)、化學(xué)性質(zhì)以及它們的微觀變化進行探索。利用量子力學(xué)方法可以直接對生物大分子進行計算[1-4],由此可以得到生物大分子的基本性質(zhì)與屬性,從而可以對分子間相互作用力[5-6]、電子結(jié)構(gòu)反應(yīng)活性[7-9]、生物大分子構(gòu)象與功能等進行分析,進而獲得微觀體系下微觀粒子的運動規(guī)律及相關(guān)屬性。PCR反應(yīng)即聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)[14-15],主要指在DNA聚合酶作用下,以母版DNA為模板,以特定引物為延伸起點,通過變性、退火、延伸等步驟,在體外復(fù)制出與母版DNA互補的子鏈DNA的過程,其中“延伸”過程的工作溫度在345 K.PCR技術(shù)包括數(shù)字PCR[17-20]和定量PCR[21-22],但無論哪種PCR技術(shù),都存在循環(huán)閾值不高、擴增效率與速率不理想等問題,而導(dǎo)致這一問題的原因有很多,其中最主要的原因之一就是引物濃度的選擇問題。當(dāng)引物濃度過高,則增加反應(yīng)體系的無序性與噪聲強度;當(dāng)引物濃度過低,則降低反應(yīng)體系的信噪比與產(chǎn)物質(zhì)量,因此,有效的引物濃度區(qū)間及最佳濃度對PCR反應(yīng)效率與速率、PCR產(chǎn)物質(zhì)量等至關(guān)重要。

    采用介觀量子理論,通過獲得量子相干長度、相位關(guān)聯(lián)長度、彈性散射極限自由程等基本性質(zhì)對微觀體系下引物的有效濃度區(qū)間進行了量子計算,從理論水平上得到了高置信度的引物有效濃度區(qū)間,然后采用黃金分割法對引物有效濃度區(qū)間進行優(yōu)選,從而可以確定引物最佳濃度。該量子計算方法不僅提供了引物有效濃度區(qū)間及最佳濃度的理論建立方法,同時對提高PCR反應(yīng)效率與速率、PCR產(chǎn)物質(zhì)量等具有重要意義。

    1 引物濃度大小對PCR反應(yīng)體系的影響

    對PCR反應(yīng)體系而言,合理的引物濃度區(qū)間對PCR反應(yīng)的擴增效率與速率至關(guān)重要,濃度太高或太低都存在自身的優(yōu)勢與不足,對PCR反應(yīng)本身產(chǎn)生重要的影響。

    高引物濃度對PCR反應(yīng)的優(yōu)、缺點[15-16]總結(jié)如下:

    優(yōu)點:

    (1)提高粒子流強度,使反應(yīng)體系的信噪比提高;

    (2)提高引物與靶基因序列之間的結(jié)合配對效率;

    (3)改善PCR擴增產(chǎn)物的產(chǎn)出及質(zhì)量。

    缺點:

    (1)增加系統(tǒng)熵,使系統(tǒng)傾向于更加無序;

    (2)引入高噪聲強度;

    (3)導(dǎo)致非特異性的引物結(jié)合和非期望PCR產(chǎn)物的產(chǎn)生。

    低引物濃度對PCR反應(yīng)的優(yōu)點與高引物濃度的缺點表述相反,而低引物濃度的缺點則與高引物濃度的優(yōu)點表述相反。

    由此可見,引物濃度偏高或偏低存在明顯的雙重作用:既對PCR反應(yīng)產(chǎn)生了有利因素,但又對PCR反應(yīng)造成了不可忽略的負(fù)面影響。因此,為保證反應(yīng)體系高效有序的進行,引物濃度不宜過高或過低,只有合理的濃度區(qū)間才能對PCR反應(yīng)的擴增效率與速率起到?jīng)Q定性作用。

    2 量子相干長度和相位關(guān)聯(lián)長度

    量子相干長度[10-11]指粒子彈性散射的平均自由程,其滿足公式如下:

    其中?為約化普朗克常數(shù),滿足?=h/2π.

    相位關(guān)聯(lián)長度[12-13]指粒子非彈性散射的平均自由程,其滿足公式如下:

    其中h為普朗克常數(shù);m為微粒質(zhì)量;k為玻爾茲曼常數(shù);T為反應(yīng)體系溫度。

    在PCR反應(yīng)過程中,引物濃度對整個擴增反應(yīng)的進行具有重要作用,為計算引物濃度的有效區(qū)間,假設(shè)引物長度為20 nt,則其分子量為6 500 Dalton,質(zhì)量m為1.08×10-23kg,長度為6.8 nm。由于DNA復(fù)制出現(xiàn)在“延伸”過程,故將“延伸”步驟工作溫度T(345 K)定為反應(yīng)體系工作溫度,于是,根據(jù)(1)式代入各相應(yīng)參數(shù),可得到引物的量子相干長度為lq=1.7×10-3nm,其遠(yuǎn)小于引物尺寸,說明整個引物體系屬于非全同粒子體系。

    根據(jù)(2)式,代入各相應(yīng)參數(shù),可得到引物的相位關(guān)聯(lián)長度為Lφ=6.8 nm,其與引物長度相近,說明整個反應(yīng)體系經(jīng)典效應(yīng)與量子效應(yīng)并存,且經(jīng)典效應(yīng)強于量子效應(yīng)。

    3 引物最大濃度

    相位關(guān)聯(lián)長度是體系有無量子效應(yīng)的表征,當(dāng)粒子平均自由程遠(yuǎn)大于相位關(guān)聯(lián)長度時微觀粒子體系將只服從經(jīng)典效應(yīng),不具有量子效應(yīng)。為了提高引物間PCR反應(yīng)的獨立性與確定性,必須減弱引物體系的量子效應(yīng)、增強其經(jīng)典效應(yīng),從而可以有效地提高PCR反應(yīng)的擴增效率與速率。因此,應(yīng)使引物的實際自由程L遠(yuǎn)大于相位關(guān)聯(lián)長度Lφ=6.8 nm,故引物實際自由程至少是相位關(guān)聯(lián)長度的10倍,即取值68 nm。

    粒子自由程L與引物濃度C滿足如下關(guān)系式:

    其中n為引物的物質(zhì)的量;V為反應(yīng)體系的體積;NA為阿伏伽德羅常數(shù);L為粒子/引物的實際自由程,單位為nm。

    將實際自由程L=68 nm代入(3)式可得引物的最大濃度為 5.28 umol·L-1。

    4 引物最小濃度

    相位關(guān)聯(lián)長度指出了微觀粒子非彈性散射的平均自由程,但為了計算引物的最低濃度,必須得到引物非彈性散射的最大自由程Lmax,這樣,帶入(3)式即可得到引物的最低濃度。

    PCR反應(yīng)體系是液體環(huán)境,引物在溶液中運動并與DNA模板相結(jié)合以實現(xiàn)DNA擴增過程。在液態(tài)環(huán)境下,引物運動受到阻力作用,且阻力滿足斯托克斯定律公式:

    F阻=3πηdv (4)

    上式中η為液體的粘滯系數(shù)/粘度,單位為P或Pa·s(1 P=0.1 Pa·s);由于 PCR 反應(yīng)體系是須經(jīng)大量水進行稀釋的液體環(huán)境,其主要成分是水,故令η為水的粘滯系數(shù) 6.56×10-4pa·s;d 為引物直徑,為 0.8 nm;v為引物運動速度。

    在PCR反應(yīng)體系內(nèi),引物的平均熱運動能量E熱動能滿足

    其中k為玻爾茲曼常數(shù);T為345K,于是得E熱動能=7.14×10-21J.

    在PCR反應(yīng)體系內(nèi),引物運動速度v滿足

    其中引物質(zhì)量m為1.08×10-23kg;v為引物熱運動速度。將(5)式帶入(6)式可得引物熱運動速度為v=36.36 m·s-1。

    將 η=6.56×10-4pa·s、d=0.8 nm 和 v=36.36 m·s-1帶入(4)式,可得引物在PCR反應(yīng)體系內(nèi)的粘滯阻力為 F阻=1.8×10-10N。

    彈性散射的最大自由程L彈滿足

    將(4)、(5)式結(jié)果帶入(7)式得 L彈=3.96×10-2nm。

    在微粒體系內(nèi),粒子在進入非彈性散射之前一般會經(jīng)歷約104次左右彈性散射,于是非彈性散射的最大自由程Lmax滿足

    將L彈=3.96×10-2nm帶入上式得Lmax=396 nm,將Lmax帶入(3)式,于是得引物的最小濃度為0.026 7 umol·L-1。

    由此可知,對于20 nt長的引物其有效濃度區(qū)間為0.027~5.280 umol·L-1, 有效自由程區(qū)間為 68~396 nm。如果將引物長度設(shè)為25 nt和30 nt,而延伸過程仍工作在345 K,則它們的有效濃度區(qū)間仍按上述過程進行計算,結(jié)果見表1。

    表1 不同引物長度對應(yīng)的有效濃度區(qū)間Table 1 The effective concentration range of primers of different lengths

    目前Sigma-Aldrich(西格瑪奧德里奇)、Bio-Rad(伯 樂)、QIAGEN (天 根)、New-England-Biolabs(NEB)、生工等國內(nèi)外大型生物大公司常用的PCR引物濃度區(qū)間為 0.05~1.0 umol·L-1[15],而且有文獻(xiàn)表明引物濃度為2.2 umol·L-1[16]時PCR副產(chǎn)物產(chǎn)量最少,由此表明提供的引物濃度量子計算方法是比較合理的。

    5 引物最佳濃度

    實驗得到了不同長度引物的有效濃度區(qū)間,其中20 nt長引物的有效濃度區(qū)間為[0.027,5.280](單位umol·L-1),超出這個濃度之外,從理論上講引物的擴增效率就會降低,甚至無法實現(xiàn)正常擴增,而這個濃度區(qū)間對應(yīng)的有效自由程區(qū)間為[68,396](單位nm)。

    引物濃度-擴增效率(x-y)曲線一般在有效濃度區(qū)間內(nèi)滿足單峰分布,為了在有效濃度區(qū)間[0.027,5.280]內(nèi)精確、迅速地確定最優(yōu)濃度,采用黃金分割法進行優(yōu)選分析,而優(yōu)選過程如下:

    有效濃度區(qū)間[0.027,5.280]關(guān)于區(qū)間中點對稱的兩個黃金分割點分別為2.034 umol·L-1(0.027+5.253*0.382)和3.273 umol·L-1(0.027+5.253*0.618),實驗比較兩個黃金分割點的擴增效率,如果2.034的擴增效率更高,則將區(qū)間(3.273,5.280]刪去并將余下區(qū)間[0.027,3.273]作為一次優(yōu)化區(qū)間(2.034仍是區(qū)間 [0.027,3.273]的黃金分割點),否則刪去區(qū)間[0.027,2.034);繼續(xù)實驗比較新濃度區(qū)間相互對稱的兩個黃金分割點的擴增效率,并按前述要求刪去低擴增效率黃金分割點某一側(cè)不含另一黃金分割點的全部區(qū)間;重復(fù)上述過程,直到得到最優(yōu)濃度。

    在上述優(yōu)化過程中,令優(yōu)化過程的迭代次數(shù)為9,這樣有效濃度區(qū)間[0.027,5.280]經(jīng)迭代優(yōu)化后變?yōu)閰^(qū)間寬度為5.253×0.6189=0.069的優(yōu)化區(qū)間。令最優(yōu)濃度取0.05n(n為正整數(shù)),則最優(yōu)引物濃度即優(yōu)化區(qū)間內(nèi)滿足0.05n的引物濃度,但若優(yōu)化區(qū)間內(nèi)包含兩個0.05n,則取距區(qū)間端點更遠(yuǎn)的一點作為最優(yōu)引物濃度。

    6 總結(jié)

    PCR引物濃度過高,則增加反應(yīng)體系的無序性與噪聲強度;引物濃度過低,則降低反應(yīng)體系的信噪比與擴增產(chǎn)物質(zhì)量。無論引物濃度偏高或偏低,一方面它們都對PCR反應(yīng)有利,但另一方面它們又都對PCR反應(yīng)帶來了嚴(yán)重的負(fù)面作用。因此,建立了一種量子計算方法對PCR反應(yīng)的引物有效濃度區(qū)間及最佳濃度進行計算,而計算原理及方法如下:

    相位關(guān)聯(lián)長度是經(jīng)典效應(yīng)與量子效應(yīng)的分界線,當(dāng)引物平均自由程遠(yuǎn)大于相位關(guān)聯(lián)長度時微觀體系將只服從經(jīng)典效應(yīng),這樣可以提高引物間PCR反應(yīng)的獨立性與確定性,因此,引物自由程應(yīng)滿足至少是相位關(guān)聯(lián)長度的10倍,并依此可以得到有效濃度區(qū)間的上限值;粒子非彈性散射的最大自由程是粒子運動的極限自由程,依此可以得到有效濃度區(qū)間的下限值.因此,對于20 nt長的引物而言,其有效濃度區(qū)間為0.027~5.280 umol·L-1, 有效自由程區(qū)間為68~396 nm.引物濃度-擴增效率曲線一般呈單峰分布,利用黃金分割法可以準(zhǔn)確、迅速地確定引物最佳濃度,并對優(yōu)化過程要求迭代優(yōu)化次數(shù)為9,優(yōu)化精度為0.069,而最優(yōu)濃度取0.05n(n為正整數(shù))。

    應(yīng)用上述方法,可以得到不同引物長度、不同反應(yīng)溫度對應(yīng)的引物有效濃度區(qū)間及最佳濃度,將對提高PCR反應(yīng)效率與速率、PCR產(chǎn)物質(zhì)量等具有決定性的作用,同時該量子計算方法從實際理論出發(fā)計算引物有效濃度區(qū)間及最佳濃度,對理論指導(dǎo)實驗具有一定的指導(dǎo)價值。

    [1] Patila A B,Bhanage B M.Modern ab initio valence bond theory calculations reveal charge shift bonding in protic ionic liquids [J].Phys Chem Chem Phys,2016,18(23):15783-15790.

    [2] Cooper D L,Gerratt J,Raimondi M.ChemInform Abstract:Applications of Spin-Coupled Valence Bond Theory[J].Chem.Rev,1991,91(5):929-964.

    [3] Katsuhiko H,Masahiko H.Recent Development of the Pair Density Functional Theory[J].Quantum Matter,2015(1):56-62.

    [4] Kohn W,Sham L J.Self-Consistent Equations Including Exchange and Correlation Effects[J].Phys.Rev,1965,140:1133-1138.

    [5] Heitler W,London F.Wechselwirkung neutraler Atome und homopolare Bindung nach der Quantenmechanik [J].Z.Phys,1927,44(6):455-472.

    [6] Thom H D J,Xu L T,Tyler Y T,et al.Insights into the Electronic Structure of Molecules from Generalized Valence Bond Theory [J].J Phys Chem A,2016,120(11):1763-1778.

    [7] Zheng S Z.Energy quantization for approximate H-surfaces and applications[J].Electron.J.Diff.Equa,2013,177:1-13.

    [8] Bohr N.The Spectra of Helium and Hydrogen [J].Nat,1913:(2295):231-232.

    [9] Dugi J J,Dugi M,F(xiàn)rancom A,et al.Quantum Structures of the Hydrogen Atom[J].OALib J,2014(1):1-9.

    [10] Malpetti D,Roscilde T.Quantum correlations,separability and quantum coherence length in equilibrium many-body systems[J].Quantum.Phys,2016(2):1-10.

    [11] Wignall J W G.De Broglie waves and the nature of mass[J].Found.Phys,1985,15(2):207-227.

    [12] Lin J J,Giordano N.Electron scattering times from weak localization studies of Au-Pd films[J].Phys.Rev.B:Condens.Matter,1987,35(3):1071-1075.

    [13] 馬中水.介觀物理基礎(chǔ)和近期發(fā)展幾個方面的簡單介紹[J].物理學(xué)報,2007,36(2):98-129.

    [14] Navarroa E,Herasa G S,Casta?oa M J,et al.Real-time PCR detection chemistry[J].Clin.Chim.Acta,2015,439:231-250.

    [15] Saunders N A and Lee M A.Real-Time PCR:Advanced Technologies and Applications[M].Poole:Caister Academic Press,2013.

    [16] 張偉偉,張衍梅,余其興,等.DOP-PCR陰性對照中的產(chǎn)物分析及引物濃度的優(yōu)化[J].武漢大學(xué)學(xué)報,2006,52(2):220-224.

    [17] Bacher U,Dicker F,Haferlach C,et al.Quantification of rare NPM1 mutation subtypes by digital PCR [J].Br J Haematol,2014,167(5):710-714.

    [18] 林彩琴,姚波.數(shù)字PCR技術(shù)進展 [J].化學(xué)進展,2012,24(12):2415-2423.

    [19] Sanders R,Huggett J F,Bushell C A,et al.Evaluation of digital PCR for absolute DNA quantification[J].Analytical Chemistry,2011,83(17):6474-6484.

    [20] Hindson B J,Ness K D,Masquelier D A,et al.High-Throughput Droplet Digital PCR System for Absolute Quantitation of DNA Copy Number[J].Analytical Chemistry,2011,83:8604-8610.

    [21] Whale A S,Huggett J F,Cowen S,et al.Comparison of microfluidic digital PCR and conventional quantitative PCR for measuring copy number variation [J].Nucleic Acids Res,2012,40(11):82.

    [22] Dingle T C,Sedlak R H,Cook L,et al.Tolerance of dropletdigital PCR vs.real-time quantitative PCR to inhibitory substances[J].Clin Chem,2013,59(11):1670-1672.

    Calculation of Optimal PCR Primer Concentration Based on Mesoscopic Quantum Theory

    Zhou Deliang,Liu Mingkun,Ye Feng
    (BeiJing Genome Precision Technology Co.,Ltd,Beijing 100176)

    In PCR reaction system,the extreme high or low primer concentration would have very serious influences on reaction systems,but the rational concentration range would play a significant role on effective and orderly proceeding of reaction systems.It was beneficial to enhance the independence and certainty of PCR reaction that decreasing quantum effect among primers,so the free path of particles must be phase correlation length at least 10 times,and the maximum concentration of primers could be obtained based on it.The maximal free path of inelastic scattering of particles was ultimate free path of particles moving,which could calculate the minimum concentration of primers,then the effective concentration range for primers could be determined.The primer concentration-reaction efficiency usually appeared as unimodal distribution,and the optimum primer concentration could be precisely and quickly confirmed by the golden section method.Based on the above conclusions,the effective concentration range for primer of 20、25、30 nt were 0.027~5.280、0.019~7.310、0.015~9.461 umol·L-1respectively.The effective concentration range and optimal concentration could play the decisive role on the reaction efficiencies and velocities of PCR、the quality of PCR product,etc,and using theory method to determine them would be important for theories leading experiments.

    quantum coherence length;phase correlation length;primer quantum concentration;golden section method;PCR

    Q61

    A

    1002-2090(2017)05-0074-04

    10.3969/j.issn.1002-2090.2017.05.018

    2017-04-06

    周德良(1985-),男,工程師,內(nèi)蒙古大學(xué)畢業(yè),現(xiàn)主要從事量子物理與量子生物學(xué)方面的研究。

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