蠟樣芽胞桿菌蛋白酶的克隆及在枯草芽胞桿菌系統(tǒng)中的高效表達(dá)

蠟樣芽胞桿菌蛋白酶的克隆及在枯草芽胞桿菌系統(tǒng)中的高效表達(dá)

承龍飛，朱富成，劉可可，何冰芳
（南京工業(yè)大學(xué) 生物與制藥工程學(xué)院，江蘇 南京 211800）

基于來(lái)源于Bacillus cereus WQ9-2的耐有機(jī)溶劑蛋白酶WQ的液相色譜-雙質(zhì)譜（LC-MS-MS）分析結(jié)果，設(shè)計(jì)引物，克隆耐有機(jī)溶劑蛋白酶WQ的基因，測(cè)序分析表明該蛋白酶的開(kāi)放閱讀框（ORF）大小為1 701 bp，編碼566個(gè)氨基酸，其中含有信號(hào)肽（28個(gè)氨基酸）、前肽（220個(gè)氨基酸）及成熟肽序列（含954 bp編碼318個(gè)氨基酸），相對(duì)分子質(zhì)量約為3.7×104。將不帶自身信號(hào)肽的蛋白酶基因aprWQ插入穿梭質(zhì)粒pMA5中，構(gòu)建了表達(dá)載體pMA5/aprWQ。該表達(dá)載體導(dǎo)入枯草芽胞桿菌WB600中獲得陽(yáng)性重組子WB600-pMA5/aprWQ，通過(guò)優(yōu)化培養(yǎng)基成分以及培養(yǎng)條件，重組子發(fā)酵產(chǎn)蛋白酶體積酶活達(dá)到17 400 U/mL，約為高產(chǎn)野生菌產(chǎn)酶量的5倍。重組蛋白酶在多種有機(jī)溶劑（體積分?jǐn)?shù)為50%）中表現(xiàn)出了良好的耐受性，驗(yàn)證了重組菌表達(dá)的蛋白酶與來(lái)源于B.cereus WQ9-2的耐有機(jī)溶劑蛋白酶性質(zhì)一致，該耐有機(jī)溶劑蛋白酶的高效表達(dá)為進(jìn)一步發(fā)揮其高效生物催化作用等實(shí)際應(yīng)用奠定了基礎(chǔ)。

耐有機(jī)溶劑蛋白酶；枯草芽胞桿菌；高表達(dá)；發(fā)酵優(yōu)化

蛋白酶廣泛應(yīng)用于食品、制藥、紡織等領(lǐng)域，在世界酶類(lèi)銷(xiāo)售市場(chǎng)中占有主要地位［1-2］。蛋白酶為典型的水解酶，通常在水相中催化肽鏈水解反應(yīng)，而在非水相中，往往其逆反應(yīng)占主導(dǎo)地位，能夠催化肽鏈的合成［3-4］。利用蛋白酶進(jìn)行有機(jī)相催化反應(yīng)有諸多優(yōu)勢(shì)：使水解反應(yīng)的熱力學(xué)平衡轉(zhuǎn)向合成反應(yīng)，抑制不良反應(yīng)的進(jìn)行，提高底物溶解度和改變底物特異性等。然而，大多數(shù)蛋白酶在高濃度親水性有機(jī)溶劑中易于失活、酶活力低、穩(wěn)定性差，限制了蛋白酶在有機(jī)相催化中的應(yīng)用［5-6］。耐有機(jī)溶劑蛋白酶能耐受高濃度的親水性有機(jī)溶劑，可應(yīng)用于催化肽合成以及手性藥物拆分等反應(yīng)［7］。

近年來(lái)，耐有機(jī)溶劑蛋白酶不斷地被發(fā)現(xiàn)和開(kāi)發(fā)，多數(shù)耐有機(jī)溶劑蛋白酶來(lái)自于極端微生物，并且以 Pseudomonas屬和 Bacillus屬細(xì)菌居多［8-13］。然而大多數(shù)的極端微生物產(chǎn)酶能力弱，限制了這類(lèi)高性能的耐有機(jī)溶劑蛋白酶的使用。為了進(jìn)一步開(kāi)發(fā)并拓寬這類(lèi)酶的應(yīng)用，基因工程的方法是一種有效的手段。Ogino等［14］篩選到了1株耐有機(jī)溶劑蛋白酶產(chǎn)生菌Pseudomonas aeruginosa PST-01，并在大腸桿菌宿主中對(duì)PST-01蛋白酶進(jìn)行了克隆表達(dá)，但表達(dá)的酶產(chǎn)量較低，限制了進(jìn)一步應(yīng)用。

筆者所在課題組在前期研究中篩選到1株產(chǎn)耐有機(jī)溶劑蛋白酶菌株Bacillus cereus WQ9-2［15］，該菌所產(chǎn)耐有機(jī)溶劑蛋白酶對(duì)廣泛Log P值的親水性以及疏水性有機(jī)溶劑具有很好的耐受性，該酶在有機(jī)相中能有效催化內(nèi)嗎啡肽-1［16］、內(nèi)嗎啡肽-2［17］以及水凝膠［18］等產(chǎn)物的合成。盡管野生型菌株所產(chǎn)蛋白酶產(chǎn)量已達(dá)到3 500 U/mL，但仍然難以滿足后續(xù)開(kāi)發(fā)應(yīng)用的需求，因此，筆者進(jìn)一步研究耐有機(jī)溶劑蛋白酶WQ的克隆及表達(dá)，以期通過(guò)優(yōu)化提高耐有機(jī)溶劑蛋白酶的產(chǎn)量，使其更有利于實(shí)際應(yīng)用與開(kāi)發(fā)。

1 材料與方法

1.1 菌株與質(zhì)粒

耐有機(jī)溶劑蛋白酶產(chǎn)生菌為 Bacillus cereus WQ9-2，由筆者所在課題組分離篩選并寄存于中國(guó)典型菌種保藏中心（保藏登記號(hào)為 CCTCC No.M2010010）?？寺∷拗鱁scherichi coli DH5α保存于筆者所在實(shí)驗(yàn)室，穿梭載體pMA5以及枯草芽胞桿菌宿主 WB600由江南大學(xué)周哲敏教授惠贈(zèng)［19］。

1.2 實(shí)驗(yàn)材料

1.2.1 培養(yǎng)基

LB培養(yǎng)基［20］（g/L）：蛋白胨 10、酵母粉 5、NaCl 10。

LB牛奶平板培養(yǎng)基：LB培養(yǎng)基中添加質(zhì)量分?jǐn)?shù)1%的脫脂奶粉以及1.5%的瓊脂粉，脫脂奶粉混懸液分開(kāi)滅菌后，按照比例混合。

Superrich改善培養(yǎng)基［21］（g/L）：酵母粉20、胰蛋白胨25、KH2PO43、MnSO40.1、酪蛋白水解物10、葡萄糖30。

培養(yǎng)基均在121℃滅菌20min，1%脫脂奶粉溶液在115℃下滅菌20min。

1.2.2 試劑以及工具酶

有機(jī)溶劑購(gòu)買(mǎi)于國(guó)藥集團(tuán)藥業(yè)股份有限公司；DNA Marker、pfu DNA聚合酶、限制性內(nèi)切酶SalⅠ、BamHⅠ、T4 DNA連接酶、質(zhì)粒提取試劑盒、膠回收試劑盒購(gòu)于寶生物工程有限公司（TaKaRa）；PCR引物由上海英駿生物技術(shù)有限公司合成；其余試劑和藥品均為進(jìn)口或國(guó)產(chǎn)分析純。

1.3 蛋白酶基因的克隆和表達(dá)載體 pMA5/ aprWQ的構(gòu)建

Bacillus cereus WQ9-2所產(chǎn)蛋白酶分離純化后，經(jīng)SDS-PAGE分析，切下所示蛋白條帶送至國(guó)家醫(yī)學(xué)分析中心進(jìn)行氨基酸測(cè)序，并進(jìn)行液相色譜-雙質(zhì)譜（LC-MS-MS）分析，通過(guò)序列比對(duì)，參考相似度最高的蛋白酶的氨基酸序列設(shè)計(jì)擴(kuò)增引物，并經(jīng)過(guò)測(cè)序確定了該蛋白酶的基因aprWQ的序列［22］。

筆者采用載體pMA5自帶信號(hào)肽序列，因此去除蛋白酶基因自帶信號(hào)肽，表達(dá)引物分別引入SalI和BamHI酶切位點(diǎn)（下劃線部分）：F：5′-GGGGTCGACTCTAAAAATGTTCTCTCT-3′；R：5′-GGGGGGATCCTTAGTTTATACCAACA-3′?？寺‘a(chǎn)物aprWQ基因經(jīng)兩酶切割后插入相同酶切的載體pMA5中，經(jīng) T4連接酶連接后得到表達(dá)載體pMA5/aprWQ。最后，重組質(zhì)粒pMA5/aprWQ經(jīng)雙酶切驗(yàn)證陽(yáng)性克隆。

1.4 重組菌WB600-pMA5/aprWQ的構(gòu)建

將重組質(zhì)粒pMA5/aprWQ導(dǎo)入枯草芽胞桿菌WB600感受態(tài)中，涂布于含50 μg/mL的卡那霉素LB牛奶平板培養(yǎng)基，挑取周邊有顯著透明圈的轉(zhuǎn)化子，提取質(zhì)粒 pMA5/aprWQ送至公司進(jìn)行測(cè)序驗(yàn)證。

1.5 蛋白酶WQ在重組菌中的表達(dá)以及表達(dá)條件的優(yōu)化

將重組菌與含空質(zhì)粒pMA5的WB600菌株接入含50 μg/mL的卡那霉素的LB培養(yǎng)基中，在37℃、180r/min條件下過(guò)夜培養(yǎng)。以2%的接種量接入50mL含50 μg/mL的卡那霉素的Superrich改善培養(yǎng)基中，于37℃、180r/min條件下培養(yǎng)，每24 h取樣1次測(cè)蛋白酶酶活以及菌體生物量（OD660）。為了進(jìn)一步提高重組菌的產(chǎn)酶能力，考察培養(yǎng)基的不同初始pH、培養(yǎng)溫度以及培養(yǎng)基成分對(duì)表達(dá)酶活的影響。

1）蛋白酶活力測(cè)定 參照文獻(xiàn)［23］方法。酶活定義：在40℃、pH8.0條件下，每分鐘催化酪蛋白底物水解產(chǎn)生1 μg酪氨酸所需要的酶量為1個(gè)酶活單位，即1 U。

2）相對(duì)酶活 在發(fā)酵優(yōu)化過(guò)程中，以相同因素下每次發(fā)酵最高的酶活力為100%，其他發(fā)酵情況下酶活與最高酶活的比例。

1.6 蛋白酶有機(jī)溶劑耐受性的檢測(cè)

將酶液加入到等體積的有機(jī)溶劑中，親水性有機(jī)溶劑選取二甲基亞砜（DMSO）、二甲基甲酰胺（DMF）和乙醇等，疏水性有機(jī)溶劑選取環(huán)己烷、甲苯等，對(duì)照組為無(wú)菌水，在37℃、180r/min條件下振蕩24 h后，檢測(cè)蛋白酶的殘余活力。

2 結(jié)果與討論

2.1 目的蛋白酶基因的克隆

蛋白酶WQ9-2經(jīng)水解后的多肽片段經(jīng)LC/ MS/MS分析獲得部分氨基酸序列，通過(guò)序列比對(duì)，發(fā)現(xiàn)蛋白酶WQ9-2與Bacillus cereus分泌的中性蛋白酶（gi|76364030）的氨基酸序列具有最高的相似性，疊合片段為SLNTTLSGSSYYLQDNTRGATIFTYDAK，NSINGAGAPLK，PDWEIGEDIYTPGK。

根據(jù)該中性蛋白酶基因序列進(jìn)行擴(kuò)增引物的設(shè)計(jì)，以本研究自行篩選的蠟樣芽胞桿菌WQ9-2的基因組為模板，對(duì)蛋白酶基因aprWQ進(jìn)行擴(kuò)增，經(jīng)測(cè)序表明擴(kuò)增產(chǎn)物編碼基因開(kāi)放閱讀框（ORF）為1 701 bp，包含信號(hào)肽、前肽序列及成熟肽3部分，編碼566個(gè)氨基酸，其中含有信號(hào)肽（28個(gè)氨基酸）、前肽（220個(gè)氨基酸）及成熟肽序列（含954 bp編碼318個(gè)氨基酸），相對(duì)分子質(zhì)量約為3.7×104，將該序列提交GenBank進(jìn)行BLAST分析，發(fā)現(xiàn)其與蠟樣芽胞桿菌Bacillus cereus ATCC14579的芽胞菌粘素基因同源性為92%。

2.2 表達(dá)載體及重組菌WB600-pMA5/aprWQ的構(gòu)建結(jié)果

企業(yè)外宣從本質(zhì)上來(lái)講屬于傳播行為，因而企業(yè)外宣文本的翻譯問(wèn)題可以納入傳播學(xué)的范疇內(nèi)展開(kāi)研究。本文從傳播學(xué)理論出發(fā)，探討企業(yè)外宣翻譯如何確保信息傳播的信度和效度。從傳播學(xué)的視角看，企業(yè)外宣翻譯應(yīng)該有所為，亦應(yīng)當(dāng)有所不為。有所為是指，在文本處理中，尤其是在詞匯和句式的選擇上，采用歸化策略，盡可能照顧西方受眾的思維特點(diǎn)和閱讀習(xí)慣。有所不為是指，在文化層面不要求全然反映源語(yǔ)的文化元素，而應(yīng)該努力避免文化誤讀，盡可能地實(shí)現(xiàn)信息的傳遞，達(dá)到預(yù)期的傳播效果。總而言之，企業(yè)外宣翻譯應(yīng)確保語(yǔ)言的動(dòng)態(tài)對(duì)等，追求不同文化間的審美共鳴和心理認(rèn)同。

去除蛋白酶WQ自帶信號(hào)肽，設(shè)計(jì)分別帶有Sal I和BamH I酶切位點(diǎn)的引物，擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)雙酶切后插入到載體pMA5中得到pMA5/aprWQ重組質(zhì)粒，其構(gòu)建圖見(jiàn)圖1。重組質(zhì)粒導(dǎo)入枯草芽胞桿菌WB600中得到重組菌WB600-pMA5/aprWQ，重組子培養(yǎng)24 h后菌落周?chē)忻黠@的透明圈，表明重組子有較高的蛋白酶活力。

圖1 重組質(zhì)粒pMA5/aprWQ的物理圖譜Fig.1 Physical map of recombinant plasmid pMA5/aprWQ

圖2 重組菌的生長(zhǎng)與產(chǎn)酶曲線Fig.2 Cell growth curves and protease production of recombinant strain

2.3 蛋白酶WQ基因表達(dá)以及表達(dá)條件優(yōu)化

重組菌WB600-pMA5/aprWQ發(fā)酵上清液蛋白酶活力以及菌體生長(zhǎng)曲線見(jiàn)圖2。由圖2可知：對(duì)照組重組菌WB600-pMA5發(fā)酵后未檢測(cè)到蛋白酶酶活，重組菌WB600-pMA5/aprWQ在發(fā)酵72 h時(shí)酶活達(dá)到3 772 U/mL，已經(jīng)超過(guò)了野生型蠟樣芽胞桿菌WQ9-2的產(chǎn)酶水平（3 500 U/mL）［15］。這表明該菌在大量表達(dá)蛋白酶后菌體量迅速下降，推測(cè)有溶融現(xiàn)象，重組菌的菌體生物量較低，表明有較大的優(yōu)化提升空間。

2.3.1 發(fā)酵碳源對(duì)重組菌產(chǎn)酶的影響

在Superrich改善培養(yǎng)基中，葡萄糖質(zhì)量濃度為30g/L，占碳源比例較大，且葡萄糖代謝較易產(chǎn)酸。因此，考察不同碳源（蔗糖、甘油、糊精、玉米粉）替代葡萄糖對(duì)發(fā)酵產(chǎn)酶的影響，結(jié)果見(jiàn)圖3。由圖3可知：使用玉米粉作為碳源時(shí)顯著促進(jìn)菌體生長(zhǎng)與產(chǎn)酶，菌體生長(zhǎng)旺盛，菌體生物量最高，此時(shí)菌體生物量約為以葡萄糖（對(duì)照）為碳源條件下的2.1倍，且酶活為對(duì)照的3.5倍。因此，選擇玉米粉作為碳源進(jìn)行后續(xù)優(yōu)化。

圖3 碳源對(duì)重組菌產(chǎn)酶的影響Fig.3 Effects of carbon sources on protease production of recombinant strain

2.3.2 發(fā)酵氮源對(duì)重組菌發(fā)酵產(chǎn)酶的影響

氮源是發(fā)酵產(chǎn)酶的關(guān)鍵因素，在Superrich改善培養(yǎng)基中，氮源加入量為10g/L，其中氮源酪蛋白水解物成本較高，考察不同氮源（棉酚蛋白、豆粕粉、豆餅粉和尿素）替代酪蛋白水解物對(duì)發(fā)酵產(chǎn)酶的影響，結(jié)果見(jiàn)圖4。由圖4可知：添加酪蛋白水解物時(shí)重組菌的產(chǎn)酶量最高，豆粕粉、豆餅粉和棉酚蛋白均有促進(jìn)菌體生長(zhǎng)的作用，但發(fā)酵液中酶產(chǎn)量較低。尿素作為無(wú)機(jī)氮源替代氮源時(shí)，菌體生長(zhǎng)較差，但是產(chǎn)酶效果與酪蛋白水解物相近，考慮到生產(chǎn)成本原因，選用無(wú)機(jī)氮源尿素替代酪蛋白水解物進(jìn)行發(fā)酵產(chǎn)酶。

圖4 氮源對(duì)重組菌產(chǎn)酶的影響Fig.4 Effects of nitrogen sources on protease production of recombinant strain

圖5 氮源比例對(duì)重組菌產(chǎn)酶的影響Fig.5 Effects of the proportion of nitrogen sources on protease production of recombinant strain

2.3.3 發(fā)酵溫度及培養(yǎng)基初始pH對(duì)重組菌發(fā)酵產(chǎn)酶的影響

圖6為發(fā)酵溫度對(duì)重組菌發(fā)酵產(chǎn)酶的影響結(jié)果。由圖6可知：重組菌在30℃下利于菌體生長(zhǎng)，但酶活較低；而在發(fā)酵溫度37℃下，重組菌發(fā)酵后產(chǎn)酶效果較好。因此，選用37℃作為培養(yǎng)條件進(jìn)行后續(xù)優(yōu)化。

圖6 溫度對(duì)重組菌產(chǎn)酶的影響Fig.6 Effects of temperatures on protease production of recombinant strain

圖7是培養(yǎng)基初始pH對(duì)重組菌發(fā)酵產(chǎn)酶的影響結(jié)果。由圖7可知：該重組菌在pH 8.0時(shí)有利于菌體生長(zhǎng)，而在初始pH 7.0、7.5、8.0及8.5條件下對(duì)重組菌的發(fā)酵產(chǎn)酶均較適宜，該培養(yǎng)基初始pH為7.4，因此可以采用不調(diào)節(jié) pH直接進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)。

圖7 初始pH對(duì)重組菌產(chǎn)酶的影響Fig.7 Effects of medium initial pH on protease production of recombinant strain

2.4 優(yōu)化后重組菌的發(fā)酵產(chǎn)酶曲線

優(yōu)化后重組菌WB600-pMA5/aprWQ的產(chǎn)酶曲線見(jiàn)圖8。由圖8可知：重組菌發(fā)酵24 h內(nèi)開(kāi)始產(chǎn)酶，到72 h時(shí)菌體快速生長(zhǎng)且達(dá)到最高產(chǎn)酶量17 400 U/mL，約為Bacillus cereus WQ9-2菌產(chǎn)酶量的5倍。與優(yōu)化前比較，產(chǎn)酶量顯著增加，為實(shí)現(xiàn)該酶的擴(kuò)大化應(yīng)用生產(chǎn)奠定了基礎(chǔ)。

圖8 重組菌在優(yōu)化培養(yǎng)基中生長(zhǎng)曲線Fig.8 Growth curves and protease production of recombinant strain in optimized medium

2.5 重組菌表達(dá)產(chǎn)物有機(jī)溶劑耐受性及 SDSPAGE分析

2.5.1 表達(dá)蛋白酶的有機(jī)溶劑耐受性

重組蛋白酶在有機(jī)溶劑中（體積分?jǐn)?shù)50%）的耐受性見(jiàn)表1。由表1可知：該重組蛋白酶在有機(jī)溶劑中顯示了很好的耐受性，親水性有機(jī)溶劑DMSO、甘油以及疏水性有機(jī)溶劑正辛烷、環(huán)己烷、己烷、甲苯對(duì)該酶有促進(jìn)作用，在上述有機(jī)溶劑中放置24 h后顯示了一定程度的激活現(xiàn)象，而親水性有機(jī)溶劑DMF和乙醇對(duì)該酶有一定的影響，重組菌表達(dá)的蛋白酶與野生菌產(chǎn)生的蛋白酶的溶劑耐受性基本一致，其微量差異可能是溶劑體系中蛋白酶的含量差異所致。

表1 表達(dá)蛋白酶WQ的有機(jī)溶劑耐受性Table 1 Tolerance in organic solvent of recombinant protease WQ

圖9 發(fā)酵上清的SDS-PAGE電泳圖譜Fig.9 SDS-PAGE analysis of recombinant strain

2.5.2 SDS-PAGE分析

取重組菌WB600-pMA5/aprWQ以及含空質(zhì)粒的WB600-pMA5（對(duì)照）的發(fā)酵上清液進(jìn)行SDS-PAGE蛋白電泳，結(jié)果見(jiàn)圖9。由圖9可知：重組菌WB600-pMA5/aprWQ發(fā)酵上清酶液在3.7× 104處有1條明顯的條帶，發(fā)酵酶液的條帶位置與前期研究中Bacillus cereus WQ9-2所分泌蛋白酶的相對(duì)分子質(zhì)量一致，說(shuō)明重組酶與野生酶成熟肽的大小一致，并且重組菌在表達(dá)過(guò)程中自行剪切前肽成為成熟的蛋白酶WQ，而對(duì)照組在3.7×104處沒(méi)有相應(yīng)條帶。以上分析進(jìn)一步驗(yàn)證了重組菌高效表達(dá)的蛋白酶，即為目標(biāo)蛋白酶WQ。

3 結(jié)論

克隆了Bacillus cereus WQ9-2的耐有機(jī)溶劑蛋白酶基因aprWQ，構(gòu)建了表達(dá)載體pMA5/aprWQ并在枯草芽胞桿菌WB600中實(shí)現(xiàn)了分泌表達(dá)，通過(guò)對(duì)重組菌WB600-pMA5/aprWQ表達(dá)條件的優(yōu)化調(diào)整了Superrich培養(yǎng)基中碳氮源及培養(yǎng)條件，在37℃下重組菌發(fā)酵產(chǎn)酶量最高可達(dá)17 400 U/mL，約為野生菌產(chǎn)酶的5倍，表明達(dá)到了高效分泌表達(dá)。有機(jī)溶劑耐受性實(shí)驗(yàn)表明蛋白酶WQ在親水性以及疏水性有機(jī)溶劑中均有良好的耐受性，與本實(shí)驗(yàn)室前期研究的野生型蛋白酶WQ耐受性基本一致。該耐有機(jī)溶劑蛋白酶的高效表達(dá)為進(jìn)一步發(fā)揮其高效生物催化作用等實(shí)際應(yīng)用奠定了基礎(chǔ)。

［1］Anwar A，Saleemuddin M.Alkaline proteases：a review［J］. Bioresour Technol，1988，64（3）：175-183.

［2］Gupta R，Beg Q K，Lorenz P.Bacterial alkaline proteases：molecular approaches and industrial applications［J］.Appl Microbiol Biotechnol，2002，59（1）：15-32.

［3］Gupta A，Khare S K.A protease stable in organic solvents from solvent tolerant strain of Pseudomonas aeruginosa［J］.Bioresour Technol，2006，97（15）：1788-1793.

［4］Kumar D，Bhalla T C.Microbial protease in peptide synthesis：approaches and applications［J］.Appl Microbiol Biotechnol，2005，68（6）：726-736.

［5］Ogino H，Ishikawa H L.Enzymes which are stable in the presence of organic solvents［J］.J Biosci Bioeng，2001，91（2）：109-116.

［6］Gupta M N，Roy I.Enzymes in organic media：forms，functions and applications［J］.Eur J Biochem，2004，271（13）：2575-2583.

［7］Bordusa F.Proteases in organic synthesis［J］.Chem Rev，2002，102（12）：4817-4868.

［8］Ikura Y，Yoshida Y，Kudo T.Physiological properties of two Pseudomonas mendocina strains which assimilate styrene in a twophase（solvent-aqueous）system under static culture conditions［J］.J Ferment Bioeng，1997，83（6）：604-607.

［9］Ogino H，Watanabe F，Yamada M，et al.Purification and characterization of organic solvent-stable protease from organic solvent-tolerant Pseudomonas aeruginosa PST-01［J］.J Biosci Bioeng，1999，87（1）：61-68.

［10］Bustard M T，Whiting S，Cowan D A，et al.Biodegradation of high concentration isopropanol by a solvent-tolerant thermophile，Bacillus pallidus［J］.Extremophiles，2002，6（4）：319-323.

［11］Sareen R，Mishra P.Purification and characterization of organic solvent stable protease from Bacillus licheniformis RSP-09-37［J］. Appl Microbiol Biotechnol，2008，79（3）：399-405.

［12］Rahman R，Mahamad S，Salleh A B，et al.A new organic solvent tolerant protease from Bacillus pumilus 115b［J］.J Ind Microbiol Biotechnol，2007，34（7）：509-517.

［13］Ghorbel B，Sellami-Kamoun A，Nasri M.Stability studies of protease from Bacillus cereus BG1［J］.Enzyme Microb Technol，2003：32（5）：513-518.

［14］Ogino H，Yokoo J，Watanabe F，et al.Cloning and sequencing of a gene of organic solvent-stable protease secreted from Pseudomonas aeruginosa PST-01 and its expression in Escherichia coli［J］. Biochem Eng J，2000，5（3）：191-200.

［15］Xu J X，Jiang M，Sun H L，et al.An organic solvent-stable protease from organic solvent-tolerant Bacillus cereus WQ9-2：purification，biochemical properties，and potential application in peptide synthesis［J］.Bioresour Technol，2010，101（20）：7991-7994.

［16］Sun H L，He B F，Xu J X，et al.Efficient chemo-enzymatic synthesis of endomorphin-1 using organic solvent stable protease to green the synthesis of peptide［J］.Green Chem，2011，13（7）：1680-1685.

［17］Xu J X，Sun H L，He X J，et al.Highly efficient synthesis of endomorphin-2 under thermodynamiccontrol catalyzed by organic solvent stable proteases with in situ product removal［J］.Bioresour Technol，2013，129：663-666.

［18］Xu J X，Zhou Z，Wu B，et al.Enzymatic formation of a novel celladhesive hydrogel based on small peptides with a laterally grafted L-3，4-dihydroxyphenylalanine group［J］.Nanoscale，2014，6（3）：1277-1280.

［19］Gao X X，Cui W J，Tian Y P，et al.Over-expression，secretion，biochemical characterization，and structure analysis of Bacillus subtilis aminopeptidase［J］.J Sci Food Agric，2013，93（11）：2810-2815.

［20］薩姆布魯克J，拉塞爾 D W.分子克隆實(shí)驗(yàn)指南［M］.2版.黃培堂，譯.北京：科學(xué)出版社，2002.

［21］何小丹，李霜，孫蓓蓓，等.地衣芽胞桿菌YP1A耐有機(jī)溶劑蛋白酶基因的克隆與功能表達(dá)［J］.生物加工過(guò)程，2009，7（6）：67-73.

［22］何冰芳，歐陽(yáng)平凱，許家興，等.一種耐有機(jī)溶劑蛋白酶產(chǎn)生菌及其所產(chǎn)耐有機(jī)溶劑蛋白酶的基因和應(yīng)用：中國(guó)，201010103804.1［P］.2011-04-20.

［23］Tang X Y，Pan Y，Li S，et al.Screening and isolation of an organic solvent-tolerant bacterium for high-yield production of organic solvent-stable protease［J］.Bioresour Technol，2008，99（3）：7388-7392.

（責(zé)任編輯 荀志金）

Cloning and over-expression of protease gene from Bacillus cereus WQ9-2 in Bacillus subtilis

CHENG Longfei，ZHU Fucheng，LIU Keke，HE Bingfang
（College of Biotechnology and Pharmaceutical Engineering，Nanjing Tech University，Nanjing 211800，China）

Based on the liquid chromatography-mass-mass spectrometry（LC-MS-MS）analysis of trypsindigested protein fragments of the solvent-stable protease WQ from a solvent-stable strain Bacillus cereus WQ9-2，solvent-stable protease gene was successfully cloned.The gene contains an open reading frame of 1 701 bp，encoding a pre-pro-protein enzyme of 566 amino acids（28-aa pre-signal peptide，220-aa propeptide and 318-aa mature protein with the molecular mass of 3.7×104）.The expression plasmid pMA5/ aprWQ was constructed by inserting the aprWQ gene into the vector pMA5 without native signal peptide sequence.The maximum concentration of the recombinant protease was 17 400 U/mL，5 fold higher than the natural production level.Molecular weight，tolerance in organic solvent of recombinant solvent-stable protease was identical to the native protease.The findings provides the basis for further expansion of the catalytic applications of organic solvent-stable protease.

solvent-stable protease；Bacillus subtilis；over-expression；fermentation optimization

Q786

A

1672-3678（2015）03-0020-06

10.3969/j.issn.1672-3678.2015.03.004

2014-05-06

國(guó)家高技術(shù)研究發(fā)展計(jì)劃（863計(jì)劃）重大項(xiàng)目（2012AA022205）；國(guó)家重點(diǎn)基礎(chǔ)研究發(fā)展計(jì)劃（973計(jì)劃）（2011CB710800）

承龍飛（1988—），男，江蘇宜興人，碩士研究生，研究方向：生物化工；何冰芳（聯(lián)系人），教授，博士生導(dǎo)師，E-mail：bingfanghe@njtech.edu.cn