大腸桿菌AFP111利用玉米粉全水解液厭氧發(fā)酵合成丁二酸

張漢文，劉嶸明，梁麗亞，姜 岷，馬江鋒

（南京工業(yè)大學(xué) 生物與制藥工程學(xué)院 材料化學(xué)工程國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 南京 210009）

大腸桿菌AFP111利用玉米粉全水解液厭氧發(fā)酵合成丁二酸

張漢文，劉嶸明，梁麗亞，姜 岷，馬江鋒

（南京工業(yè)大學(xué) 生物與制藥工程學(xué)院 材料化學(xué)工程國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 南京 210009）

利用雙酶法制得的玉米粉糖液及制糖過程中玉米糖渣酶解后含氮水解液作為發(fā)酵培養(yǎng)基，考察在不添加其他營養(yǎng)物質(zhì)條件下大腸桿菌（E.coli）AFP111專一厭氧發(fā)酵產(chǎn)丁二酸的可能性。結(jié)果表明：E.coli AFP111厭氧發(fā)酵48 h后，丁二酸質(zhì)量濃度達(dá)到15.24g/L，丁二酸的得率為0.76g/g。與在LB培養(yǎng)基中發(fā)酵相比，產(chǎn)量提高了14.41%。對(duì)關(guān)鍵酶酶活和輔因子NAD（H）含量的測(cè)定結(jié)果顯示，能利用玉米粉全水解液的蘋果酸脫氫酶（MDH）、磷酸烯醇式丙酮酸（PEP）羧化酶（PPC）、PEP羧化激酶（PCK）酶活及輔因子NAD（H）含量分別為0.88 U、0.29 U、0.31 U和15.09 μmol/g，均比LB培養(yǎng)基中關(guān)鍵酶酶活和輔因子NAD（H）含量高。由此推測(cè)，玉米粉全水解液中關(guān)鍵生長因子（D-生物素、VB1和煙酸）的含量影響了關(guān)鍵酶酶活和輔因子NAD（H）的含量，從而影響丁二酸的產(chǎn)量。在5 L罐中厭氧發(fā)酵120 h，利用玉米粉全水解液，丁二酸的得率為0.84g/g，比利用LB培養(yǎng)基發(fā)酵得到的丁二酸得率提高了21.74%。

玉米粉糖液；玉米渣；大腸桿菌；丁二酸；厭氧發(fā)酵

丁二酸（succinic acid）又稱琥珀酸，是一種重要的C4平臺(tái)化合物，廣泛應(yīng)用于食品、醫(yī)藥、染料、香料和塑料等行業(yè)，可作為合成1，4-丁二醇、四氫呋喃、N-甲基吡咯烷酮及可降解生物高分子材料聚丁二酸丁二醇酯（PBS）等的原料［1］，被美國能源部認(rèn)為是未來12種最有價(jià)值的生物煉制品之一［2］。大腸桿菌具有代謝背景清楚、操作簡便、調(diào)控容易、培養(yǎng)基要求簡單和生長速度快等優(yōu)點(diǎn)，近年來被廣泛用于研究發(fā)酵生產(chǎn)丁二酸［3-5］。

丁二酸主要的產(chǎn)生途徑為葡萄糖經(jīng)過糖酵解途徑生成磷酸烯醇式丙酮酸，進(jìn)而代謝合成草酰乙酸、蘋果酸和富馬酸，最終以丁二酸的形式積累［6］。Vemuri等［7-8］報(bào)道利用大腸桿菌兩階段發(fā)酵產(chǎn)丁二酸的方法，首先有氧生長發(fā)酵，使菌體得到快速積累，然后轉(zhuǎn)為厭氧發(fā)酵，使菌體產(chǎn)生大量的丁二酸。然而兩階段發(fā)酵過程中，需要消耗大量的營養(yǎng)成分用于菌體的生長，導(dǎo)致丁二酸總得率下降；同時(shí)由于菌體有氧生長對(duì)溶氧要求較高，攪拌及冷卻等需要較高的能耗及成本投入，因此，專一性厭氧發(fā)酵產(chǎn)丁二酸受到越來越多的關(guān)注。在專一性厭氧條件下，重組大腸桿菌生產(chǎn)丁二酸需要酵母粉、蛋白胨等復(fù)合氮源作為培養(yǎng)基成分，價(jià)格過于昂貴。此外，還伴隨菌株生長緩慢、丁二酸終濃度和得率較低等問題。例如，重組 Escherichia coli AFP111是E.coli NZN11（pflAB、ldhA雙缺陷）的ptsG自發(fā)突變的菌株，是一株兩階段發(fā)酵生產(chǎn)丁二酸的菌株［9］，利用合成培養(yǎng)基專一性厭氧發(fā)酵時(shí)，E.coli AFP111菌體不生長，不產(chǎn)酸；在LB培養(yǎng)基中進(jìn)行專一性厭氧發(fā)酵，菌株恢復(fù)一定的生長能力，但是丁二酸得率較低。

玉米粉是工業(yè)制作葡萄糖的重要原料［10］，在過濾工藝之后，產(chǎn)生了大量的濾渣——玉米糖渣，濾渣中富集了大量的蛋白質(zhì)。因此，將玉米糖渣經(jīng)蛋白酶水解生產(chǎn)的玉米糖渣水解液作為唯一有機(jī)氮源，玉米粉雙酶法生產(chǎn)的玉米葡萄糖水解液作為唯一碳源，將這2種水解液相結(jié)合，形成玉米粉全水解液發(fā)酵培養(yǎng)基，代替含有蛋白胨和酵母粉的LB培養(yǎng)基，考察該培養(yǎng)基對(duì)重組大腸桿菌厭氧發(fā)酵生產(chǎn)丁二酸的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株

Escherichia coli AFP111［F+λ-rpoS396（Am）rph-1 Δ（pflAB：：Cam）ldhA：：Kan 95 ptsG］，由David P.Clark教授（Southern Illinois University）惠贈(zèng)。

1.1.2 主要試劑

氯霉素、卡那霉素，上海生工生物工程有限公司；高溫α-淀粉酶、糖化酶，蘇柯漢生物工程有限公司；中性蛋白酶，南寧龐博生物工程有限公司；酵母粉、胰蛋白胨，Oxoid公司；CO2氣體，南京上元工業(yè)氣體廠；其他試劑為市售國產(chǎn)分析純。

1.2 方法

1.2.1 葡萄糖水解液的制備

將玉米粉與純水以固體質(zhì)量分?jǐn)?shù)38%的比例混合均勻，每克原料添加0.175mg Ca2+，在pH 6.5、95℃條件下添加7 U/g原料的液化酶，保溫至液化結(jié)束，液化終點(diǎn)為1滴液化液加入到含有2滴碘液的10mL純水中，充分振蕩后顯無色；將液化液滅完酶活后，在pH 4.5、60℃條件下添加200 U/g原料的糖化酶，并保溫60℃，48 h后，所得糖化液經(jīng)過濾得到的濾液為玉米葡萄糖水解液［11］。

1.2.2 玉米淀粉糖渣水解液的制備

糖化液過濾后的濾渣與純水按固體質(zhì)量分?jǐn)?shù)10%的比例混合，在pH 7.0、55℃條件下添加中性蛋白酶，其添加量為濾渣質(zhì)量的0.3%，保溫55℃，24 h后過濾所得濾液為含氮的玉米糖渣水解液。

1.2.3 玉米淀粉糖渣水解液氮含量的測(cè)定

取5mL玉米淀粉糖液并稱質(zhì)量，連同0.1g CuSO4、1.5g K2SO4和10mL濃H2SO4一起加入消解管中，420℃消解150min。然后利用全自動(dòng)凱式定氮儀，將消解好的玉米淀粉糖渣水解液進(jìn)行總氮含量的測(cè)定［12］。

1.2.4 玉米葡萄糖水解液和玉米糖渣水解液添加量的標(biāo)準(zhǔn)

玉米葡萄糖水解液添加量的標(biāo)準(zhǔn)：因玉米葡萄糖水解液中含有高濃度的葡萄糖，所以，根據(jù)玉米葡萄糖水解液中葡萄糖的濃度和發(fā)酵培養(yǎng)基中葡萄糖的終濃度，計(jì)算出發(fā)酵培養(yǎng)基中所加玉米葡萄糖水解液的體積。

玉米糖渣水解液添加量的標(biāo)準(zhǔn)：根據(jù)生產(chǎn)廠家所提供的總氮含量和凱式定氮法的驗(yàn)證，得知LB培養(yǎng)基中總氮含量為1.85g/L，為保證各發(fā)酵培養(yǎng)基中總氮含量的一致性，將總氮含量1.85g/L作為發(fā)酵培養(yǎng)基的氮源終濃度；再根據(jù)凱式定氮法測(cè)出玉米糖渣水解液中總氮含量和發(fā)酵培養(yǎng)基氮源終含量1.85g/L，從而計(jì)算出發(fā)酵培養(yǎng)基中玉米糖渣水解液所添加的體積。

1.2.5 生物素、煙酸和VB1的檢測(cè)

30mL LB培養(yǎng)基：10g/L蛋白胨、5g/L酵母粉、5g/L NaCl、20g/L葡萄糖。

30mL全玉米粉水解液培養(yǎng)基：20g/L玉米葡萄糖水解液（20g/L為發(fā)酵培養(yǎng)基中葡萄糖終濃度）、含1.85g/L總氮的玉米糖渣水解液。

2種培養(yǎng)基在121℃、15min條件下濕熱滅菌，滅菌后的2種培養(yǎng)基送至江蘇省理化檢測(cè)中心檢測(cè)D-生物素、煙酸和VB1的含量。

1.2.6 酶活檢測(cè)

樣品處理：采取超聲3 s、停5 s的策略共超聲破碎3min，于4℃、12 000r/min離心15min，取上清液即粗酶液，測(cè)定酶活。

蘋果酸脫氫酶（MDH）酶活標(biāo)準(zhǔn)反應(yīng)體系參照文獻(xiàn)［13］。

磷酸烯醇式丙酮酸（PEP）羧化激酶（PCK）酶活標(biāo)準(zhǔn)反應(yīng)體系參照文獻(xiàn)［14］。

PEP羧化酶（PPC）酶活標(biāo)準(zhǔn)反應(yīng)體系參照文獻(xiàn)［15］。采用聯(lián)機(jī)紫外-可見分光光度計(jì)連續(xù)監(jiān)測(cè)412nm處吸光值的變化，根據(jù)測(cè)定的標(biāo)準(zhǔn)曲線換算成底物濃度。

MDH酶活定義：25℃、1min內(nèi)催化草酰乙酸（OAA）生成1 μmol蘋果酸所需要的酶量，即1 U。

PCK酶活定義：25℃、1min內(nèi)催化PEP生成1 μmol OAA所需要的酶量，即1 U。

PPC酶活定義：25℃、1min內(nèi)催化PEP生成1 μmol OAA所需要的酶量，即1 U。

1.2.7 培養(yǎng)基及培養(yǎng)條件

種子培養(yǎng)基，即LB培養(yǎng)基：酵母粉5g/L、蛋白胨10g/L、NaCl 5g/L；pH 7.0，氯霉素和卡那霉素的終質(zhì)量濃度分別為100 μg/mL。

專一性厭氧發(fā)酵用培養(yǎng)基有以下2種。①30mL LB培養(yǎng)基：添加16g/L堿式MgCO3、20g/L葡萄糖。②30mL玉米粉全水解液培養(yǎng)基：20g/L玉米葡萄糖水解液（20g/L為發(fā)酵培養(yǎng)基中葡萄糖終質(zhì)量濃度）、含1.85g/L總氮的玉米糖渣水解液、添加16g/L堿式MgCO3，pH 7.0，氯霉素和卡那霉素的終質(zhì)量濃度分別為100 μg/mL。

1.2.8 培養(yǎng)方法

種子培養(yǎng)：將保存于-80℃凍存管的菌種按1%接種量接種到5mL LB試管，37℃、200r/min培養(yǎng)11 h，1%接種量接種到 LB培養(yǎng)基中有氧培養(yǎng)，37℃、200r/min培養(yǎng)6 h。

專一性厭氧發(fā)酵：轉(zhuǎn)接10%的菌液到血清瓶中，通入過濾除菌后的CO2氣體2min，保證血清瓶中為厭氧環(huán)境，37℃、200r/min發(fā)酵48 h。

1.2.9 發(fā)酵及代謝物分析

細(xì)胞生長是用紫外-可見分光光度計(jì)于波長600nm處測(cè)定吸光度值，細(xì)胞干質(zhì)量（ρ（DCW），g/L）是由ρ（DCW）與OD600測(cè)定的標(biāo)準(zhǔn)曲線換算得到，換算公式為ρ（DCW）=0.4×OD600。培養(yǎng)基中的葡萄糖用SBA40C型生物傳感儀（山東省科學(xué)院生物研究所）檢測(cè)，有機(jī)酸用高效液相色譜法（HPLC）檢測(cè)，色譜柱為Prevail Organic Acid，流動(dòng)相為25mmol/L KH2PO4，pH 2.5，流速1.0mL/min，紫外檢測(cè)波長215nm。

2 結(jié)果與討論

2.1 專一性厭氧條件下重組大腸桿菌利用玉米粉全水解液發(fā)酵

選用富含營養(yǎng)物的玉米粉全水解液作為培養(yǎng)基，在專一性厭氧條件下，重組大腸桿菌AFP111發(fā)酵生產(chǎn)丁二酸。37℃、200r/min有氧培養(yǎng)菌體到OD600為10左右，菌液轉(zhuǎn)接厭氧血清瓶，48 h后測(cè)定細(xì)胞干質(zhì)量、殘?zhí)?、乙酸及丁二酸的含量，結(jié)果如表1所示。

由表1可知：E.coli AFP111厭氧發(fā)酵48 h后細(xì)胞干質(zhì)量達(dá)到2.34g/L，乙酸積累較少，丁二酸產(chǎn)量和得率分別為15.24g/L和0.76g/g。與在LB培養(yǎng)基中厭氧發(fā)酵結(jié)果相比，丁二酸的產(chǎn)量和得率分別提高了14.42%和13.43%。由此可見，玉米粉全水解液有作為發(fā)酵培養(yǎng)基厭氧合成丁二酸的潛質(zhì)。

表1 玉米粉全水解液作為培養(yǎng)基厭氧發(fā)酵結(jié)果Table 1 Results of anaerobic fermentation by Escherichia coli AFP111 using the complete hydrolysate of corn flour medium

2.2 玉米粉全水解液對(duì)丁二酸合成的影響初探

由上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果可知，玉米粉全水解液厭氧合成丁二酸的產(chǎn)量較高，玉米粉全水解液有作為丁二酸發(fā)酵培養(yǎng)基的潛質(zhì)。經(jīng)凱式定氮法測(cè)定，玉米粉全水解液含有充足的總氮含量（表2），可以代替酵母粉和蛋白胨，作為菌體生長和發(fā)酵的有機(jī)氮源。婁秀平等［16］研究發(fā)現(xiàn)，VB1對(duì)菌體生長和代謝有促進(jìn)作用，Tyler等［17］等研究發(fā)現(xiàn)，D 生物素對(duì)菌體生長和產(chǎn)酸有促進(jìn)作用；煙酸是生物合成NADH、NAD+等輔酶的前體物質(zhì)［18］。將滅過菌的、相同體積的玉米粉全水解液和LB培養(yǎng)基送至江蘇省理化檢測(cè)中心，檢測(cè)結(jié)果如表2所示。由表2可知：玉米粉全水解液中總氮的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.35%，D 生物素、VB1和煙酸的質(zhì)量濃度分別為11.6mg/L、139.0mg/L和12.7mg/L，明顯高于LB培養(yǎng)基中總氮、D 生物素、VB1和煙酸的含量。所以推測(cè)玉米粉全水解液中富含菌體生長和產(chǎn)酸所需的有機(jī)氮源、煙酸、生物素和VB1等營養(yǎng)物質(zhì)，有利于丁二酸的積累。

生物素、VB1、煙酸和總氮含量的對(duì)比Table 2 Comparing of two kinds of culture medium concentration of D-biotin，VB1，nicotinic acid and total nitrogen表2 2種培養(yǎng)基中D

通過對(duì)關(guān)鍵酶酶活和輔因子含量的測(cè)定，考察玉米粉全水解液對(duì)厭氧合成丁二酸的影響，實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表3。由表3可知：使用玉米粉全水解液做培養(yǎng)基，E.coli AFP111發(fā)酵48 h后，菌體內(nèi)輔酶NAD（H）總含量、MDH、PPC和PCK的酶活分別為15.09 μmol/g、0.88 U、0.29 U和0.31 U，玉米糖渣水解液作為培養(yǎng)基菌體內(nèi)輔酶NAD（H）總含量和3種關(guān)鍵酶的酶活均比在LB培養(yǎng)基菌體內(nèi)的輔酶NAD（H）總含量和3種酶酶活要高。再與表2結(jié)合分析，可以發(fā)現(xiàn)輔酶NAD（H）總含量和關(guān)鍵酶酶活與關(guān)鍵生長因子含量成正相關(guān)關(guān)系，由此推測(cè)，玉米粉全水解液中較多的關(guān)鍵生長因子含量使菌體在培養(yǎng)過程中產(chǎn)生較高的酶活和較多的輔因子供給重組大腸桿菌E.coli AFP111厭氧代謝生產(chǎn)丁二酸。

表3 E.coli AFP111厭氧發(fā)酵中MDH、PPC和PCK酶活以及輔因子NAD（H）的對(duì)比Table 3 Comparing the enzyme activity of MDH，PPC，PCK and NAD（H）during anaerobic fermentation by E.coli AFP111

2.3 碳氮比對(duì)發(fā)酵的影響

培養(yǎng)基中的碳氮比對(duì)于菌體的培養(yǎng)有關(guān)鍵性的作用［19］。筆者設(shè)計(jì)單因素實(shí)驗(yàn)，培養(yǎng)基中總氮濃度不變，添加不同濃度的初糖，考察不同碳氮比對(duì)于重組大腸桿菌利用玉米粉全水解液厭氧發(fā)酵丁二酸的影響。實(shí)驗(yàn)結(jié)果見圖1。

由圖1可知：當(dāng)初糖質(zhì)量濃度為20g/L時(shí)，E.coli AFP111在玉米粉全水解液培養(yǎng)基厭氧發(fā)酵48 h后，菌體細(xì)胞干質(zhì)量、糖消耗量以及丁二酸積累都是最高的，丁二酸的產(chǎn)量為15.21g/L，丁二酸轉(zhuǎn)化率為0.76g/g。與其他初糖濃度的發(fā)酵結(jié)果相比，初糖質(zhì)量濃度為20g/L時(shí)，是菌體生長和產(chǎn)酸較適宜的碳氮比。

圖1 不同初糖濃度專一性厭氧發(fā)酵結(jié)果Fig.1 Results of anaerobic fermentation by different initial glucose concentration

2.4 5 L發(fā)酵罐厭氧發(fā)酵丁二酸結(jié)果

選用上節(jié)實(shí)驗(yàn)所得到的碳氮比，在5 L發(fā)酵罐中分別進(jìn)行玉米粉全水解液培養(yǎng)基和LB培養(yǎng)基厭氧發(fā)酵的放大實(shí)驗(yàn)，發(fā)酵結(jié)果如圖2、圖3和表4所示。

由圖2、圖3和表4可知：專一性厭氧條件下發(fā)酵120 h，E.coli AFP111在玉米粉全水解液培養(yǎng)基中消耗50g/L葡萄糖，發(fā)酵生產(chǎn)丁二酸42.29g/L，得率為0.84g/g，與在LB培養(yǎng)基中發(fā)酵生產(chǎn)丁二酸相比，丁二酸產(chǎn)量相差無幾，但得率提高了21.74%。

圖2 玉米粉全水解液培養(yǎng)基專一性厭氧5 L發(fā)酵罐發(fā)酵結(jié)果Fig.2 Results of anaerobic fermentation by the complete hydrolysate of corn flour medium in a 5-L bioreactor

圖3 LB培養(yǎng)基專一性厭氧5 L發(fā)酵罐發(fā)酵結(jié)果Fig.3 Results of anaerobic fermentation by the LB medium in a 5-L bioreactor

表4 5 L發(fā)酵罐中2種培養(yǎng)基專一性厭氧發(fā)酵結(jié)果對(duì)比Table 4 Comparing with the results of anaerobic fermentation of two kinds of medium in a 5-L bioreactor

3 結(jié)論

用不同的酶水解得到葡萄糖水解液和玉米糖渣水解液，在不添加其他碳、氮源的前提下，利用玉米粉全水解液作為培養(yǎng)基代替含有價(jià)格昂貴的酵母粉和蛋白胨的LB培養(yǎng)基。重組大腸桿菌E.coli AFP111在專一性厭氧條件下利用玉米粉全水解液發(fā)酵生產(chǎn)丁二酸，發(fā)酵120 h，利用玉米粉全水解液做培養(yǎng)基，消耗50g/L的葡萄糖，丁二酸產(chǎn)量為42.29g/L，與用LB培養(yǎng)基消耗60g/L葡萄糖生產(chǎn)的丁二酸產(chǎn)量相差無幾；但利用玉米粉全水解液的丁二酸得率為0.84g/g，比利用LB培養(yǎng)基的得率提高了21.74%。對(duì)玉米粉全水解液的部分成分分析，發(fā)現(xiàn)與LB培養(yǎng)基相比，D-生物素、煙酸和VB1的含量較高，D-生物素和VB1對(duì)菌體以糖為底物的代謝有著密不可分的聯(lián)系，而煙酸是能量與輔酶系統(tǒng)中的重要前體物質(zhì)。由此可見，D-生物素、煙酸和VB1對(duì)于玉米粉全水解液做發(fā)酵培養(yǎng)基厭氧發(fā)酵生產(chǎn)丁二酸有促進(jìn)作用。除此之外，玉米粉全水解液的原料成本低于LB培養(yǎng)基的原料成本。由此可以表明，玉米粉全水解液作為發(fā)酵培養(yǎng)基有代替LB培養(yǎng)基厭氧發(fā)酵生產(chǎn)丁二酸的潛力。

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（責(zé)任編輯 管 珺）

Succinic acid production from complete hydrolysate of corn flour by anaerobic fermentation with Escherichia coli AFP111

ZHANG Hanwen，LIU Rongming，LIANG Liya，JIANG Min，MA Jiangfeng
（State Key Laboratory of Materials-Oriented Chemical Engineering，College of Biotechnology and Pharmaceutical Engineering，Nanjing Tech University，Nanjing 210009，China）

This study aimed to use the complete hydrolysate of corn flour as medium instead of lysogeny broth（LB）medium for succinic acid production.The complete hydrolysate of corn flour contains two hydrolysates.The glucose hydrolysate derived from two enzymes hydrolysis of corn flour was used as carbon source，and the corn residue hydrolysate was used as nitrogen source.After 48 h of anaerobic fermentation by using the complete hydrolysate of corn flour without anyother nutrients，the concentration of succinic acid was 15.24g/L，which was 14.41%higher than that on LB medium，and the yield of succinic acid was 0.76g/g.The enzyme activity of key enzymes and the concentration of NAD（H）were measured.The enzyme activity of MDH，PPC，PCK and the concentration of NAD（H）were 0.88 U，0.29 U，0.31 U and 15.09 μmol/g respectively，higher than that on LB medium.Therefore it was assumed that the concentration ofgrowth factors（D-biotin，VB1and nicotin acid）affected the enzyme activity of key enzymes，the concentration of NAD（H）and the concentration of succinic acid.After 120 h of anaerobic fermentation，the yield of succinic acid was 0.84g/g，21.74%higher than that on LB medium.

the glucose hydrolysate；corn residue；E.coli；succinic acid；anaerobic fermentation

TQ921

A

1672-3678（2015）03-0014-06

10.3969/j.issn.1672-3678.2015.03.003

2014-05-09

國家重點(diǎn)基礎(chǔ)研究發(fā)展計(jì)劃（973計(jì)劃）（2013CB733901）；國家自然科學(xué)基金（21306087）；新世紀(jì)優(yōu)秀人才支持計(jì)劃（NCET-12-0732）

張漢文（1986—），男，江蘇南京人，碩士研究生，研究方向：生物化工；姜 岷（聯(lián)系人），教授，E-mail：bioengine@njtech.edu.cn