在無殺蟲劑選擇下家蠅擬除蟲菊酯抗性等位基因頻率的變化*

潘 婧 周云輝 李 梅 李保同 邱星輝**

(1．中國科學(xué)院動物研究所農(nóng)業(yè)蟲害鼠害綜合治理研究國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京100101；2.中國科學(xué)院大學(xué)， 北京100049；3.江西農(nóng)業(yè)大學(xué)，南昌 330045)

家蠅Muscadomestica是一種重要的衛(wèi)生害蟲，可以傳播100多種人和動物疾病(Greenber, 1965)。 家蠅的騷擾還可以降低禽類的產(chǎn)蛋量和家畜的飼料轉(zhuǎn)化率 (Scottetal., 2009)。控制家蠅主要依賴化學(xué)殺蟲劑，各種類型的殺蟲劑如傳統(tǒng)的有機(jī)磷、氨基甲酸酯、擬除蟲菊酯以及相對新的吡蟲啉等都被用于家蠅的化學(xué)防治。擬除蟲菊酯類殺蟲劑因其具有低毒和高效等特點(diǎn)，被廣泛使用，由此帶來了家蠅對其抗性的產(chǎn)生和擴(kuò)散，家蠅抗藥性的事例有很多的報(bào)道 (Wangetal., 2012; Gaoetal., 2012; Scottetal., 2013)。

家蠅對擬除蟲菊酯的抗性已知主要有兩類機(jī)制，即靶標(biāo)(鈉離子通道)不敏感性和細(xì)胞色素P450介導(dǎo)的代謝解毒作用增強(qiáng)的代謝抗性(Scottetal., 2004)。至今已鑒定出3種鈉離子通道抗性等位基因，包括kdr(1014F， F) (Williamsonetal., 1996),kdr-his(1014H, H) (Liuetal., 2002) andsuper-kdr(918T + 1014F) (Williamsonetal., 1996, Qiuetal., 2007; Rinkevichetal., 2007)。也發(fā)現(xiàn)一個或多個細(xì)胞色素P450的過量表達(dá)與家蠅對擬除蟲菊酯類殺蟲劑抗性相關(guān)聯(lián) (Scottetal., 2004; Gaoetal., 2012)，比如在美國的LPR和中國及美國的田間抗性家蠅種群存在CYP6D1v1 抗性基因 (Kasaietal., 2000; Seifertetal., 2002；Rinkevichetal., 2006; Gaoetal., 2012)。

通常認(rèn)為，抗藥性是適應(yīng)殺蟲劑選擇的一種進(jìn)化現(xiàn)象，在無該殺蟲劑的環(huán)境下抗藥性昆蟲種群通常具有一定的適合度代價(jià)(Kliotetal., 2012)。盡管這一假設(shè)得到了不少事例的支持，但也有研究表明抗性昆蟲并不表現(xiàn)適合度不利 ( McCartetal., 2005; Crowderetal., 2009; Basitetal., 2012)。這些前期的研究表明，與抗性相關(guān)聯(lián)的適合度可能因抗性機(jī)制或抗性種群的不同而不同。有關(guān)家蠅鈉離子通道突變以及CYP6D1v1 相關(guān)的抗藥性是否存在適合度代價(jià)還不清楚。本研究以從北京采集的家蠅為研究系統(tǒng)，通過在實(shí)驗(yàn)室不接觸殺蟲劑的條件下，連續(xù)飼養(yǎng)和監(jiān)測其抗性等位基因頻率的變化，依此推測抗性等位基因是否存在適合度代價(jià)。

1 材料與方法

1.1 家蠅種群

在2010年10月，于北京奧林匹克公園的垃圾筒用網(wǎng)捕的方法采集100多頭家蠅(親代)，帶回實(shí)驗(yàn)室建立種群(取名為BJ2010)，并以500～1 000頭的種群規(guī)模連續(xù)傳代。將每代產(chǎn)卵后的成蟲置于100% 乙醇中，保存在 -20℃ 用于個體基因型分析。對BJ2010品系家蠅的毒力測定結(jié)果顯示，相對于實(shí)驗(yàn)室敏感品系，BJ2010對氯菊酯和溴氰菊酯的抗性倍數(shù)分別為25和167倍。

1.2 鈉離子通道基因和CYP6D1基因的基因分型

在保存的親代(P)、子1代(F1)、子6代(F6)、子10代(F10)、子15代(F15)、子20代(F20)、子25代(F25)成蟲樣品中，分別隨機(jī)抽取30頭以上個體的頭胸部，單頭提取其基因組DNA(Rinkevichetal.，2006)。 CYP6D1的基因型采用PCR-RFLP 的方法(Rinkevichetal.，2006)確定。 鈉離子通道基因型親代樣品采用測序的方法(Rinkevichetal.,2006)，其他代樣品采用PCR-RFLP 方法確定(Qiuetal., 2012 )。

2 結(jié)果

2.1 BJ2010親代樣品擬除蟲菊酯殺蟲劑抗性等位基因種類與頻率

對田間采集的家蠅樣品中，檢測到了細(xì)胞色素 P450 CYP6D1基因的抗性和敏感等位基因。 抗性等位基因(CYP6D1v1, R)的5’側(cè)區(qū)包含15 bp的插入片段，其頻率為0.06 (圖1), 不包含該特征15 bp的插入片段的CYP6D1基因?yàn)槊舾械任换?S)，頻率高達(dá)0.94。 三種可能的基因型(SS, SR, RR)在樣品中均存在，敏感純合、雜合子和抗性純合子的頻率分別是0.91、 0.07 和0.02(圖2)。

圖1 家蠅種群CYP6D1等位基因頻率變化Fig.1 Changes in the frequencies of CYP6D1 alleles over 25 generations under laboratory conditions

圖2 家蠅種群CYP6D1基因型頻率變化Fig.2 Changes in the frequencies of CYP6D1 genotypes over 25 generations under laboratory conditions

從樣品中鑒定了3個鈉離子通道等位基因，包括2個抗性等位基因kdr和kdr-his和1個敏感等位基因(1014L，L)，未檢測到文獻(xiàn)報(bào)道的super-kdr，其中，敏感等位基因頻率最高(0.81)，kdr抗性等位基因頻率最低(0.07) (圖3)。 同樣，所有的6種基因型個體(LL, FF, HH, FL, HL, HF)在種群中都存在(圖4)，其中最常見的基因型是敏感純合子(0.69), 其次是HL 雜合子(0.17) 和FL 雜合子(0.06)， 另外三種基因型(HH, FF, HF) 的家蠅個體很罕見(頻率在0.02～0.03之間)。

2.2 無殺蟲劑選擇下的家蠅種群對擬除蟲菊酯殺蟲劑抗性等位基因頻率的變化

在無殺蟲劑條件下，25代內(nèi)的觀察，CYP6D1 抗性等位基因頻率在0.02 至 0.13之間變動, 敏感等位基因頻率變化于0.87 和 0.97 之間(圖1)，CYP6D1不同基因型個體頻率的變化也不顯著，敏感純合個體、雜合個體以及抗性純合個體的變化范圍分別是0.80～0.96、 0.04～0.17 和 0～0.05 (圖2)。

在實(shí)驗(yàn)室正常繁殖25代內(nèi)，家蠅種群鈉離子通道基因的敏感等位基因1014L 頻率在各代中保持最高，1014H 等位基因則在0.09 和0.26之間波動, 而1014F 在波動中從起始的0.07 降到0.01(圖3)。 總體上看，敏感純合個體 (LL) 保持著高頻率 (0.56～0.82), HL 雜合基因型個體頻率在0.17 與 0.37之間，但抗性基因型 (FF純合, FH 雜合和HH純合) 個體頻率一直處于低水平 (低于0.1), FF純合、FH 雜合和HH純合個體分別自F1、 F15 和 F20代之后檢測不到(圖4)。

圖3 家蠅種群鈉離子通道等位基因頻率變化Fig.3 Changes in the frequencies of Vssc alleles over 25 generations under laboratory conditions

圖4 家蠅種群鈉離子通道基因型頻率變化Fig.4 Changes in the frequencies of six Vssc genotypes over 25 generations under laboratory conditions

3 討論

家蠅對擬除蟲菊酯的抗藥性受多基因的控制，可以通過基因的位點(diǎn)突變(如鈉離子通道基因Vssc)，或更復(fù)雜的分子事情如基因的表達(dá)調(diào)控 (如CYP6D1) 來實(shí)現(xiàn)。 擬除蟲菊酯殺蟲劑用于公共衛(wèi)生領(lǐng)域始于上世紀(jì)70年代末，至今有30多年的用藥歷史，家蠅產(chǎn)生抗藥性并不令人奇怪。通過對 98 個家蠅個體的基因型檢測， 發(fā)現(xiàn)了kdr、kdr-his和CYP6D1v1 抗性等位基因的存在。kdr-his的基因頻率(0.12) 高于kdr(0.07)，這與我們先前對中國采集的家蠅的研究結(jié)果一致(Wangetal., 2012)。值得注意的是，無論是鈉離子通道基因，還是CYP6D1基因，敏感等位基因頻率在本研究的種群中的頻率很高。如敏感的鈉離子通道基因(1014L)的頻率在0.81, 高于從美國和丹麥采集的家蠅(Rinkevichetal., 2006; Huangetal., 2004; Scottetal., 2013), 但接近土爾其家蠅種群(0.72) (Taskinetal., 2011)。北京種群CYP6D1 敏感等位基因(S)頻率高達(dá)0.94， 比報(bào)道的采自美國、土爾其等地的家蠅種群高很多(Rinkevichetal., 2006; Rinkevichetal., 2007; Taskinetal., 2011; Scottetal., 2013), 但在我國家蠅種群已報(bào)道的頻率值范圍內(nèi)(Wangetal., 2012)。BJ2010種群具有對擬除蟲菊酯的抗性，但其鈉離子通道抗性等位基因以及CYP6D1v1抗性等位基因的的頻率都很低，暗示該種群還存在其他抗性機(jī)制。

通常認(rèn)為，抗藥性是昆蟲適應(yīng)殺蟲劑選擇下的結(jié)果，由此推測抗性種群相對于敏感種群在沒有殺蟲劑的環(huán)境下具有更低的適合度 (Roushetal., 1990)。 如果該推測正確，從抗性遺傳的角度則抗性等位基因頻率在無殺蟲劑的條件下會隨時間而下降。本研究的結(jié)果顯示CYP6D1 的抗性等位基因頻率在25代傳代范圍內(nèi)變化非常之小，提示CYP6D1v1 并不表現(xiàn)出適合度代價(jià)，這一結(jié)果與美國的一個研究結(jié)果相一致(Rinkevichetal., 2013)，也部分解釋了CYP6D1v1 在全球廣泛存在的原因 (Rinkevichetal., 2006; Taskinetal., 2011; Wangetal., 2012)。與此類似，鈉離子通道1014H(kdr-his)抗性等位基因頻率變化在25代期間的變化也很小，表明在無殺蟲劑的實(shí)驗(yàn)室條件下，相對種群中存在的其他等位基因，鈉離子通道1014H等位基因也不存在適合度代價(jià)。

早期的一個研究表明攜帶1014F 突變的抗性家蠅與敏感家蠅相比表現(xiàn)出溫度偏好性的差異的(Fosteretal., 2003)，這種差異是否代表具有適合度代價(jià)現(xiàn)在還不清楚。 通過對種群中1014F 頻率隨時間的動態(tài)變化發(fā)現(xiàn)，1014F 頻率有所下降(從0.07到0.01)，但由于1014F 的起始頻率非常低，其頻率的下降很有可能是遺傳漂變的結(jié)果。而不是其存在適合度劣勢，這一推論還需要進(jìn)一步的研究數(shù)據(jù)。

綜上，通過對家蠅已知的抗性等位基因頻率在種群中的頻率的長期監(jiān)測，發(fā)現(xiàn)在無殺蟲劑的條件下擬除蟲菊酯抗性等位基因頻率并不下降，說明攜帶抗性等位基因kdr-his或CYP6D1v1的家蠅不表現(xiàn)適合度不利。抗性等位基因頻率的動態(tài)變化結(jié)果表明，抗性基因一旦在種群被選擇出來，在無殺蟲劑的選擇下達(dá)到平衡，很難再從群體中消失。這一研究結(jié)果與王學(xué)軍等(2008)根據(jù)毒力測定數(shù)據(jù)而得出的結(jié)論相一致。這也提示，換用殺蟲劑對抗性家蠅的防治可能有效，而輪用以往常用的殺蟲劑則存在風(fēng)險(xiǎn)。