疏水離子液體中生物不對稱還原制備手性醇

宋 潔，穆曉清，王 棟，徐 巖

（江南大學 生物工程學院 教育部工業(yè)生物技術重點實驗室，江蘇 無錫 214122）

疏水離子液體中生物不對稱還原制備手性醇

宋 潔，穆曉清，王 棟，徐 巖

（江南大學 生物工程學院 教育部工業(yè)生物技術重點實驗室，江蘇 無錫 214122）

針對近平滑假絲酵母全細胞不對稱還原2-羥基苯乙酮制備光學純（R）-苯基乙二醇反應中底物的質量濃度、產量及質量平衡低的問題，運用多相萃取生物轉化的原理，比較不同非水介質對不對稱還原反應效率的影響，構建具有良好生物相容性和高質量平衡的水/疏水離子液體1-丁基-3-乙基咪唑六氟磷酸鹽（［BEIM］PF6）雙相反應體系。考察該體系下輔助底物種類、輔助底物用量、底物質量濃度、催化劑用量、離子液體比例、pH和反應溫度對生物催化反應的影響，通過正交試驗設計和響應面法優(yōu)化不對稱還原2-羥基苯乙酮的反應條件，在最優(yōu)反應條件下，產物質量濃度、產率和質量平衡得率分別達到15.35g/L、76.8%和84.3%，產物的對映消旋值（e.e.值）大于99.9%。

不對稱還原；全細胞；（R）-苯基乙二醇；離子液體；質量平衡

（R）-苯基乙二醇（（R）-PED）作為一種重要的手性砌塊，是制備多種生物活性化合物的重要中間體［1-2］，同時也是液晶中不可缺少的手性添加劑。利用傳統(tǒng)化學方法合成手性醇，存在合成步驟復雜、反應條件苛刻、反應選擇性低、產物分離困難和環(huán)境污染等缺點［3-4］。而生物合成手性醇方法則有反應條件溫和［5］、反應立體選擇性高、區(qū)域選擇性高和化學選擇性高［6-7］、環(huán)境友好等優(yōu)點，符合原子經(jīng)濟、綠色化學的發(fā)展方向。

手性生物合成法催化劑主要以游離酶或全細胞參與反應。全細胞催化劑具有使用便捷、易于回收、能夠重復利用等優(yōu)點，其作為氧化還原反應催化劑時，可以通過添加廉價的輔助底物，利用細胞內輔酶體系為還原反應提供還原型輔酶，同時酶存在于天然的細胞環(huán)境中不易失活、穩(wěn)定性好。

但生物合成法存在底物難溶、產物濃度低等缺點，運用多相萃取技術向反應體系中加入非水介質，能夠增加底物溶解度、降低底物對催化劑的毒害作用，實現(xiàn)產物濃度的提高。離子液體（ILs）作為一種環(huán)境友好型的綠色反應介質，對多數(shù)疏水性化合物溶解性良好［8］，具有穩(wěn)定性好、不易揮發(fā)、生物相容性好等優(yōu)點［9-10］，可以有效提高反應速率和產物的光學純度［11-12］。

本研究中，筆者使用所在實驗室保藏的1株近平滑假絲酵母Candida parapsilosis JNYX全細胞作為生物催化劑，以不對稱還原2-羥基苯乙酮（2-HAP）制備（R）-PED為模式反應，經(jīng)比較不對稱還原反應在不同體系下的催化效果選擇綠色溶劑離子液體（ILs）作為反應介質，并篩選到疏水性離子液體1-丁基-3-乙基咪唑六氟磷酸鹽（［BEIM］PF6）構建水/［BEIM］PF6雙相反應體系，以考察該體系下反應條件并進行優(yōu)化，以提高反應的底物濃度、產率和反應質量平衡以及催化劑在雙相反應體系中的穩(wěn)定性，為生物合成手性醇提供基礎數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌種

近平滑假絲酵母Candida parapsilosis JNYX為筆者所在實驗室保藏菌種。

1.1.2 培養(yǎng)基

酵母培養(yǎng)基：葡萄糖40g/L，酵母浸膏5g/L，無機鹽溶液10%（體積分數(shù)）。pH 7.0。

無機鹽溶液（g/L）：（NH4）2HPO413，KH2PO47，MgSO4·H2O 0.8，NaCl 0.1。

1.1.3 主要試劑及儀器

2-羥基苯乙酮（2-HAP），日本TCI公司；離子液體［BEIM］PF6，中國科學院蘭州物理化學研究所；其他離子液體由浙江大學吳起老師提供。

高效液相色譜P680（紫外檢測器），美國Dionex公司；Chiralcel OB-H色譜柱（4.6mm×250mm），日本Daicel公司。

1.2 菌體培養(yǎng)

種子培養(yǎng) 從斜面接兩環(huán)菌種，接種到裝液量為20%（體積分數(shù)）的250mL三角瓶中，置于150r/min的搖床中30℃恒溫振蕩培養(yǎng)24 h。

菌種培養(yǎng) 以2%的接種量將種子液接種至裝液量為 20%的 500mL三角瓶中，于 30℃、150r/min搖床上培養(yǎng) 48 h。發(fā)酵結束后，于 4℃、12 000r/min離心，并用生理鹽水洗滌2次后收集細胞，4℃下保存待用。

1.3 不對稱還原反應

2mL反應體系，加入0.5g濕菌體、20g/L 2-HAP、0.4g葡萄糖，30℃、200r/min反應24 h。反應結束后，反應液離心（12 000r/min），上清液用乙酸乙酯萃取，乙酸乙酯相用于HPLC檢測。

1.4 水/［BEIM］PF6雙相體系反應條件的優(yōu)化

通過正交試驗設計對輔助底物種類、輔助底物用量、底物質量濃度、催化劑用量、ILs比例、pH和反應溫度7個因素進行優(yōu)化，試驗設計為L18（37），30℃、200r/min反應24 h，HPLC檢測反應結果。

對正交試驗設計中影響較為顯著的因素使用響應面法進一步優(yōu)化，使用響應面分析軟件Design Expert設計實驗方案，HPLC檢測反應結果。

1.5 水/［BEIM］PF6雙相體系中催化劑穩(wěn)定性研究

在優(yōu)化反應條件下進行重復批次實驗，反應24 h離心收集菌體（4℃、12 000r/min，10min），用生理鹽水洗滌2次，相同條件下進行下一批次反應。

1.6 分析方法

乙酸乙酯萃取樣品，采用HPLC分析，色譜柱為Chiralcel OB-H柱（4.6mm×25mm；Daicel），流動相為正己烷/異丙醇（體積比 9∶1），流速 0.4mL/min，柱溫38℃，紫外檢測器，檢測波長215 nm。（S）-PED和（R）-PED的出峰時間分別為19.5min和23.5min，2-HAP出峰時間為27.5min。

（R）-PED光學純度計算見式（1）。

（R）-PED得率計算見式（2）。

反應質量平衡收率計算見式（3）。

式中：cS、cR分別為反應結束后（S）-PED和（R）-PED的濃度，c0為2-HAP的濃度，cH為反應結束后剩余2-HAP濃度。

2 結果與討論

2.1 反應體系對不對稱還原反應效率的影響

近平滑假絲酵母通常不對稱還原2-HAP生成（S）-PED，本研究室從保藏的近平滑假絲酵母中篩選獲得 1株具有高度立體選擇性的 Candida parapsilosis JNYX，其不對稱還原2-HAP能夠制備（R）-PED，e.e.值大于99.9%。水相反應體系研究表明，該方法存在2個主要缺陷。首先，非天然底物2-HAP溶解度僅為11g/L，限制了反應底物濃度的提高；其次，在水相反應體系中，催化劑對底/產物存在代謝作用，導致反應質量平衡顯著降低。非水多相萃取反應體系是解決上述問題的一種簡單、有效的方法［13-14］，本研究考察水/有機溶劑、水/助溶劑、水/樹脂（NKA-Ⅱ）、水/離子液體反應體系對產物濃度和反應質量平衡的影響，結果見表1。

由表1可知：異丙醇助溶劑體系和水/樹脂（NKA-Ⅱ）雙相反應體系中反應產率和質量平衡收率沒有明顯變化；水/鄰苯二甲酸二丁酯雙相反應體系中，產物質量濃度下降0.97g/L，質量平衡收率提高29.1%；水/［BMIM］PF6雙相反應體系產物質量濃度下降2.49g/L，質量平衡收率增加42.8%。由于有機溶劑具有對催化劑有毒、易燃、易揮發(fā)［15］等缺點，ILs作為一種綠色溶劑，比有機溶劑穩(wěn)定并具有良好生物相容性［16-17］，因此選擇ILs（［BMIM］PF6）作為反應介質進行下一步研究。

表1 反應體系對不對稱還原2-HAP反應效率的影響Table 1 Effects of reaction systems on asymmetric reduction efficiency of 2-HAP

2.2 離子液體類型對不對稱還原反應效率的影響

ILs對生物催化劑的催化特性具有重要影響［3，18］，在水/離子液體雙相反應體系中，ILs離解形成具有極性區(qū)域和非極性區(qū)域的微小結構，可以通過改變酶分子電荷分布、影響底物和產物的溶劑化狀態(tài)、改變反應介質的特性而影響酶促反應催化效率。

考察不同ILs對細胞不對稱還原2-HAP反應效率的影響，結果見表2。由表2可知，ILs的水溶性對催化反應具有明顯影響。親水性離子液體介質中均沒有檢測到產物；疏水性離子液體反應體系中檢測到產物，且反應質量平衡收率大于85%。這可能是因為疏水性離子液體作為反應介質的催化效果與離子液體黏度有關，黏度隨陽離子組分咪唑基碳鏈長度增加而增大［15，19-20］。高黏度反應體系降低酶和底物之間的傳質速率，是導致轉化效率下降的主要原因。傳質速率的降低同樣降低了細胞對底/產物的代謝速率，而反應質量平衡收率隨離子液體黏度增加而增加。綜合考慮反應產率和質量平衡收率，選擇離子液體［BEIM］PF6作為2-HAP不對稱還原制備（R）-PED的反應介質。

2.3 反應條件對水/［BEIM］PF6雙相體系中催化效率的影響

2.3.1 輔助底物對不對稱還原反應效率的影響

不對稱還原反應需要等量輔酶（NADH或NADPH）作為氫供體，酵母細胞內輔酶量較少，需要向體系內添加輔助底物以維持反應正常進行?？疾觳煌o助底物對細胞不對稱還原2-HAP反應效率的影響，結果見圖1。

表2 不同ILs對不對稱還原2-HAP反應效率的影響Table 2 Effects of various ILs on asymmetric reduction efficiency of 2-HAP

圖1 輔助底物對不對稱還原2-HAP反應效率的影響Fig.1 Effects of co-substrates on asymmetric reduction efficiency of 2-HAP

由圖1可知：醇類輔底物不能提高反應產率，糖類輔底物則可以有效提高產率，當果糖、蔗糖和葡萄糖作為輔助底物時，反應產率較高。實際生產應用中，果糖成本過高，與果糖相比，蔗糖和葡萄糖作為輔助底物時的產率僅分別降低了3.5%和5.9%。因此，選擇相對廉價的葡萄糖作為不對稱還原制備（R）-PED的輔助底物。

2.3.2 葡萄糖用量對不對稱還原反應效率的影響

葡萄糖作為輔助底物時，其用量對催化反應的影響結果見圖2。由圖2可知：葡萄糖用量對反應產率具有顯著影響，用量小于0.08g時，產率隨葡萄糖用量增加而增加；葡萄糖用量大于0.08g時，產率隨葡萄糖用量增加大幅度下降，說明過多的葡萄糖不僅不能提高產率，反而會對細胞代謝活性產生抑制作用，因此葡萄糖用量應選擇在0.08～0.12g。由此可見，合理控制輔底物用量，對于提高反應產率具有重要影響，同時輔底物用量與催化劑用量、底物濃度密切相關，是反應條件中影響反應效率的關鍵因素。

2.3.3 底物質量濃度對不對稱還原反應效率的影響

考察水/［BEIM］PF6雙相體系中底物質量濃度對不對稱還原反應效率的影響，結果見圖3。由圖3可知：底物質量濃度變化對質量平衡收率無明顯影響，但隨著底物質量濃度增加，產物質量濃度不斷增加，而產率持續(xù)下降。因此，在高底物濃度條件下，要將底物完全轉化需要大幅度延長反應時間，然而反應時間的延長和產物的不斷積累使催化劑受到的產物毒害及抑制作用增強，嚴重降低整個批次反應的時空轉化率。因此，底物質量濃度應選在20g/L左右。

圖2 葡萄糖用量對不對稱還原2-HAP反應效率的影響Fig.2 Effects of glucose concentration on asymmetric reduction efficiency of 2-HAP

圖3 底物質量濃度對不對稱還原2-HAP反應效率的影響Fig.3 Effects of substrate concentration on asymmetric reduction efficiency of 2-HAP

2.3.4 催化劑用量對不對稱還原反應效率的影響

考察催化劑（細胞）用量對不對稱還原反應效率的影響，結果見圖4。由圖4可知：不對稱還原反應產率隨催化劑用量增加而增加，由于催化劑對底/產物具有代謝作用，反應質量平衡收率隨催化劑用量增加而下降。同時，催化劑用量過多也會增加反應體系黏度，影響反應的傳質。綜合考慮產率和反應質量平衡收率，催化劑用量應控制在0.8g以內。

2.3.5 離子液體對不對稱還原反應效率的影響

兩相反應體系中，細胞只有在水相中可催化不對稱還原反應，兩相體積比不僅決定了底/產物在兩相中的分配比，同時兩相體積比會影響相界面面積大小，從而影響生物轉化的效率［13］。因此，考察離子液體比例對反應產率和質量平衡收率的影響，結果見圖5。由圖5可知：離子液體的比例對反應產率和質量平衡收率都具有顯著影響。產率在離子液體比例為20%（體積比）時達到最大，而質量平衡收率隨離子液體比例的增大持續(xù)增加，這是由于隨著離子液體比例增大，整個反應體系黏度增加，高黏度反應體系阻礙酶和底物之間的傳質［21］，降低了細胞對底/產物的代謝速率。綜合考慮反應產率和質量平衡收率，離子液體比例選擇為20%。

圖4 細胞量對不對稱還原2-HAP反應效率的影響Fig.4 Effects of cell mass on asymmetric reduction efficiency of 2-HAP

圖5 離子液體用量對不對稱還原2-HAP反應效率的影響Fig.5 Effects of ILs volume ratio on asymmetric reduction efficiency of 2-HAP

2.3.6 緩沖液pH對不對稱還原反應效率的影響

反應體系的pH不僅會影響羰基還原酶的活性，還會影響到細胞內輔酶再生?？疾旆磻w系pH對不對稱還原2-HAP反應效率的影響，結果見圖6。由圖6可知：pH變化對反應質量平衡收率無明顯影響，對產率則存在影響，當pH為2.0～4.0時，反應產率維持在較高水平，隨著pH的進一步升高，產率明顯下降，當pH范圍在6.0～9.0時，產率保持在較低水平無明顯變化。因此，該反應適宜控制在酸性環(huán)境下進行，pH選擇在4.0。

圖6 pH對不對稱還原2-HAP反應效率的影響Fig.6 Effects of pH value on asymmetric reduction efficiency of 2-HAP

2.3.7 反應溫度對不對稱還原反應效率的影響

對于水/［BEIM］PF6雙相反應體系，反應溫度不僅影響細胞和羰基還原酶的活性，同時通過影響ILs黏度改變整個反應的傳質速率。圖7所示為反應溫度（20～40℃）對反應效率的影響。由圖7可知：產率在反應溫度為25℃時達到最大。反應質量平衡收率在反應溫度為40℃明顯降低，這是由于較高溫度下離子液體黏度降低有利于體系內傳質，增大了細胞對底/產物的代謝速率。因此，反應溫度在25℃時有利于反應效率的提高。

圖7 反應溫度對不對稱還原2-HAP反應效率的影響Fig.7 Effects of temperature on asymmetric reduction efficiency of 2-HAP

2.4 水/［BEIM］PF6雙相體系中不對稱還原反應條件的優(yōu)化

在單因素實驗基礎上，設計L18（37）正交試驗優(yōu)化不對稱還原反應的反應條件。單因素實驗結果表明，輔助底物用量對不對稱還原反應效率具有較大影響，同時輔底物用量與催化劑用量、底物濃度存在直接關系。因此在正交試驗設計中，催化劑用量采用m（催化劑）/m（輔底物）的方式表示，即以參與單位輔底物代謝所需細胞量表征催化劑用量；同樣，因輔底物用量直接決定整個輔酶循環(huán)過程中還原型輔酶的總量，還原型輔酶和底物轉化存在等摩爾量關系，因此底物質量濃度以ρ（底物）/m（輔底物）表示。正交試驗設計各因素水平取值及結果見表3。

表3 正交試驗設計及結果Table 3 Orthogonal experimental design and results

對表3實驗結果進行均值計算，分別得到當產量、產率、質量平衡收率最大時的反應優(yōu)化條件，對三組優(yōu)化條件進行驗證實驗（數(shù)據(jù)未列出）發(fā)現(xiàn)，以產量為參考值時得到的優(yōu)化條件（0.1g葡萄糖，20g/L 2-HAP，0.7g菌體，［BEIM］PF625%，pH 3.0，反應溫度25℃）下反應效率最好，產物質量濃度15.22g/L，產率76.1%，質量平衡收率81.9%。

進一步對正交試驗結果進行極差分析和方差分析，結果見表4。由表4可知：因素A、C、F的水平變化對于產量、產率和質量平衡收率都具有較大影響。同時，為了將因素水平變化引起的實驗結果間的差異與誤差波動引起的差異區(qū)分開來，對表3數(shù)據(jù)進行了方差分析，結果表明因素C對產量、產率和質量平衡收率的影響具有顯著性，因素A、G對質量平衡收率的影響具有顯著性。

表4 正交試驗設計極差分析和方差分析Table 4 Range analysis and variance analysis of orthogonal experimental design

由表4還可知：對3個主要影響因素A、C、F使用響應面法進一步優(yōu)化（數(shù)據(jù)未列出），最終確定不對稱還原2-HAP制備（R）-PED的反應條件為0.08g葡萄糖，20g/L 2-HAP，0.55g菌體，反應溫度25℃，pH 3.5，離子液體比例25%。該優(yōu)化條件下底物質量濃度20g/L，反應24 h后產物質量濃度15.35g/L，產率76.8%，質量平衡收率84.3%。本研究結果的底物濃度比已有文獻報道的最大底物質量濃度12.5g/L［22］提高60%，產物濃度比已報道的最大產物質量濃度7.39g/L［23］高107.8%。

2.5 不對稱還原2-HAP反應過程曲線

在優(yōu)化反應條件下跟蹤不對稱還原反應轉化過程，結果見圖8。由圖8可知：反應過程中（R）-PED的光學純度始終大于99.9%。反應前6 h，產物合成呈線性增加；反應6 h后，由于底物濃度的降低和產物積累，反應速度逐漸減慢；反應至30 h時，水相底物濃度過低、產物進一步積累導致產物合成速率十分緩慢，底物仍有1.86g/L剩余。此時，如果繼續(xù)延長反應時間，產物合成量極?。〝?shù)據(jù)未列出），同時質量平衡收率隨反應時間延長而下降，大大降低了反應的時空轉化率，因此選擇在30 h終止反應。反應過程中催化劑對葡萄糖具有較高的代謝速率，反應開始1 h葡萄糖即完全消耗。因此在反應1 h后向反應體系補加0.08g葡萄糖繼續(xù)反應至24 h，催化反應產率和質量平衡收率分別為74.2%和80.4%，說明葡萄糖消耗殆盡并不是反應后期反應速率大幅下降的原因，維持補加葡萄糖反而會降低催化反應效率。另外，整個反應過程中，質量平衡收率則一直保持緩慢下降，前6 h下降速度較快，這與細胞糖耗及不對稱還原反應速率有關。

圖8 不對稱還原2-HAP反應過程曲線Fig.8 The time course of asymmetric reduction of 2-HAP

2.6 水/［BEIM］PF6雙相體系中催化劑穩(wěn)定性的研究

在生物催化劑的實際應用中，催化劑穩(wěn)定性對催化劑的更換頻率、反應時間和產率具有重要影響［24］，因此考察近平滑假絲酵母在水/［BEIM］PF6雙相反應體系中循環(huán)使用的穩(wěn)定性，結果見圖9。由圖9可知，與單水相體系相比，水/［BEIM］PF6雙相反應體系中產物質量濃度提高了84%，質量平衡收率提高了96%。與單水相體系中細胞穩(wěn)定性比較，水/［BEIM］PF6雙相體系中近平滑假絲酵母保持了良好的穩(wěn)定性，說明離子液體對細胞具有很好的生物相容性。

3 結論

使用近平滑假絲酵母全細胞作為手性催化劑合成光學純（R）-PED，（R）-PED光學純度大于99.9%，簡化了后期分離提純步驟，提高了產品品質。通過對離子液體進行篩選，篩選到疏水性離子液體［BEIM］PF6構建水/［BEIM］PF6雙相反應體系。對該體系下各單因素對反應的影響進行研究，通過正交試驗設計和響應面設計優(yōu)化水/［BEIM］PF6雙相體系的反應條件。單純通過條件控制和反應體系的改變，使反應的產物濃度和質量平衡收率比水相體系中分別提高了84%和96%，成功實現(xiàn)批次反應產物濃度的大幅提高，同時催化劑在水/［BEIM］PF6雙相反應體系中具有良好的操作穩(wěn)定性。

圖9 水/［BEIM］PF6雙相體系和單一水相中催化劑的操作穩(wěn)定性Fig.9 Operational stability of catalyst in aqueous/［BEIM］PF6two-phase system and aqueous

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（責任編輯 荀志金）

Biological asymmetric reduction for preparation of chiral alcohols inhydrophobicity ionic liquids

SONG Jie，MU Xiaoqing，WANG Dong，XU Yan
（Key Laboratory Industrial Biotechnology of the Ministry of Education，School of Biotechnology，Jiangnan University，Wuxi 214122，China）

Whole cells of Candida parapsilosis catalyze asymmetric reduction of 2-hydroxyacetophenone for preparation of optically pure（R）-1-phenyl-1，2-ethanediol.The multiphase extraction of bioconversion was applied to improve substrate concentration，yield and the mass balance of the asymmetric reduction reaction.Different non-aqueous reaction systems were compared and aqueous/hydrophobicity ionic liquids（ILs）1-butyl-3-ethylimidazolium hexafluorophosphate（［BEIM］PF6）biphasic system shown better biocompatibility and high mass balance.The effects of the different co-substrates，co-substrate mass，substrate concentration，catalyst mass，ILs ratio，pH value and reaction temperature on the biological catalysis reaction were studied.Reaction conditions of asymmetric reduction of 2-hydroxyacetophenone was optimized by orthogonal experimental design and response surface experimental design.Under the optimized reaction conditions，product concentration，yield and mass balance reached 15.35g/L，76.8%，84.3%，respectively.The enantiomeric excess（e.e.）value of product was above 99.9%.

asymmetric reduction；whole cells；（R）-1-phenyl-1，2-ethanediol；ionic liquids；mass balance

O643.3；TQ244.2

A

1672-3678（2015）02-0001-08

10.3969/j.issn.1672-3678.2015.02.001

2014-03-13

國家高技術研究發(fā)展計劃（863計劃）（2011AA02A209）；國家重點基礎研究發(fā)展計劃（973計劃）（2011CB710802）；國家自然科學基金（21176103）；江蘇省高校優(yōu)勢學科建設工程

宋 潔（1988—），女，河北邯鄲人，碩士研究生，研究方向：手性生物催化；王 棟（聯(lián)系人），副教授，E-mail：dwang@jiangnan.edu.cn