超濾離心在雙水相萃取技術(shù)中的應(yīng)用

孫　波，李海鑫，樊　慶，孫　盛，任　慶，孔慶敏，趙　曉

（東北農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院，哈爾濱　150030）

網(wǎng)絡(luò)出版時間2015-4-23 11:28:16

[URL]http://www.cnki.net/kcms/detail/23.1391.S.20150423.1128.008.html

?

超濾離心在雙水相萃取技術(shù)中的應(yīng)用

孫波，李海鑫，樊慶，孫盛，任慶，孔慶敏，趙曉

（東北農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院，哈爾濱150030）

網(wǎng)絡(luò)出版時間2015-4-23 11:28:16

[URL]http://www.cnki.net/kcms/detail/23.1391.S.20150423.1128.008.html

摘要：雙水相萃取技術(shù)作為新型分離技術(shù)日益受到重視，但由于萃取物與成相物質(zhì)分離難等限制其應(yīng)用。文章論述雙水相萃取技術(shù)與超濾離心技術(shù)的特點、原理及其應(yīng)用，分析兩種分離技術(shù)結(jié)合使用可能會出現(xiàn)的問題，重點闡述超濾離心在雙水相萃取技術(shù)中分離和回收產(chǎn)物時的工藝方法。

關(guān)鍵詞：雙水相萃??；超濾離心；分離;純化；回收

孫波,李海鑫,樊慶,等.超濾離心在雙水相萃取技術(shù)中的應(yīng)用[J].東北農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報, 2015, 46(4): 101-108.

雙水相萃取技術(shù)是一項高效的生物分離和純化技術(shù)，利用兩種在水溶液中互不相容的物質(zhì)建立雙相體系，根據(jù)被分離物質(zhì)自身特性及萃取條件不同促使物質(zhì)在雙相間產(chǎn)生不同分配行為，使目標產(chǎn)物達到分離目的[1]?？捎行Х蛛x純化蛋白質(zhì)

[2]、抗生素[3]、酶[4]、核酸[5]等多種生物分子，因其操作簡便、萃取條件溫和、易實現(xiàn)過程連續(xù)化、節(jié)能環(huán)保等優(yōu)點得到廣泛應(yīng)用。該技術(shù)在大規(guī)模工業(yè)化萃取實際應(yīng)用過程中存在的主要問題是目標產(chǎn)物如何從萃取相中高效分離、回收。通常雙水相萃取技術(shù)只能將目標產(chǎn)物提取到單一相系中但無法徹底從該相系中分離回收，限制雙水相萃取技術(shù)推廣應(yīng)用。

目前，利用離子交換色譜或凝膠過濾技術(shù)分離回收目標產(chǎn)物，存在操作步驟繁瑣，在多步操作中目標產(chǎn)物損失嚴重，成本較高等不足。利用超濾離心方法[6]解決上述問題具有很強的可操作性。超濾離心是一種可以借助離心力和超濾膜的過濾作用將兩種物質(zhì)同時進行分離與濃縮的有效方法，利用該方法可以將經(jīng)雙水相萃取后的目標產(chǎn)物與成相物質(zhì)有效分離。因此，將超濾離心技術(shù)與雙水相萃取技術(shù)進行整合，既可以解決雙水相萃取技術(shù)在實際應(yīng)用時出現(xiàn)的問題，又能拓寬超濾離心技術(shù)的應(yīng)用范圍。

目前，對超濾離心技術(shù)在雙水相萃取技術(shù)中應(yīng)用有一定研究[7]，但只限于簡單實驗方法提出，而沒有從實際操作中可能出現(xiàn)的問題以及如何合理解決角度進行論述。本文從超濾離心技術(shù)在雙水相萃取技術(shù)實際應(yīng)用角度對這兩項技術(shù)特點進行論述，并針對兩項技術(shù)在整合使用中可能出現(xiàn)問題進行分析與探討。

1　雙水相萃取技術(shù)

1.1雙水相萃取技術(shù)特點

雙水相萃取技術(shù)具有很強的實用性。①雙水相萃取技術(shù)操作簡單、分離效率高。雙水相兩相間界面張力很小，有利于相的分離和傳質(zhì)，能夠快速達到相平衡狀態(tài)，可通過改變試驗條件調(diào)節(jié)被分離組分在兩相間的分配行為[8]，提高目標產(chǎn)物分離效率。②雙水相萃取技術(shù)耗能少、制造成本低且不需要復(fù)雜的設(shè)備可實施大規(guī)模工業(yè)化萃取。制造成本主要用于成相物質(zhì)聚合物的一次性消耗上，如聚合物可回收重復(fù)利用將大幅降低原料成本。③雙水相體系對被分離組分無毒害。組成雙水相的原料通常是高聚物、無機鹽等物質(zhì)，對所萃取的生物物質(zhì)一般不會造成毒害作用，不會引起生物物質(zhì)的失活或變性，甚至還會起到穩(wěn)定和保護作用[9]。④雙水相萃取技術(shù)在實際應(yīng)用中對環(huán)境不會造成污染。構(gòu)成雙水相物質(zhì)是高聚物和無機鹽類，無毒害，不存在有機溶劑殘留問題，操作環(huán)境對人體無害，廢棄物不會污染環(huán)境。⑤雙水相萃取技術(shù)萃取過程可連續(xù)化操作并易于放大[10]。該技術(shù)各種參數(shù)可按比例放大[11]且不降低產(chǎn)物回收率。在保證目的蛋白與成相物質(zhì)有效分離條件下，雙水相萃取技術(shù)操作的連續(xù)化無需進行特殊處理可與后續(xù)操作工序直接銜接，有益于大規(guī)模處理樣品，可實現(xiàn)大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)。

1.2雙水相萃取技術(shù)的應(yīng)用

近年來，雙水相萃取技術(shù)在蛋白質(zhì)工程、發(fā)酵工程、生化制藥等領(lǐng)域得到廣泛應(yīng)用。

在蛋白質(zhì)工程方面，雙水相萃取技術(shù)對蛋白質(zhì)的分離主要是從細胞的破碎液中分離蛋白或者從其他蛋白中分離目標蛋白。Rodrigues等利用雙水相萃取技術(shù)從干酪乳清中分離純化α-乳白蛋白和β-乳球蛋白[12]，通過該技術(shù)可高效經(jīng)濟地將這兩種蛋白從廢棄干酪乳清中分離，起到資源再利用的作用。Zhang等采用PEG/Na2SO4雙水相體系從煙草發(fā)狀根培養(yǎng)基中提取蓖麻毒素B[13]，不僅可高效純化蓖麻毒素B，還對蓖麻毒素B起到穩(wěn)定保護的作用。Mohammadi[14]等利用PEG/Na2CO4雙水相體系從大腸桿菌細胞破碎液中分離純化出熒光假單胞菌重組體脯氨酸脫氫酶，效果顯著。Madhusudhan等利用雙水相萃取技術(shù)從面包酵母中純化乙醇脫氫酶[15]。Saravanan等采用兩種模式蛋白（卵白蛋白和肌紅蛋白）通過建立聚乙二醇-聚丙烯酸（PEG-PAA）雙水相體系研究雙水相萃取機制[16]。試驗研究表明，PEG富集在上相，PAA富集在下相。萃取過程中，隨著PEG分子量和溫度的增加，兩種模式蛋白的分離效果呈下降趨勢；隨著pH和NaCl濃度的增加，兩種蛋白的分離效果顯著增強。試驗結(jié)果表明，采用PEG4000-PAA體系，在20℃、pH 8.0、1 mol·L-1NaCl的條件下，卵白蛋白和肌紅蛋白的回收率分別為87.4%和95.2%。Malpiedi等采用PEG1450-Na3C6H5O7·2H2O雙水相體系中pH 8.2、相體積比低至0.5的條件下，從牛胰腺中分離純化胰蛋白酶原，胰蛋白酶原的回收率和純化倍數(shù)明顯增加，回收率可達84%、純化倍數(shù)可達5倍[17]。有學(xué)者將雙水相萃取技術(shù)與其他技術(shù)相結(jié)合，進行生物提取的研究。如Boeris等將雙水相萃取與聚電解質(zhì)沉淀技術(shù)結(jié)合[18]，從牛皺胃勻漿中分離提取胃蛋白酶。

在發(fā)酵工程方面，李志剛利用新型雙水相萃取體系萃取發(fā)酵液中的1，3-丙二醇和2，3-丁二醇，并利用雙水相的下相代替氫氧化鈉堿液調(diào)節(jié)1，3-丙二醇和2，3-丁二醇發(fā)酵過程中的pH值，試驗效果顯著[19]。Jiang等利用雙水相萃取技術(shù)解決2，3 -丁二醇提取的關(guān)鍵問題[20]，即細胞和生物大分子從發(fā)酵液中被除去，2，3 -丁二醇的回收率可達98.13%。Naganagouda等利用PEG-磷酸鹽雙水相體系提取并純化發(fā)酵液中的米曲霉α-半乳糖苷酶[21]，在pH 5.0的條件下，通過12% PEG4000和11.9%磷酸鹽組成的雙水相體系純化米曲霉α-半乳糖苷酶，米曲霉α-半乳糖苷酶分配到下相，回收率為87.71%，純化倍數(shù)達3.6倍。Yang等從嗜熱擬青霉固態(tài)發(fā)酵中分離提取耐熱木聚糖酶[22]，利用12.5%PEG4000-25%（NH4）2SO4雙水相體系，pH 7.2條件下進行雙水相萃取，木聚糖酶富集于PEG相中，而雜蛋白等其他物質(zhì)被分離到（NH4）2SO4鹽相中，木聚糖酶的回收率為98.7%、純化倍數(shù)為5.54。Ooi等利用雙水相萃取技術(shù)從發(fā)酵液中純化鼻疽桿菌脂肪酶[23]，試驗條件PEG6000-磷酸鉀鹽雙水相體系，相比2.7，添加1%的NaCl，pH 7.0，鼻疽桿菌脂肪酶的回收率為93%、純化倍數(shù)為12.42。

在藥物方面，Bi等利用雙水相萃取技術(shù)從黃苓提取物中分離純化黃苓苷，黃苓苷提取率達到90%以上[24]。謝濤等利用雙水相萃取技術(shù)從三七浸液中分離純化三七總皂苷，PEG分子質(zhì)量為4 000，pH 4.2~5.0，PEG與K2HPO4比例按1?1組建雙水相體系，三七總皂苷的回收率達到96%，在上相的分配系數(shù)達到14.2[25]。趙愛麗等利用雙水相體系分離純化黃苓苷，黃苓苷的萃取率可達98.6%[26]。石慧等利用PGE-（NH4）2SO4雙水相體系萃取加楊葉總黃酮，萃取條件為PEG濃度為25%，分子質(zhì)量為400，（NH4）2SO4的濃度為12%，pH為9.0，添加NaCl的量為3%，粗提液為3mL，溫度為25℃[27]。彭勝等利用PEG4000-D40雙水相體系從杜仲葉中分離純化桃葉珊瑚甙，粗提取物總桃葉珊瑚甙的純度為8.75%，經(jīng)雙水相純化后，純度提高到48.67%，萃取效果很明顯[28]。

2　超濾離心技術(shù)

2.1超濾離心技術(shù)特點

超濾離心方法[31]：設(shè)備簡單，無復(fù)雜操作過程，分離速度快，高效節(jié)能；所用超濾離心管內(nèi)部具有垂直結(jié)構(gòu)濾膜，這種結(jié)構(gòu)的濾膜與離心力的方向平行，可降低濃差極化現(xiàn)象；離心管和超濾管外壁帶有刻度，便于觀察被分離物質(zhì)體積的變化；使用樣品少，便于檢測需要；超濾離心管經(jīng)清洗后可重復(fù)利用，節(jié)約成本；分離過程不會對生物分子的活性造成破壞，回收率高，重現(xiàn)性好。

2.2超濾離心技術(shù)的應(yīng)用

Hammond等將超濾離心方法與透析相結(jié)合，從血漿中純化類固醇[32]，2000年后，應(yīng)用超濾離心方法對物質(zhì)進行濃縮、純化被廣泛應(yīng)用，將超濾離心方法與其他檢測技術(shù)整合，使該方法更具實用性。

2.2.1超濾離心在醫(yī)藥領(lǐng)域中的應(yīng)用

目前，超濾離心技術(shù)在醫(yī)藥方面應(yīng)用較為廣泛。超濾離心常用于分離血液中的低分子物質(zhì)，便于對疾病的診斷。人體血液蛋白質(zhì)組中低分子物質(zhì)對檢測疾病的起因具有重要作用，Greening等利用超濾離心方法分離、富集這種低分子物質(zhì)，用于疾病的檢測[33]。Zheng等利用截留分子質(zhì)量為10 ku的超濾離心管鑒定血清中的內(nèi)源性肽[34]。超濾離心法可以作為細胞裂解物樣品的有效預(yù)處理方法。Koichi等將超濾離心方法與LC-MS/MS檢測法結(jié)合[35]，利用超濾離心方法從人體血液、魚組織、雞肉和鮮奶中純化新生霉素，通過LC-MS/MS檢測法測得回收率。孟松利用100 nm和0.22 μm孔徑的濾膜去除大于100 nm的顆粒及可能在離心過程中污染的細菌，應(yīng)用超速離心及超濾離心方法從IL-10-DC的上清液中成功分離純化出高純度的無菌脂質(zhì)雙層膜性囊泡[36]。彭燕蓁利用超濾離心方法對PDT和凍融人卵巢癌細胞裂解物標本進行預(yù)處理，以利后續(xù)蛋白質(zhì)的鑒定工作順利進行[37]。王淑娟采用超濾離心方法測定TP-LP的包封率，計算產(chǎn)品的回收率，并且以包封率為指標，探究該方法的可行性[38]。根據(jù)可行性分析結(jié)果，與其他測定包封率的方法相比，超濾離心法能夠有效回收游離藥物和脂質(zhì)體，回收率較高，因此采用超濾離心法對雷公藤甲素脂質(zhì)體的包封率進行測定。超濾離心方法除了需要超濾離心管和離心機以外，對設(shè)備要求不高且方法簡單、節(jié)省時間，為超濾離心法測定脂質(zhì)體的包封率提供了有利條件。劉立中利用超濾離心方法測定多西紫杉醇泡囊的包封率，將多西紫杉醇泡囊稀釋后置于截留分子量為10 ku的Millipore超濾離心管中，在3 000 r·min-1下離心15 min，取超濾液測定多西紫杉醇泡囊的含量，計算出包封率[39]。

2.2.2超濾離心在生物工程中的應(yīng)用

在生物工程領(lǐng)域中，利用分子技術(shù)檢測某些物質(zhì)中微量組分的準確含量時，往往會因為該組分含量太低而造成檢測困難。因此，可以根據(jù)各組分的分子量差異，使用超濾離心方法將目標組分分離并起到濃縮作用，從而有利于后續(xù)測定。Jones等利用超濾離心方法先將被檢測樣濃縮，濃縮液的濃度可達到85 %，方便病毒檢測工作的后續(xù)進行[40]。王林在腸三葉因子受體的分離與鑒定過程中，應(yīng)用超濾離心純化重組蛋白，可利用純化后的蛋白進行后續(xù)研究[41]。Woon-Won Jung等利用超濾離心方法將人體血漿中小分子血漿蛋白（LMPP）分離純化，結(jié)合HPLC對LMPP進行定量分析[42]。李淑營利用超濾離心方法處理丙酮沉淀后的噬菌體聚糖酶，收集超濾液[43]。呂靜采用鹽析的方法提取A型產(chǎn)氣莢膜梭菌外毒素蛋白，再進行透析脫鹽，然后利用超濾離心管兩次純化粗提的蛋白，通過對純化前后毒素蛋白含量測定以及SDS-PAGE中蛋白的測定，確定使用超濾離心管能夠獲得較高純度的α-毒素蛋白，其含量約為粗提蛋白含量的1/5[44]。盛小波利用不同截留分子質(zhì)量的超濾離心管，對具有最強抗氧化活性的Alcalase水解產(chǎn)物進行超濾離心，使水解產(chǎn)物被分離成三個不同組分，再對不同組分的性質(zhì)進行研究，通過此方法將樣品分離成不同組分[45]。

2.2.3超濾離心在雙水相分離純化蛋白質(zhì)中的應(yīng)用

目前超濾離心方法主要用于樣品的前處理，以便后續(xù)分析、檢測工作，而在終產(chǎn)物的分離、回收方面研究不多。根據(jù)超濾離心方法的特點，加之其在實際應(yīng)用中的便捷性，可將其與雙水相萃取技術(shù)整合應(yīng)用到蛋白質(zhì)的分離與回收中，特別是用在解決雙水相萃取的蛋白質(zhì)無法與成相物質(zhì)分離，限制雙水相萃取技術(shù)進一步發(fā)展的瓶頸問題上，即將經(jīng)過雙水相萃取出的蛋白進一步分離回收，這樣既可以解決雙水相萃取技術(shù)在應(yīng)用上出現(xiàn)的問題，又可擴大超濾離心方法的應(yīng)用范圍。

在雙水相萃取技術(shù)領(lǐng)域中，利用超濾離心方法進行后續(xù)產(chǎn)物的分離回收，如Patil等將超濾離心方法與雙水相萃取技術(shù)相結(jié)合，將經(jīng)雙水相萃取出的藻藍蛋白與成相物質(zhì)分離，得到高純度藻藍蛋白[6]。Srinivas等利用雙水相萃取技術(shù)提取出番薯屬植物過氧化物酶，然后采用超濾離心方法將該酶回收[7]。超濾離心方法分離物質(zhì)時簡便快捷，與雙水相萃取技術(shù)相結(jié)合，有利于拓寬其自身的應(yīng)用領(lǐng)域，提高雙水相萃取技術(shù)在蛋白質(zhì)的分離純化方面的實用性。

2.2.4超濾離心用于雙水相萃取生物組分的工藝流程圖

結(jié)果見圖1。

圖1　超濾離心用于雙水相萃取技術(shù)的工藝流程Fig. 1　 Technological processes of centrifugation ultrafiltration applying in aqueous two-phase extraction technology

3　超濾離心在雙水相萃取技術(shù)應(yīng)用中應(yīng)注意的問題

3.1超濾離心管的使用

超濾離心管的前處理：超濾離心管的超濾膜上含有微量甘油，在使用前需要用緩沖液或超純水清洗?？捎?.1 mol·L-1的NaOH溶液清洗后，再用超純水清洗，清洗時可使用離心機低轉(zhuǎn)速離心。

3.2影響超濾離心效果的因素

超濾離心方法借助離心力和濾膜的濾過作用使蛋白質(zhì)達到分離目的，影響超濾離心的因素涉及到離心時間、離心轉(zhuǎn)速、濾膜的截留分子質(zhì)量。另一方面，由于被分離蛋白的混合液是具有一定粘性的聚乙二醇（PEG）溶液，混合液濃度對超濾離心的效果也具有一定影響。

3.2.1超濾膜截留分子質(zhì)量對超濾離心效果的影響

在其他條件相同的情況下，選擇不同截留分子質(zhì)量的超濾膜對混合樣品進行超濾離心，通過離心后超濾液的體積判斷超濾膜截留分子質(zhì)量對超濾離心效果的影響，結(jié)果見圖2。

圖2　超濾膜截留分子質(zhì)量對超濾效果的影響Fig. 2　 Effects of the MWCO of centrifugal ultrafiltration on results

由圖2可以看出，在超濾離心時間相同的情況下，不同截留分子質(zhì)量的超濾離心管中超濾液的體積不同，對于本樣品，從超濾液體積的變化情況看，使用截留分子質(zhì)量為30 ku的超濾膜超濾效果最好。截留分子質(zhì)量較小時，無論小分子還是大分子都無法透過超濾膜進入超濾管中，當截留分子質(zhì)量過大時，大分子就會堆積或附著在超濾膜上造成濃差極化現(xiàn)象，從而使小分子蛋白無法透過超濾膜。一般情況下，選擇的濾膜截留分子質(zhì)量要比透過的目標產(chǎn)物大5~10倍較為適合。

3.2.2超濾離心轉(zhuǎn)速對超濾離心效果的影響

超濾離心是借助離心力的作用，促進小分子組分透過超濾膜，從而達到分離的目的。離心轉(zhuǎn)速越大被分離組分質(zhì)獲得的離心力越大，分離效果應(yīng)越好。但是，由于轉(zhuǎn)速過高會損壞超濾膜，會造成分離不徹底，甚至導(dǎo)致分離工作無法進行。另一方面，隨著離心轉(zhuǎn)速的增加，小分子組分會更易透過超濾膜。但從能耗角度來講，離心機轉(zhuǎn)速越高耗能越大，所以，在目標產(chǎn)物達到有效分離目的情況下，控制合適的離心轉(zhuǎn)速十分必要。

3.2.3超濾離心時間對超濾離心效果的影響

超濾離心時間的延長，被分離組分承受的作用力具有一定的持續(xù)性，隨著作用力持續(xù)時間延長，被分離組分更易透過超濾膜，達到分離目的。離心時間越長消耗能量越多，當增加電能與分離效果明顯不成比例，不利節(jié)能降耗。因此，選擇合適的超濾離心時間對超濾離心效果和節(jié)能方面很重要。

3.2.4質(zhì)量濃度對超濾離心效果的影響

要使目標產(chǎn)物從混合液中分離出來，混合液質(zhì)量濃度至關(guān)重要?；旌弦嘿|(zhì)量濃度太小時，分離的目標產(chǎn)物含量較少，不利于回收，并且在等量被處理樣的條件下會增加超濾離心的次數(shù)，不利于節(jié)能；質(zhì)量濃度太大時，會造成超濾膜的濃差極化現(xiàn)象，使被分離組分無法正常透過超濾膜，分離作用不徹底。

3.3濃差極化現(xiàn)象

超濾膜的濃差極化現(xiàn)象主要是在壓力作用下，小分子物質(zhì)透過膜，而大分子物質(zhì)被截留，于是在膜的表面形成物質(zhì)積累，膜表面附近的溶液濃度升高，造成膜孔堵塞，進而導(dǎo)致膜的通透量下降[46]。在超濾離心過程中濃差極化現(xiàn)象不可避免，但可通過條件控制盡量降低濃差極化程度。

①從超濾膜結(jié)構(gòu)設(shè)計角度看，當離心力與膜孔處于平行狀態(tài)時，可以促進物質(zhì)透過濾膜，降低膜的濃差極化。

②為克服濃差極化，調(diào)整被分離組分的質(zhì)量濃度，被分離組分經(jīng)過一定的稀釋，使小分子物質(zhì)質(zhì)易于流出，膜內(nèi)外兩側(cè)溶液的質(zhì)量濃度相同，從而避免濃差極化。

③在超濾離心的過程中，離心轉(zhuǎn)速越大，被分離組分承受的離心力越大，物質(zhì)在管內(nèi)的流速增大，膜面的流速也相應(yīng)增高，剪切力也相應(yīng)增大；同時提高了對流傳質(zhì)系數(shù)，降低物質(zhì)在膜表面的堆積量，進而減少膜面的濃差極化現(xiàn)象。離心轉(zhuǎn)速過大也會加重膜的濃差極化，這是由于轉(zhuǎn)速越大，物質(zhì)承受的壓力增加，不利于膜面高濃度物質(zhì)的擴散。因此，超濾離心過程中要選擇合適的離心轉(zhuǎn)速。

3.4被分離物質(zhì)的回收

經(jīng)超濾離心處理后，目標產(chǎn)物與成相物質(zhì)達到分離的目的，前者為濃縮液，后者為超濾液。超濾液直接倒出即可收集。濃縮液回收有兩種方法：①濃縮液不是很粘稠的可以直接用移液器吸取并回收。②粘稠的濃縮液容易吸附在濾膜上，可將超濾管倒置于清潔的離心管中放入離心機低轉(zhuǎn)速離心處理，如圖3所示。

圖3　濃縮液的回收Fig. 3　 Recovery of concentrate

3.5超濾離心管重復(fù)利用

超濾離心管的價格比普通離心管高幾十倍，使用超濾離心管時要考慮重復(fù)多次使用問題。超濾離心管使用后，濾膜上必然會殘留一些物質(zhì)，影響重復(fù)使用。根據(jù)筆者經(jīng)驗，可以采用如下方法解決：使用一次的膜用超純水沖洗幾遍后，在超濾管中加入適量超純水，放入離心機中低轉(zhuǎn)離心2~3次即可。如果多次使用，可以用0.1 mol·L-1NaOH溶液浸泡一天，然后用離心機低轉(zhuǎn)速離心，再使用超純水離心清洗。超濾離心管長期不用可以在管內(nèi)加滿超純水，4℃保存，也可用20 %的乙醇浸泡保存，但是乙醇浸泡會使濾膜截留分子質(zhì)量增加，不建議用乙醇浸泡。另外，重復(fù)多次使用超濾離心管，要控制離心轉(zhuǎn)速，轉(zhuǎn)速過高會使超濾離心管壁破損，影響使用壽命。

4　結(jié)論

超濾離心方法用于雙水相萃取技術(shù)后續(xù)產(chǎn)物的分離與回收有利于雙水相萃取技術(shù)的廣泛應(yīng)用，同時也擴大了這兩種分離技術(shù)的應(yīng)用領(lǐng)域。

[參考文獻]

[1]Garai D, Kumar V. Aqueous two phase extraction of alkaline fungal xylanase in PEG/Phosphate system: Optimization by Box-Behnken design approach[J]. Biocatalysis and Agricultural Biotechnology, 2013.

[2]劉俊果.人血清白蛋白在雙水相法體系中的分配規(guī)律研究[J].煤炭與化工, 2013, 36(4): 35-37.

[3] Zhang W, Zhang G, Han J, et al. Phase equilibrium and chloramphenicol partitioning in aqueous two-phase system composed of 1-hydroxylhexyl-3-methylimidazolium chloride-salt[J]. Journal of Molecular Liquids, 2014, 193: 226-231.

[4]楊建軍,馬曉迅.雙水相系統(tǒng)分離純化南極假絲酵母脂肪酶[J].化學(xué)工程, 2009, 37(5): 49-52.

[5]Luechau F, Ling T C, Lyddiatt A. Selective partition of plasmid DNA and RNA from crude Escherichia coli cell lysate by aqueous two-phase systems[J]. Biochemical Engineering Journal, 2011, 55 (3): 230-232.

[6]Patil G, Raghavarao K. Aqueous two phase extraction for purification of C-phycocyanin[J]. Biochemical Engineering Journal, 2007, 34(2): 156-164.

[7]Srinivas N D, Barhate R S, Raghavarao K. Aqueous two-phase extraction in combination with ultrafiltration for downstream processing of Ipomoea peroxidase[J]. Journal of Food Engineering, 2002, 54(1): 1-6.

[8]Diederich P, Amrhein S, H?mmerling F, et al. Evaluation of PEG/phosphate aqueous two-phase systems for the purification of the chicken egg white protein avidin by using high-throughput techniques[J]. Chemical Engineering Science, 2013, 104: 945-956.

[9]Lopes A M, Magalh?es P O, Mazzola P G, et al. Green fluorescent protein extraction and LPS removal from Escherichia coli fermentation medium using aqueous two-phase micellar system [J]. Separation and Purification Technology, 2011, 81(3): 339-346.

[10]Espitia-Saloma E, Vázquez-Villegas P, Aguilar O, et al. Continuous aqueous two-phase systems devices for the recovery of biological products[J]. Food and Bioproducts Processing, 2013.

[11]徐長波.雙水相萃取藻藍蛋白與藻藍蛋白微囊化研究[D].唐山:河北理工大學(xué), 2010.

[12]Rodrigues L R, Venancio A, Teixeira J A. Partitioning and separation of α-lactalbumin and β-lactoglobulin in polyethylene glycol/ammonium sulphate aqueous two-phase systems[J]. Biotechnology Letters, 2001, 23(22): 1893-1897.

[13]Zhang C, Medina-Bolivar F, Buswell S, et al. Purification and stabilization of ricin B from tobacco hairy root culture medium by aqueous two-phase extraction[J]. Journal of Biotechnology, 2005, 117(1): 39-48.

[14]Mohammadi H S, Omidinia E. Process integration for the recovery and purification of recombinant Pseudomonas fluorescens proline dehydrogenase using aqueous two-phase systems[J]. Journal of Chromatography B, 2013, 929: 11-17.

[15]Madhusudhan M C, Raghavarao K, Nene S. Integrated process for extraction and purification of alcohol dehydrogenase from Baker's yeast involving precipitation and aqueous two phase extraction[J]. Biochemical Engineering Journal, 2008, 38(3): 414-420.

[16]Saravanan S, Rao J R, Nair B U, et al. Aqueous two-phase poly (ethylene glycol)-poly (acrylic acid) system for protein partitioning: Influence of molecular weight, pH and temperature[J]. Process Biochemistry, 2008, 43(9): 905-911.

[17]Malpiedi L P, Romanini D, Picó G A, et al. Purification of trypsinogen from bovine pancreas by combining aqueous twophase partitioning and precipitation with charged flexible chain polymers[J]. Separation and Purification Technology, 2009, 65(1): 40-45.

[18]Boeris V, Spelzini D, Farruggia B, et al. Aqueous two-phase extraction and polyelectrolyte precipitation combination?A simple and economically technologies for pepsin isolation from bovine abomasum homogenate[J]. Process Biochemistry, 2009, 44(11): 1260-1264．

[19]李志剛.發(fā)酵液中1, 3-丙二醇和2, 3-丁二醇的雙水相萃取研究[D].大連:大連理工大學(xué), 2012.

[20]Jiang B, Li Z G, Dai J Y, et al. Aqueous two-phase extraction of 2, 3-butanediol from fermentation broths using an ethanol/phosphate system[J]. Process Biochemistry, 2009, 44(1): 112-117.

[21]Naganagouda K?Mulimani V H．Aqueous two-phase extraction (ATPE)?An attractive and economically viable technology for downstream processing of Aspergillus oryzae α-galactosidase[J]. Process Biochemistry, 2008, 43(11): 1293-1299.

[22]Yang S, Huang Z, Jiang Z, et al. Partition and purification of a thermostable xylanase produced by Paecilomyces thermophila in solid-state fermentation using aqueous two-phase systems[J]. Process Biochemistry, 2008, 43(1): 56-61.

[23]Ooi C W, Tey B T, Hii S L, et al. Direct purification of Burk holderia pseudomallei lipase from fermentation broth using aqueous two-phase systems[J]. Biotechnology and Bioprocess Engineering, 2009, 14(6): 811-818．

[24]Bi P, Chang L, Mu Y, et al. Separation and concentration of baicalin from Scutellaria Baicalensis Georgi extract by aqueous two-phase flotation[J]. Separation and Purification Technology, 2013, 116: 454-457.

[25]謝濤,廖安平,易元龍,等.雙水相萃取三七中三七皂苷的研究[J].中藥材, 2008, 31(4): 535-537.

[26]趙愛麗,陳曉青,蔣新宇.應(yīng)用雙水相萃取法分離黃芩苷的研究[J]．中成藥, 2008, 30(4): 498-501.

[27]石慧,陳媛梅. PEG/（NH4）2SO4雙水相體系在加楊葉總黃酮萃取分離中的應(yīng)用[J]．現(xiàn)代生物醫(yī)學(xué)進展, 2008, 8(5): 854.

[28]彭勝,彭密軍,卜曉英,等.雙水相體系萃取分離杜仲葉中桃葉珊瑚甙的研究[J].天然產(chǎn)物研究與開發(fā), 2010, 22(2): 264-267.

[29]鄧凡政,石影,張廣軍.聚乙二醇-硫酸鈉-硫氰酸鉀體系中Co（Ⅱ）、Ni（Ⅱ）、Mo（Ⅵ）的萃取分離研究[J]．稀有金屬, 1998(3):

[30]卓馨,張莉,石影.雙水相萃取法分離鈹（Ⅱ）、鐵（Ⅲ)與鐵（Ⅱ）、鉻（Ⅲ）、錳（Ⅱ）、鋁（Ⅲ）[J]．理化檢驗, 2007, 43(4): 61-63．

[31]劉曉飛,高學(xué)軍,姚永豪,等.牛初乳sIgA分離純化及其檢測方法的研究進展[J].東北農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報, 2008(10): 131-135.

[32]Hammond G L, Nisker J A, Jones L A, et al. Estimation of the percentage of free steroid in undiluted serum by centrifugal ultrafiltration-dialysis[J]．Journal of Biological Chemistry, 1980, 255(11): 5023-5026.

[33]Greening D W, Simpson R J．A centrifugal ultrafiltration strategy for isolating the low-molecular weight (≤25K) component of human plasma proteome[J]．Journal of Proteomics, 2010, 73(3): 637-648.

[34]Zheng X, Baker H, Hancock W S．Analysis of the low molecular weight serum peptidome using ultrafiltration and a hybrid ion trap-Fourier transform mass spectrometer[J]. J Chromatogr A, 2006, 1120(1-2): 173-184.

[35]Inoue K, Nitta S, Hino T, et al. LC-MS/MS and centrifugal ultrafiltration method for the determination of novobiocin in chicken?fish tissues. milk and human serum[J]. Journal of Chromatography B, 2009, 877(4): 461-464.

[36]孟松. IL-10處理的樹突狀細胞分泌的exosomes對實驗性大鼠腸炎的治療作用[D].南京:南京醫(yī)科大學(xué), 2010.

[37]彭燕蓁．光動力學(xué)人卵巢癌細胞裂解物的免疫源性及比較蛋白質(zhì)組學(xué)研究[D].北京:中國協(xié)和醫(yī)科大學(xué), 2005．

[38]王淑娟.雷公藤甲素脂質(zhì)體的制備及質(zhì)量的初步研究[D].揚州:揚州大學(xué), 2010.

[39]劉立中.多西紫杉醇泡囊的制備[D].廣州:廣東藥學(xué)院, 2009.

[40]Jones T H, Brassard J, Johns M W, et al. The effect of pretreatment and sonication of centrifugal ultrafiltration devices on virus recovery[J]. Journal of Virological Methods, 2009, 161(2): 199-204.

[41]王林.腸三葉因子受體的分離、鑒定及其生物信息學(xué)分析[D].重慶:第三軍醫(yī)大學(xué), 2009.

[42]Jung W W, Phark S, Oh S, et al. Analysis of low molecular weight plasma proteins using ultrafiltration and large gel two-dimensional electrophoresis[J]. Proteomics, 2009, 9(7): 1827-1840．

[43]李淑營.噬菌體聚糖酶及其酶解產(chǎn)物的制備及性質(zhì)研究[D].青島:中國海洋大學(xué), 2011.

[44]呂靜.產(chǎn)氣莢膜梭菌外毒素生產(chǎn)發(fā)酵工藝及其類毒素油乳劑疫苗的研究[D].泰安:山東農(nóng)業(yè)大學(xué), 2009.

[45]盛小波.超高壓處理對牛乳清蛋白水解及其產(chǎn)物抗氧化活性的影響[D].北京:中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院, 2011.

[46]Déon S, Dutournié P, Fievet P, et al. Concentration polarization phenomenon during the nanofiltration of multi-ionic solutions: Influence of the filtrated solution and operating conditions[J]. Water Research, 2013, 47(7): 2260-2272.

Sun Bo, Li Haixin, Fan Qing, et al. Application of ultra-filtration on aqueous two-phase extraction technique[J]. Journal of Northeast Agricultural University, 2015, 46(4): 101-108. (in Chinese with English abstract)

Application of ultra-filtration on aqueous two-phase extraction

technique

/SUN Bo, LI Haixin, FAN Qing, SUN Sheng, REN Qing, KONG Qingmin, ZHAOXiao(School of Food Science and Technology, Northeast Agricultural University, Harbin 150030, China)

Abstract:Aqueous two-phase extraction technique is valued as a novel separation technique gradually. But it is difficult to separate extract and phase matter limiting the development of aqueous two-phase extraction technique. In this paper the characteristic principle and application of aqueous two-phase extraction and ultra-filtration are discussed. We analyze the problems caused by the combination of two techniques and focus on ultra-filtration in the processes of separation and recovery of the product in aqueous two-phase extraction technique.

Key words:aqueous two-phase extraction; ultra-filtration; separation; purification;recovery

作者簡介：孫波（1962-），男，副教授，碩士，研究方向為食品微生物與發(fā)酵工程技術(shù)。E-mail: bosun1962@163. com

基金項目：國家自然科學(xué)基金項目（31470094）

收稿日期：2014-11-04

文章編號：1005-9369（2015）04-0101-08

文獻標志碼：A

中圖分類號：TS252.1