乙氧氟草醚對泥鰍肝細胞的毒性研究

夏曉華 夏曉培 董慧 等

摘要：以泥鰍（Misgurnus anguillicaudatus）為試驗對象，通過急性毒性試驗、單細胞凝膠電泳技術（彗星試驗）、酶活測定來檢測除草劑乙氧氟草醚對泥鰍肝細胞的毒性效應，從而研究了乙氧氟草醚對水生生物的毒性。結(jié)果表明，乙氧氟草醚對泥鰍的24、48、72、96 h的半數(shù)致死質(zhì)量濃度（LC50）分別為36.67、32.87、28.38、27.40 mg/L，安全濃度為7.92 mg/L。彗星試驗各試驗組中，濃度越高，細胞的拖尾越嚴重，呈現(xiàn)明顯的時間-劑量效應。低濃度乙氧氟草醚處理（8、12 mg/L）對泥鰍肝臟谷丙轉(zhuǎn)氨酶（GPT）和谷草轉(zhuǎn)氨酶（GOT）具有誘導作用，而長時間（6 d）的高濃度乙氧氟草醚處理（16、20 mg/L）則具有抑制作用，試驗組與對照組存在顯著或極顯著差異。

關鍵詞：乙氧氟草醚；泥鰍（Misgurnus anguillicaudatus）；半致死質(zhì)量濃度；單細胞凝膠電泳技術；GPT；GOT

中圖分類號：S948 文獻標識碼：A 文章編號：0439-8114（2015）20-5092-04

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2015.20.042

Toxic Effects of Oxyfluorfen on Liver of Misgurnus anguillicaudatus

XIA Xiao-hua，XIA Xiao-pei，DONG Hui，LU Chen-hua，XU Pei-fang，DU Qi-yan，CHANG Zhong-jie

（College of Life Sciences， Henan Normal University， Xinxiang 453007， Henan， China）

Abstract： Loach as test object， by acute toxicity test， single cell gel electrophoresis （cometassay）， enzyme activity assay to detectd oxyfluorfen fluorine grass ethers of loach liver cell toxicity effect. The toxicity of oxyfluorfen to aquatic organisms were studied. The results showed that， half of oxyfluorfen on the 24，48，72，96 h lethal concentration（LC50） were 36.67，32.87，28.38， 27.40 mg/L， safe concentration for 7.92 mg/L. The experimental group， the higher concentration， the cell smearing more serious， also presents the obvious time dose effect. The activities of GPT and GOT in liver were induced by the lower concentration treatments（8，12 mg/L）， but restrained by the longer time（6 d） and higher concentration treatments （16，20 mg/L）. Experimental groups were significant difference or very significant difference in comparison with the control group. The results showed that the oxyfluorfen has a strong toxicity to Misgurnus anguillicaudatus.

Key words： oxyfluorfen； Misgurnus anguillicaudatus； lethal concentration；comet assay； GPT； GOT

泥鰍（Misgurnus anguillicaudatus），隸屬鰍科花鰍亞科泥鰍屬，是一種抗污能力較強的淡水魚[1]，其肉質(zhì)佳、味道美，是老百姓餐桌上一道不可缺少的大餐。泥鰍可以適應多種混合養(yǎng)殖，最為常見的泥鰍養(yǎng)殖模式為稻鰍共作的嵌套種養(yǎng)模式。稻田間噴灑的農(nóng)藥，一部分作用于農(nóng)作物水稻上，一部分散落在下層水體環(huán)境中影響嵌套養(yǎng)殖的泥鰍，而且殘留的除草劑還有可能通過食物鏈進入人和牲畜的體內(nèi)，不易降解，最終通過逐漸積累對人畜的機體造成損害。

乙氧氟草醚（Oxyfluorfen）又名氟硝草醚、果爾、割草醚，化學分子式為C15H11CF3NO4，含氟二苯醚類[2]，是一種高效的、水旱田兼用的、廣譜的、苗前苗后觸殺型除草劑[3]。近年來，許多專家學者對乙氧氟草醚的分析方法、藥效試驗、殘留動態(tài)等開展了較為系統(tǒng)的研究[4-6]，而有關稻鰍嵌套種養(yǎng)過程中，其對泥鰍的毒性研究尚未見報道。單細胞凝膠電泳技術又稱為“彗星電泳”，是一種在單個細胞水平上檢測真核細胞DNA損傷與修復的方法，具有靈敏度高、迅速、簡便、經(jīng)濟及所需細胞少等優(yōu)點[7]。谷草轉(zhuǎn)氨酶（簡稱GOT、AST）和谷丙轉(zhuǎn)氨酶（簡稱GPT、ALT）是臨床上檢驗肝功能是否正常的重要指標，可用來判斷肝臟是否受到損害。本研究通過研究乙氧氟草醚對泥鰍肝細胞DNA損傷以及對其肝臟GPT和GOT活性的影響，旨在為乙氧氟草醚的合理使用提供科學依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

泥鰍100尾，購自新鄉(xiāng)市海鴻農(nóng)貿(mào)市場，體量13～16 g/尾，體長9～12 cm。試驗前用曝氣3 d的自來水馴養(yǎng)一周，馴養(yǎng)期間死亡率小于2%，挑選健康活潑和體表無損的個體作為試驗材料。試驗前1 d停止喂食，進行饑餓處理，試驗期間不投喂。曝氣自來水48 h以上，水溫11～23 ℃，溶解氧5～6 mg/L，pH 6.9～7.2。

乙氧氟草醚制劑購自新鄉(xiāng)市東海農(nóng)資市場。

1.2 試驗方法

1.2.1 急性毒性試驗 通過預試驗確定最大零致死質(zhì)量濃度和最小全致死質(zhì)量濃度。本研究設20.83、25.00、30.00、36.00、43.20 mg/L 5個等比濃度梯度試驗組和1個空白對照組，每組投放10尾泥鰍，每24 h更換1次等體積等濃度的乙氧氟草醚，試驗開始后12 h連續(xù)觀察，記錄其中毒癥狀以及24、48、72及96 h的死亡數(shù)量。試驗重復3次。

采用改進寇氏法（Karber）[8，9]計算乙氧氟草醚對泥鰍的半數(shù)致死質(zhì)量濃度LC50，其計算公式為LgLC50=Xm-i（∑p-0.5），安全濃度SC的計算公式：SC=LC50（48 h）×0.3/[LC50（24 h）/LC50（48 h）]2。

式中，Xm為死亡組最大劑量的對數(shù)；i為相鄰組濃度對數(shù)之差；p為各組的死亡率，∑p為各組死亡率的總和。

1.2.2 彗星試驗 在急性試驗結(jié)果基礎上，在安全濃度和最大零致死質(zhì)量濃度之間，設8、12、16、20 mg/L 4個處理組和1個空白對照組，每組隨機投放20尾泥鰍，每24 h更換1次等體積等濃度的乙氧氟草醚。分別設置2、4、6 d 3個時間區(qū)段組，每次每個時間每個濃度取2尾制備肝細胞懸液，試驗步驟參照陳忻等[10]的方法進行。試驗重復3次。

1.2.3 酶活測定 處理組與彗星試驗相同。試驗開始后每組每2 d隨機取2尾泥鰍，取出肝臟，各按1∶99加入魚用生理鹽水進行研磨，制成1%勻漿。將勻漿移入2個離心管中， 2 500 r/min離心10 min，用于谷丙轉(zhuǎn)氨酶（GPT）活力和谷草轉(zhuǎn)氨酶（GOT）活力的測定，然后計算泥鰍GPT、GOT活力的平均值。GPT和GOT勻漿活力分別用谷丙轉(zhuǎn)氨酶試劑盒（賴氏法）和谷草轉(zhuǎn)氨酶試劑盒（賴氏法）測定，用BCA法測定組織蛋白質(zhì)含量。試驗重復3次。

1.2.4 數(shù)據(jù)處理 單細胞凝膠電泳試驗運用CASP彗星圖像分析軟件進行分析，得出彗星尾部DNA百分含量（Tail DNA）、彗星尾部長度（Tail length，TL）、Olive尾矩（Olive tail moment，OTM）3項指標數(shù)據(jù)，導入統(tǒng)計分析軟件SPSS進行統(tǒng)計分析。

肝細胞酶活試驗所有試驗數(shù)據(jù)均采用Excel 2003軟件進行數(shù)據(jù)的處理與分析，并用SPSS 13.0軟件進行差異性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 乙氧氟草醚對泥鰍的急性毒性試驗結(jié)果

不同濃度的乙氧氟草醚對泥鰍活動的影響有明顯的差別。在低劑量組（20.83、25.00 mg/L）中，泥鰍基本上沒有出現(xiàn)異常的行為變化。但在高劑量組（36.00、43.20 mg/L）中，泥鰍不斷地快速游動，有時狂游躍出水面，最終逐漸失去游動能力，翻白肚直至死亡。不同質(zhì)量濃度的乙氧氟草醚稀釋液對泥鰍的急性試驗結(jié)果見表1。由表1可知，乙氧氟草醚對泥鰍24、48、72、96 h的半數(shù)致死質(zhì)量濃度（LC50）分別為36.67、32.87、28.38、27.40 mg/L，安全質(zhì)量濃度為7.92 mg/L。

2.2 乙氧氟草醚對泥鰍肝細胞DNA損傷試驗結(jié)果

單細胞凝膠電泳結(jié)果表明，對照組細胞核均呈現(xiàn)圓球形，彗星頭部DNA致密且集中。隨著濃度的增加，各處理組細胞核呈現(xiàn)彗星樣，彗星頭部逐漸縮小，發(fā)散程度增加（圖1）。

利用彗星圖像分析軟件CASP及統(tǒng)計軟件SPSS對各濃度組彗尾DNA所占百分含量（Tail DNA）、尾長（TL）和Olive尾距（OTM）3個指標進行測量，結(jié)果見表2。在2 d肝細胞組中，泥鰍的彗尾DNA含量、尾矩、尾長均隨著濃度的增加而增大，與對照組相比差異極顯著（P<0.01），并在20 mg/L時達到峰值。肝細胞彗尾DNA含量為（22.54±3.67）%，尾長為（187.00±22.63）%，尾矩為（21.45±5.12）%，表明在處理時間為2 d的情況下，隨著乙氧氟草醚濃度的增加，對泥鰍細胞的DNA損傷也越嚴重。在4 d肝細胞組中，試驗結(jié)果所呈現(xiàn)的趨勢大致與2 d組相同，且3項指標在20 mg/L中同樣也達到峰值，與對照組相比差異極顯著（P<0.01），并且較2 d組而言，3項指標數(shù)值都有了大幅度的提升，表明乙氧氟草醚對泥鰍肝細胞DNA的損傷有時間劑量效應，達到峰值時肝細胞彗尾DNA含量為（31.71±1.95）%，尾長為（231.00±9.90）%，尾矩為（43.24±3.14）%。

2.3 乙氧氟草醚對泥鰍肝細胞酶活的影響試驗結(jié)果

乙氧氟草醚處理后對泥鰍肝臟GPT及GOT活力的影響試驗結(jié)果見表3。不同濃度乙氧氟草醚處理2 d和4 d，均導致泥鰍肝臟中的GPT與GOT活性升高，20 mg/L乙氧氟草醚處理4 d后均達到最大，分別為40.20、46.04 U/g。處理6 d后，GPT與GOT活性均有所下降。

3 小結(jié)與討論

本研究以泥鰍為試驗材料，參照2009年新版《國際危規(guī)》分類標準，該標準將化學物質(zhì)對魚類的毒性分為3個等級[11]，當96 h的LC50大于10 mg/L時屬于低毒。本試驗中乙氧氟草醚對泥鰍的96 h的半致死質(zhì)量濃度為27.40 mg/L，表明乙氧氟草醚對泥鰍的毒性屬于低毒。

單細胞凝膠電泳與經(jīng)典的染色體畸變、微核相比，適用于研究低劑量及高劑量下的生物效應、活細胞及死亡細胞DNA的檢測，非常適用于評價受試物的遺傳毒性。本試驗結(jié)果表明，隨著乙氧氟草醚濃度的增加和處理時間的延長，彗尾DNA、尾長、尾矩均逐漸增大，在處理時間為6 d，濃度為16 mg/L時達到最大[彗尾DNA為（46.21±1.40）%，尾長為（314.00±25.46）%，尾矩為（124.62±10.01）%]，說明此時的DNA損傷最嚴重，在20 mg/L濃度組中，3個指標均出現(xiàn)一定程度地下降，說明此時DNA的損傷程度有所緩解。推測可能的原因有兩種：一種是與DNA自身的修復機制有關，DNA受到嚴重損傷時，啟動SOS修復機制，使DNA的損傷程度減輕，使得拖尾現(xiàn)象不明顯；二是高濃度、長時間處理以后，DNA受損傷過大以致彗星電泳時DNA片段分散太開，在鏡檢時形成的彗星尾部熒光信號太弱，故呈現(xiàn)出測量值下降的表象[12]。

GPT和GOT是肝臟中活性最強的兩種轉(zhuǎn)氨酶，在機體蛋白質(zhì)代謝中起著重要的作用，其活性變化與肝細胞的炎癥、變性和壞死等密切相關[13]，是肝細胞受損最靈敏的指標。肝臟是重要的解毒器官，能夠?qū)⒂卸镜奈镔|(zhì)最終轉(zhuǎn)換為尿素排出體外。本研究測定了不同濃度乙氧氟草醚在不同時間處理下，泥鰍肝臟中GPT和GOT的活性變化。結(jié)果表明，在低濃度短時間的處理條件下，肝臟GPT和GOT活性均較對照組有了明顯的升高，說明乙氧氟草醚在較低濃度下短時間內(nèi)誘導GPT和GOT活性顯著升高，加強機體對毒物的代謝；但是在處理時間延長為6 d的較高濃度組中（16、20 mg/L），這2種酶的活性開始降低，甚至低于空白對照，表現(xiàn)出非常明顯的抑制效應。這可能是由于長期處于脅迫作用下，泥鰍肝細胞受到一定程度的損傷，其功能開始下降。

綜上所述，本研究表明一定濃度的乙氧氟草醚能夠造成泥鰍肝細胞DNA的損傷，并且影響肝臟轉(zhuǎn)氨酶的活性，為在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中合理使用除草劑，提高泥鰍產(chǎn)量，更好地發(fā)揮嵌套養(yǎng)殖的優(yōu)勢提供依據(jù)。

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