棘白菌素B提取液脫色工藝

鄒樹平，劉 苗，鐘 偉，牛 坤，姚黎棟，鄭裕國

（1.浙江工業(yè)大學(xué) 生物工程研究所 生物轉(zhuǎn)化與生物凈化教育部工程研究中心，浙江 杭州 310032；2.浙江震元制藥有限公司，浙江 紹興 312071）

棘白菌素B提取液脫色工藝

鄒樹平1，劉 苗1，鐘 偉1，牛 坤1，姚黎棟2，鄭裕國1

（1.浙江工業(yè)大學(xué) 生物工程研究所 生物轉(zhuǎn)化與生物凈化教育部工程研究中心，浙江 杭州 310032；2.浙江震元制藥有限公司，浙江 紹興 312071）

研究堿性陰離子交換樹脂WD-6對發(fā)酵棘白菌素B（ECB）提取液的脫色效果。通過對ECB提取液和ECB標(biāo)準(zhǔn)溶液的全波長掃描，確定ECB提取液中色素的最佳吸收波長為315 nm；考察了樹脂添加量、脫色溫度、搖床轉(zhuǎn)速和脫色時間對脫色率和ECB損失率的影響，獲得最佳脫色工藝：樹脂添加量4% （質(zhì)量分?jǐn)?shù)），脫色溫度30℃，搖床轉(zhuǎn)速150r/min，脫色時間100min。在此條件下，ECB提取液的脫色率可達(dá)88.3%，ECB損失率僅為4.8%。

棘白菌素B；脫色；離子交換樹脂

棘白菌素類抗生素是新一代臨床治療真菌感染的抗真菌藥物，該類抗生素能夠非競爭性抑制真菌細(xì)胞壁β-1，3-葡聚糖合成酶的活性，作用機(jī)制獨特，毒副作用低，且對一些唑類和兩性霉素B耐藥的真菌抗菌活性強(qiáng)［1］。目前已經(jīng)上市的棘白菌素類藥物有卡泊芬凈（caspofungin）、米卡芬凈（micafungin）和阿尼芬凈（anidulafungin）［2］。棘白菌素B（echinocandin B，ECB）是由構(gòu)巢曲霉（Aspergillus nidulans）發(fā)酵產(chǎn)生的一種次級代謝產(chǎn)物，是合成阿尼芬凈的前體化合物［3］。ECB分子式為C52H81N7O16，相對分子質(zhì)量為1 060.2，化學(xué)結(jié)構(gòu)式如圖1所示。

圖1 棘白菌素B結(jié)構(gòu)式Fig.1 Structure of echinocandin B

構(gòu)巢曲霉發(fā)酵生產(chǎn)ECB的周期較長，發(fā)酵后期有大量的色素產(chǎn)生［4］。ECB存在于構(gòu)巢曲霉菌絲體內(nèi)，用有機(jī)溶劑浸提ECB時，由于色素物質(zhì)的存在，提取液一般呈橙黃色。若不經(jīng)過脫色處理，不僅會降低后續(xù)產(chǎn)品的回收率及純度，還會影響最終產(chǎn)品的色澤［5］。張雪霞等［6］在提取ECB過程中，通過樹脂吸附解吸后，在解吸液中添加1%活性炭脫色，脫色不完全。Kery等［7］在用異丁醇萃取 ECB后，濃縮異丁醇相，用酸洗后加入活性炭脫色，可以使萃取液澄清，但ECB損失較大。張磊等［8］在濃縮液中加入有效組分2.5倍體積的Al2O3于20℃下脫色，雖然脫色效果良好，但使用的脫色劑Al2O3價格昂貴，難以工業(yè)化應(yīng)用。本文中筆者選用廣泛使用的堿性陰離子交換樹脂WD-6對ECB提取液進(jìn)行脫色研究，以期獲得良好的脫色效果。

1 材料與方法

1.1 儀器與材料

高效液相色譜，日本島津公司；酶標(biāo)儀，美谷分子儀器（上海）有限公司；Eppendorf 5810R型離心機(jī)，德國Eppendorf公司；蛋白層析儀，美國Bio-Rad公司。

ECB發(fā)酵菌絲體，浙江工業(yè)大學(xué)生物工程研究所ZJB09223構(gòu)巢曲霉發(fā)酵；ECB標(biāo)準(zhǔn)品，澳大利亞BioAustralis公司；WD-6堿性陰離子樹脂，安徽皖東樹脂有限公司；甲醇、乙腈（色譜純），中國百靈威試劑公司；其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2 ECB提取液的制備

將構(gòu)巢曲霉發(fā)酵液離心，收集菌絲體，稱取一定質(zhì)量菌絲體，按照m（菌絲體）∶V（乙醇）=1∶1.5加入乙醇溶液，于35℃下攪拌浸提2 h，總共浸提3次。收集乙醇浸提液，用蒸餾水將乙醇稀釋到體積分?jǐn)?shù)40%，加入預(yù)處理好的HP20大孔吸附樹脂吸附4 h，吸附完成后加入純乙醇解吸3 h，解吸后的ECB溶液，調(diào)pH為6，即為本實驗用到的樣品。

1.3 樹脂的預(yù)處理

將WD-6堿性陰離子樹脂用質(zhì)量分?jǐn)?shù)5%的NaCl溶液浸泡4 h，接著用蒸餾水反復(fù)洗滌，洗凈表面的NaCl，然后加入5%的NaOH溶液浸泡4 h，用蒸餾水反復(fù)洗滌，直到洗出液的pH為7，于60℃下烘干。

1.4 靜態(tài)和動態(tài)吸附實驗

靜態(tài)吸附實驗：在恒溫水浴搖床中進(jìn)行，測定WD-6樹脂吸附前后提取液中色素的吸光值以及ECB的濃度，計算提取液的脫色率和 ECB的損失率。

動態(tài)吸附實驗：在Bio-Rad蛋白層析柱中進(jìn)行，裝載WD-6樹脂8g，通過自動收集裝置，毎5mL流出液收集1次，實驗完成后需測定樣品收集液中色素的吸光值和ECB的濃度，計算提取液的脫色率和ECB的損失率，繪制脫色洗脫曲線圖。

1.5 分析方法

1.5.1 色度的測定

在波長為200～450 nm范圍內(nèi)對ECB提取液和ECB標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行對比掃描，以確定提取液中色素的最佳吸收波長。

1.5.2 脫色率的計算

提取液脫色率計算按式（1）進(jìn)行。

式中：A1為脫色前吸光值，A2為脫色后吸光值。

1.5.3 ECB濃度及損失率的計算

采用高效液相色譜法測定ECB的濃度，高效液相色譜條件參照文獻(xiàn)［9］。色譜柱：伊利特Hypersil ODS2 5 μm×4.6mm×250mm；檢測器為PDA；檢測波長222 nm；流動相V（甲醇）∶V（超純水）∶V（乙腈）=7∶2∶1；進(jìn)樣量20 μL；流速1mL/min；柱溫箱40℃。ECB的損失率按照式（2）計算。

式中：ρ1和 ρ2分別為脫色前、后 ECB質(zhì)量濃度（mg/L）。

1.5.4 平衡吸附量及平衡時溶液中色素濃度的測定［10］

當(dāng)吸附平衡后，單位質(zhì)量樹脂所吸附色素的量稱為平衡吸附量（g/g），用Qe表示，計算見式（3）；剩余色素的相對含量用C表示，其計算見式（4）。

2 結(jié)果與討論

2.1 ECB提取液色度的確定

取一定ECB提取液和ECB標(biāo)準(zhǔn)液，在波長范圍為200～450 nm范圍內(nèi)對樣品進(jìn)行掃描，結(jié)果如圖2所示。由圖2可知，有色素的提取液與標(biāo)準(zhǔn)液的吸光度最大差值在310～320 nm處，所以選取315 nm為提取液中色素的測定波長。

圖2 樣品和標(biāo)準(zhǔn)品全波長掃描Fig.2 Curves of wavelength scanning between sample and standard

2.2 樹脂添加量對脫色效果的影響

在脫色過程中，既要保證樹脂對色素盡可能大的吸附量，又要減少對ECB的吸附。取10mL ECB提取液，添加不同質(zhì)量的WD-6脫色樹脂，在30℃、150r/min條件下，靜態(tài)吸附3 h，結(jié)果如圖3所示。由圖3可知：樹脂添加量（質(zhì)量分?jǐn)?shù)）從2%增加到4%時，提取液脫色率也明顯提高；但當(dāng)樹脂添加量超過4%后，脫色率基本不變，這可能是樹脂對色素的吸附已達(dá)到平衡。而隨著樹脂添加量的增大，ECB損失率卻不斷上升，可能是樹脂對ECB仍有一定的吸附作用。因此，綜合考慮到脫色率和ECB損失率這2個因素，以4%作為WD-6樹脂的最適添加量。

2.3 溫度對脫色效果的影響

取10mL ECB提取液，添加質(zhì)量分?jǐn)?shù) 4% WD-6樹脂，搖床轉(zhuǎn)速為150r/min，在不同溫度下靜態(tài)吸附3 h，實驗結(jié)果如圖4所示。由圖4可以看出：隨著溫度的上升，脫色率緩慢上升。這可能是由于溫度上升后加速了分子擴(kuò)散的速度，對色素的吸附有利，從而提高脫色率［11］。溫度升高后，ECB的損失率也逐漸上升，一方面可能是由于溫度的升高加速了ECB與樹脂間的吸附作用；另一方面也可能是溫度的升高使得ECB部分降解，導(dǎo)致?lián)p失率上升。因此，綜合考慮，選擇30℃為最佳脫色溫度。

圖3 樹脂添加量對脫色的影響Fig.3 Effects of amount of WD-6 resin on decolouring rate

圖4 溫度對脫色效果的影響Fig.4 Effects of decolorization temperature on decolouring rate

2.4 搖床轉(zhuǎn)速對脫色效果的影響

取20mL ECB提取液，添加質(zhì)量分?jǐn)?shù)4%WD-6樹脂，恒溫水浴搖床溫度為30℃，搖床轉(zhuǎn)速分別為50、100、150和200r/min，在此條件下靜態(tài)吸附3 h，結(jié)果如圖7所示。由圖7可知，ECB的損失率并沒有太大變化。對于脫色率，當(dāng)搖床轉(zhuǎn)速在50～150r/min時，脫色率略有上升，而隨著轉(zhuǎn)速繼續(xù)增加，脫色率卻稍有下降，可能的原因是，當(dāng)搖床轉(zhuǎn)速提高后，ECB提取液與WD-6脫色樹脂呈高速分散狀態(tài)，導(dǎo)致二者交換吸附并不充分，故而脫色率反而有所下降。因此，選擇150r/min為脫色過程中的轉(zhuǎn)速。

圖5 轉(zhuǎn)速對脫色效果的影響Fig.5 Effects of rotate speed on decolouring rate

2.5 脫色時間對脫色效果的影響

對于固液之間的吸附反應(yīng)，達(dá)到吸附平衡過程需要一定的時間。一般吸附時間延長后，溶液中色素的濃度會越來越低，當(dāng)吸附劑表面與溶液中色素濃度相等，即吸附平衡時，吸附便不再發(fā)生［12］。取50mL提取液，添加質(zhì)量分?jǐn)?shù)4%WD-6樹脂，搖床轉(zhuǎn)速設(shè)置為150r/min，于30℃下靜態(tài)吸附6 h，每次間隔45min取樣，測定不同時間下色素的吸光值和溶液中剩余ECB濃度，并計算提取液脫色率和ECB損失率，結(jié)果如圖6所示。由圖6可以看出：在前100min脫色率緩慢增加，在吸附100min后吸附基本達(dá)到飽和，但ECB損失率隨時間延長繼續(xù)上升?？紤]到脫色效果以及ECB損失率這2個因素，確定脫色時間為100min。在此優(yōu)化條件下，ECB提取液脫色率為88.3%，ECB損失率僅為4.8%。

圖6 脫色時間對脫色效果的影響Fig.6 Effects of decolorization time on decolouring rate

2.6 脫色吸附等溫線

目前研究吸附平衡模型的方程主要有以下3種［13］。Henry型吸附模型的表達(dá)式：G=KC+b（K、b為常數(shù)）；Langmuir型吸附模型表達(dá)式：C/G=1/ab+ C/a（a、b為常數(shù)）；Freundlich型吸附模型表達(dá)式：lg G=K+Nlg C（K、N為常數(shù)）。

根據(jù)3種吸附等溫線公式，于30℃下對WD-6樹脂吸附ECB提取液中色素的實驗數(shù)據(jù)進(jìn)行擬合，其擬合方程和相關(guān)系數(shù)見表1。

表1 吸附等溫線的線性擬合結(jié)果Table 1 Result of linear model of adsorption isotherm line

由表1結(jié)果可知：3種吸附模型都可以描述WD-6樹脂對ECB提取液中色素的吸附，但是比較相關(guān)系數(shù)R2，該吸附更符合Henry模型。其擬合結(jié)果如圖5所示。由圖5可知：此吸附等溫式為線性，根據(jù)Henry模型的特點，說明該吸附是在低濃度下的吸附，并且吸附過程只存在單一分子的現(xiàn)象。

圖7 WD-6吸附樹脂的吸附等溫線Fig.7 Adsorption isotherm line of WD-6 resin

2.7 動態(tài)吸附實驗

準(zhǔn)確稱取經(jīng)過預(yù)處理的WD-6干樹脂8.0g，用濕法裝柱裝入蛋白層析柱中，樣品總共150mL。在室溫下，將流速設(shè)置為0.5mL/min進(jìn)行動態(tài)脫色實驗，每10min收集1管樣品，通過酶標(biāo)儀和高效液相色譜檢測樣品的吸光值和ECB的濃度，結(jié)果見圖8。由圖8可以看出：當(dāng)流出液體積越來越大時，其脫色率下降較快。當(dāng)提取液流出體積約80mL時，脫色率下降近一半；隨著流出液體積增大，脫色效果越來越差，而ECB的損失率在下降到一定階段后不再下降?？赡苁窃趧討B(tài)吸附過程中，樹脂與色素的接觸時間較短，使得色素不能完全被吸附。而WD-6樹脂對ECB有輕微吸附作用，隨著時間的延長，樹脂對ECB吸附飽和后，損失率不再升高。

圖8 ECB提取液動態(tài)脫色曲線Fig.8 Decolrization curves of echinocandin B extract

3 結(jié)論

研究堿性陰離子交換樹脂WD-6對發(fā)酵棘白菌素B（ECB）提取液的脫色效果。當(dāng)WD-6樹脂添加量為4%（質(zhì)量分?jǐn)?shù)）、脫色溫度為30℃、搖床轉(zhuǎn)速為150r/min、脫色時間為100min時，WD-6樹脂對ECB提取液的脫色率可達(dá)到88.3%以上，而ECB損失率僅為4.8%。說明WD-6樹脂能夠較好地吸附ECB提取液中的色素。對WD-6樹脂吸附ECB提取液中色素的吸附等溫線的研究表明，該吸附反應(yīng)符合Henry等溫吸附模型。

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（責(zé)任編輯 管 珺）

Decoloring of echinocandin B extraction

ZOU Shuping1，LIU Miao1，ZHONG Wei1，NIU Kun1，YAO Lidong2，ZHENG Yuguo1
（1.Engineering Research Center of Bioconversion and Biopurification of the Ministry of Education，Institute of Bioengineering，Zhejiang University of Technology，Hangzhou 310032，China；2.Zhejiang Zhenyuan Pharmaceutical Co.Ltd.，Shaoxing 312071，China）

Decoloring of echinocandin B（ECB）extract by ion exchange resin WD-6 was investigated. Through full wavelength scanning of ECB extract and ECB standard，best absorbance of pigment was determined at 315 nm.The effects of resin（WD-6 resin）content，decoloring temperature，rotation speed and adsorption time on decoloring and loss of ECB were studied.The optimal operation conditions were as follows：resin content 4%（w/w），decolourization temperature at 30℃，rotation speed 150r/min and adsorption time 100min.Under these conditions，the decolorization rate was above 88.3%，with ECB loss rate of 4.8%.

echinocandin B；decoloring；ion exchange resin

TQ465.5

A

1672-3678（2015）02-0098-05

10.3969/j.issn.1672-3678.2015.02.019

2014-03-20

國家重點基礎(chǔ)研究發(fā)展計劃（973計劃）（2011CB710806）；教育部博士點新教師基金（2012331712004）

鄒樹平（1980—），男，湖南常德人，博士，副教授，研究方向：微生物藥物發(fā)酵與產(chǎn)業(yè)化開發(fā)；鄭裕國（聯(lián)系人），教授，E-mail：zhengyg@ zjut.edu.cn