高效液相色譜法測(cè)定陰地蕨中山奈酚和槲皮素含量*

何可群

(貴州民族大學(xué)化學(xué)與環(huán)境科學(xué)學(xué)院，貴陽(yáng) 550025)

陰地蕨(Botrychium ternatum)是陰地蕨科陰地蕨屬多年生草本植物，又名肺心草、蕨葉一枝蒿、獨(dú)蕨箕、一朵云等［1-4］。陰地蕨以全草入藥，具有清熱解毒、止咳平喘、平肝息風(fēng)的功效，主治風(fēng)熱感冒、咽喉腫痛、百日嗽、肺結(jié)核、乳腺炎、腮腺炎、小兒驚風(fēng)、瘡癰腫毒、目生翳障、火眼腫癢等，是我國(guó)西南地區(qū)白族、彝族、納西族、苗族等少數(shù)民族常用的野生草藥［1-5］。目前對(duì)陰地蕨的研究報(bào)道還很少，已有的資料表明，陰地蕨的化學(xué)成分主要為黃酮、三萜、皂苷、香豆素、揮發(fā)油等，其黃酮類成分為陰地蕨素，槲皮素3-O-α-L-鼠李糖-7-O-β-D-葡萄糖苷及木犀草素等［4-6］。通過(guò)文獻(xiàn)檢索，筆者還未見(jiàn)有關(guān)陰地蕨中山奈酚的研究報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)采用高效液相色譜-質(zhì)譜串聯(lián)(HPLC-MS/MS)獲得分子量信息，進(jìn)而通過(guò)與標(biāo)樣保留時(shí)間對(duì)比，確定陰地蕨的山奈酚及槲皮素成分，以峰面積對(duì)濃度的回歸方程對(duì)兩種成分進(jìn)行定量測(cè)定。研究結(jié)果可以為該民族藥的進(jìn)一步開(kāi)發(fā)及擴(kuò)大資源利用提供科學(xué)依據(jù)。

1 儀器與試劑

1.1 儀器 Agilent 1200 LC高效液相色譜儀(美國(guó)安捷倫儀器有限公司)及API3200 QTRAP MS/MS質(zhì)譜儀(配ESI源、三重四級(jí)桿及線性離子阱，美國(guó) AB SCIEX 公司)，Ecilipse XDB-C18(150 mm ×4.6 mm，5μm)色譜柱(上海笛柏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司);Agilent 1260 LC高效液相色譜儀，Eclipse plus C18色譜柱(100 mm×4.6 mm，5μm)，G1314F 1260 VWD 可變波長(zhǎng)紫外檢測(cè)器，數(shù)顯恒溫水浴鍋(常州博遠(yuǎn)實(shí)驗(yàn)分析儀器有限公司)，METTLERAE240電子分析天平(上海天平儀器廠，感量:0.01 mg)。

1.2 試劑 山奈酚(批號(hào):520-18-3)及槲皮素 (批號(hào):117-39-5)對(duì)照品均購(gòu)自貴州迪大科技有限責(zé)任公司。磷酸為優(yōu)級(jí)純，甲酸、無(wú)水甲醇均為色譜純，濃鹽酸為分析純，所有試劑用超純水配制。陰地蕨樣品購(gòu)自云南省云龍縣，經(jīng)貴州民族大學(xué)盧文蕓教授鑒定為陰地蕨(Botrychium ternatum)，標(biāo)本保存于貴州民族大學(xué)化學(xué)與環(huán)境科學(xué)學(xué)院藥學(xué)教研室。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜和質(zhì)譜條件

2.1.1 HPLC-MS/MS 色譜柱為 Ecilipse XDB-C18(150 mm×4.6 mm，5μm)，柱溫:35 ℃，流動(dòng)相:甲醇-0.1%甲酸溶液(85∶15)，流速為 1.2 mL·min－1。電噴霧離子源(electron spray ionization，ESI)，山奈酚采用MRM模式進(jìn)行正離子監(jiān)測(cè)，噴霧電壓為5.5 kV、離子源溫度600℃，去簇電壓62 V，掃描范圍m/z 50～305。槲皮素采用MRM模式進(jìn)行負(fù)離子監(jiān)測(cè)，噴霧電壓為－4.5 kV、離子源溫度 600 ℃，去簇電壓－55 V，掃描范圍m/z 50～305。

2.1.2 定量測(cè)定色譜條件 Agilent 1260 LC高效液相色譜儀，Eclipse plus C18色譜柱(100 mm×4.6 mm，5μm)，流動(dòng)相為甲醇-0.4%磷酸溶液(45∶55)，流速0.8 mL·min－1，檢測(cè)波長(zhǎng)360 nm，柱溫30℃，進(jìn)樣量10μL。

2.2 對(duì)照品儲(chǔ)備液的配制 精密稱取槲皮素、山奈酚對(duì)照品各20.00 mg，分別置于50 mL量瓶中，加無(wú)水甲醇適量使其溶解，以無(wú)水甲醇定容。搖勻，配制成質(zhì)量濃度均為400μg·mL－1的單一對(duì)照品儲(chǔ)備液備用，臨用前稀釋為山奈酚0.800μg· mL－1及槲皮素1.00μg·mL－1濃度供質(zhì)譜分析。

2.3 供試品溶液制備 將自然晾干的陰地蕨全草在電熱鼓風(fēng)干燥箱中于(60±1)℃烘干3 h，精確稱取干燥、粉碎(過(guò)40目篩)的陰地蕨粉末0.250 g，用80%甲醇溶液20 mL浸泡、75℃水浴回流提取2次，每次1 h，提取結(jié)束后，合并提取液、冷卻、濾過(guò)。濾液用80%甲醇水溶液補(bǔ)足至40 mL，加鹽酸10 mL，85℃水浴回流酸水解1 h，迅速冷卻，用無(wú)水甲醇定容至50 mL，搖勻，臨用前過(guò)孔徑 0.45μm 濾膜［7-9］。

2.4 HPLC-MS/MS實(shí)驗(yàn) 取對(duì)照品和供試品溶液3μL分別注入 HPLC-MS/MS，得到山奈酚對(duì)照品溶液、槲皮素對(duì)照品溶液、供試品溶液中的山奈酚及槲皮素的MS譜圖(圖1，2)。在正離子監(jiān)測(cè)模式下，山奈酚對(duì)照品溶液和供試品溶液對(duì)應(yīng)峰MS譜圖產(chǎn)生5個(gè)主要的特征碎片離子 m/z287，185，161，153，121(圖1)，m/s287為山奈酚的［M+H］+峰，證明樣品中含有山奈酚［10-11］;在負(fù)離子監(jiān)測(cè)模式下，槲皮素對(duì)照品溶液和供試品溶液對(duì)應(yīng)峰MS譜圖產(chǎn)生5個(gè)主要的特征碎片離子 m/s273，257，239，229，211(圖 2)，m/z301.0為槲皮素的［M+H］+峰，證明樣品中含有槲皮素［10-11］。由于采用負(fù)離子監(jiān)測(cè)模式，槲皮素的MS圖譜中沒(méi)有出現(xiàn)m/z285峰。

2.5 保留時(shí)間的確定 將20.00μg·mL－1山奈酚、槲皮素混合對(duì)照品溶液按“2.1.2”項(xiàng)色譜條件進(jìn)樣分析，得到對(duì)照品及樣品色譜圖(圖3)。結(jié)果陰地蕨供試品出現(xiàn)與混合對(duì)照品中山奈酚(18.66 min)、槲皮素(10.11 min)保留時(shí)間一致的兩個(gè)峰。

2.6 線性關(guān)系考察 分別精密吸取質(zhì)量濃度為400μg·mL－1的山奈酚、槲皮素標(biāo)準(zhǔn)溶液適量，配制成含山奈酚、槲皮素均為 2.50，5.00，10.00，15.00，20.00，25.00μg·mL－1的混標(biāo)溶液。以孔徑 0.45μm 濾膜濾過(guò)，分別進(jìn)樣 10μL。在“2.1.2”項(xiàng)色譜條件測(cè)定峰面積，以對(duì)照品溶液濃度(X，μg·mL－1)為橫坐標(biāo)，峰面積(Y)為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線并進(jìn)行回歸分析，山奈酚:Y=29.85X－13.24，r=0.999 9;槲皮素:Y=43.86X－24.02，r=0.999 8。結(jié)果表明:山奈酚及槲皮素均在2.500～25.000μg·mL－1范圍內(nèi)呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系。

圖2 槲皮素對(duì)照品溶液(A)和陰地蕨供試品溶液(B)質(zhì)譜圖Fig.2 ESI-MS spectrum of quercetin standard solution(A)and Botrychium ternatum solution(B)

2.7 精密度實(shí)驗(yàn) 將質(zhì)量濃度均為20.00μg·mL－1山奈酚、槲皮素混合對(duì)照品溶液按“2.1.2”項(xiàng)項(xiàng)色譜條件連續(xù)進(jìn)樣5次進(jìn)行分析，以峰面積計(jì)算山奈酚及槲皮素的RSD分別為0.98%，0.79%，表明方法精密度良好。

2.8 重復(fù)性實(shí)驗(yàn) 取同一批樣品(批號(hào):20140116)5份，按“2.3”項(xiàng)方法制備溶液，按“2.1.2”項(xiàng)色譜條件進(jìn)樣分析，測(cè)定峰面積，計(jì)算山奈酚及槲皮素的平均質(zhì)量分?jǐn)?shù)，其RSD分別為1.53%和1.82%，表明方法重復(fù)性良好。

2.9 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn) 分別在0，2，4，8 h將一供試品溶液按“2.1.2”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行分析，測(cè)定色譜峰面積，計(jì)算山奈酚及槲皮素的RSD分別為2.36%，2.19%，表明供試品溶液在8 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.10 加樣回收率實(shí)驗(yàn) ①精密稱取5份已知含量的樣品(批號(hào):20140116)各0.250 g，分別精密加入山奈酚標(biāo)準(zhǔn)溶液適量;②精密稱取5份已知含量的樣品(批號(hào):20140116)各0.125 g，分別精密加入槲皮素標(biāo)準(zhǔn)溶液適量。分別按“2.3”項(xiàng)下方法制備溶液，按“2.1.2”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣分析，測(cè)定峰面積，計(jì)算各成分的量及加樣回收率，結(jié)果山奈酚平均加樣回收率98.34%，RSD=1.89%;槲皮素平均加樣回收率98.68%，RSD=2.70%，見(jiàn)表 1。

1.槲皮素;2.山奈酚圖3 混合對(duì)照品(A)和陰地蕨(B)的高效液相色譜圖1.quercetin;2.kaempferolFig.3 HPLC chromatograms of mixed reference substances(A)and Botrychium ternatum(B)

表1 山奈酚和槲皮素加樣回收測(cè)定結(jié)果Tab.1 Results of recovery tests on on kaempferol and quercetin n=5

2.11 樣品測(cè)定 精密稱取3批陰地蕨樣品各3份，每份0.250 g，按“2.3”項(xiàng)下方法制備溶液，按“2.1.2”項(xiàng)色譜條件分別進(jìn)行分析，測(cè)定峰面積，計(jì)算各成分的量，結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 陰地蕨中山奈酚、槲皮素的測(cè)定結(jié)果Tab.2 Results of content determination on kaempferol and quercetin in Botrychium ternatum n=3

3 討論

研究證實(shí)，陰地蕨有顯著的抑制癌細(xì)胞增殖及轉(zhuǎn)移的作用［12］，但迄今為止，其資源還未得到有效的開(kāi)發(fā)利用，對(duì)其化學(xué)成分的研究報(bào)道也很稀少。筆者在本實(shí)驗(yàn)中用HPLC-MS/MS法對(duì)陰地蕨中山奈酚及槲皮素進(jìn)行鑒定并測(cè)定二者的含量，首次報(bào)道陰地蕨中的山奈酚成分，實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)一步證實(shí)陰地蕨抗菌、抗炎、止咳等功效的物質(zhì)基礎(chǔ)，可以為該民族藥的藥用價(jià)值開(kāi)發(fā)及擴(kuò)大資源利用提供一定的科學(xué)依據(jù)。

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