復(fù)方中藥對山女鱒受精卵水霉病防治效果的研究

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復(fù)方中藥對山女鱒受精卵水霉病防治效果的研究

李紹戊，劉紅柏*

（中國水產(chǎn)科學(xué)研究院黑龍江水產(chǎn)研究所，哈爾濱150070）

摘要：文章對5種自組復(fù)方中藥的2種提取方法2種消毒濃度，對山女鱒受精卵孵化期間水霉病防治效果進行篩選研究。采用水煎法及水煎+醇提混合法對復(fù)方中藥有效成分進行提取，并設(shè)置正常劑量和稀釋消毒組對5種復(fù)方中藥的消毒效果進行比較研究。在10℃流水養(yǎng)殖條件下，將濃縮的藥液加入吊瓶中，逐滴加入流水混勻，平列槽中試驗魚卵藥液浸泡約40 min。結(jié)果表明，5種復(fù)方中藥中，復(fù)方A水煎劑正常消毒劑量組能顯著提高受精卵的發(fā)眼率，降低水霉菌感染造成的死亡，是適用于山女鱒受精卵孵化期間防治水霉感染的中藥制劑。

關(guān)鍵詞：復(fù)方中藥；山女鱒；受精卵；水霉菌

網(wǎng)絡(luò)出版時間2015-4-23 9:28:01

[URL]http://www.cnki.net/kcms/detail/23.1391.S.20150423.0928.001.html

李紹戊,劉紅柏.復(fù)方中藥對山女鱒受精卵水霉病防治效果的研究[J].東北農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報, 2015, 46(4): 89-93.

水霉?。⊿aprolegniasis）又稱白毛病、膚霉病，是淡水養(yǎng)殖中一種常見的真菌寄生性疾病。引起水產(chǎn)動物水霉病的病原體目前已發(fā)現(xiàn)有10多種[1]，常見多為茸鞭生物界（Stramenopila）卵菌門（Oomveota）水霉（Saprolegnia）和棉霉（Achlya）兩個屬中的一些種類[2]。水霉病流行范圍廣[3]，對寄主沒有嚴格的選擇性，一年四季（特別是晚冬和初春季節(jié)）幾乎所有水產(chǎn)動物[4-6]和卵[7]均可被感染，為淡水養(yǎng)殖帶來重大經(jīng)濟損失，嚴重阻礙水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)健康發(fā)展[8]。

山女鱒（Oncorhynchus masou masou），是日本櫻鱒（馬蘇大馬哈）的遺傳型陸封種[9]，原產(chǎn)于日本，屬鮭形目（Salmoniformes）、鮭科（Salmonidae）、大麻哈魚屬（Oncorhynchus）。其體態(tài)優(yōu)美，色彩典雅，肉質(zhì)細嫩，營養(yǎng)豐富，具有極高的觀賞及經(jīng)濟價值，我國于1996年首次從日本引進該魚魚卵后[10]，對其養(yǎng)殖技術(shù)及生長特性進行研究[9]。近年山女鱒養(yǎng)殖規(guī)模和產(chǎn)量迅速增加，但各種頻發(fā)的病害特別是產(chǎn)卵后親魚及孵化期間受精卵的水霉感染危害嚴重。

中草藥具有天然高效、經(jīng)濟安全等優(yōu)點，含有豐富的礦物質(zhì)、維生素、蛋白質(zhì)及生物堿、甾醇類、甙類等生物活性物質(zhì)[11]，作為植物次生代謝產(chǎn)物豐富，是作用于多種靶點的化合物組合庫[12]，能有效改善生物體內(nèi)環(huán)境[13]，提高機體免疫力[14-15]及營養(yǎng)狀況[16-17]，本試驗選取自組中藥復(fù)方對山女鱒卵進行消毒，篩選適用于防治山女鱒受精卵孵化期間水霉感染的中草藥消毒劑，為中草藥在山女鱒水霉病防治中的應(yīng)用提供科學(xué)數(shù)據(jù)。

1　材料與方法

1.1受精卵及孵化條件

復(fù)方中藥對山女鱒受精卵消毒試驗在中國水產(chǎn)科學(xué)研究院黑龍江水產(chǎn)研究所渤海冷水性魚類實驗站進行。隨機選取山女鱒同批受精卵32 000粒，平均分為16組，每組2個平行。

將受精卵放入平列槽中流水孵化，孵化水溫為7.3~10.8℃，平均水溫為10.3℃，溶解氧為6.0~ 9.0 mg·L-1。孵化試驗從受精卵開始至發(fā)眼期結(jié)束。

1.2復(fù)方中藥的制備

本試驗選用的五個自組中藥復(fù)方，分別編號為復(fù)方A-E（復(fù)方A由苦參、野菊花等；復(fù)方B由丁香、梔子等；復(fù)方C由土槿皮等；復(fù)方D由生姜、食鹽等；復(fù)方E由苦楝子、五倍子等配伍組成），復(fù)方所用中藥原料藥均購自哈爾濱世一堂藥店，烘干后備用。

復(fù)方中藥采用水煎和醇提兩種方法對其有效成分進行提取。水煎法按照各復(fù)方配比稱取烘干后的中藥，按傳統(tǒng)方法用砂鍋熬制，濃縮所得藥液至1 mL藥液相當于1 g復(fù)方生藥[18]。醇提法參照林楠等方法進行[19]。每個復(fù)方中藥消毒組均包括水煎組（A水—E水）和水煎+醇提混合組（A水+醇—E水+醇），混合組水煎劑及醇提劑混合比例為1?1（V?V）。

1.3受精卵消毒及計數(shù)

將濃縮好的藥液加入吊瓶中，逐滴加入流水混勻，平列槽中試驗魚卵藥液浸泡約40 min。共設(shè)A-E復(fù)方中藥消毒組15個（10個水煎劑組，5個水煎+醇提混合組）和，1個對照組，每組2個平行，每個平行1 000粒卵。其中10個水煎劑組分為正常劑量給藥組5個（每服藥為1 m3用量），和稀釋后給藥組5個（每服藥為4 m3用量）。從受精卵至發(fā)眼期間，每天消毒一次。每日消毒前進行活卵、死卵（霉菌感染死亡及其他原因死亡）計數(shù)，試驗結(jié)束后，對每組存活發(fā)眼卵進行計數(shù)。發(fā)眼率、死卵率、水霉卵比率和其他死卵比率分別為發(fā)眼卵數(shù)、死卵數(shù)、水霉感染引起的死卵數(shù)和其他原因造成的死卵數(shù)與試驗用受精卵總數(shù)的比值。

2　結(jié)果與分析

2.1復(fù)方中藥水煎劑正常劑量消毒效果

按照方法所述，每日定時對試驗魚卵進行消毒處理，每服藥水煎劑為1 m3水體用量，并詳細記錄魚卵狀態(tài)及數(shù)量，將所得數(shù)據(jù)整理，見圖1。

由圖1可見，正常流水孵化情況下，對照組發(fā)眼率僅有35.91%，而死卵率高達64.09%，且水霉菌感染引起的死亡率極高，占總死卵數(shù)的83%。復(fù)方中藥水煎劑正常劑量組魚卵的發(fā)眼率均高于對照組，死卵率特別是水霉菌感染卵比率均低于對照組。試驗魚卵發(fā)眼結(jié)果為：A>B>C>D>E>對照，而水霉菌感染導(dǎo)致的死卵結(jié)果為：對照>D>E> C>B>A。且A組試驗魚卵的發(fā)眼率65.41%顯著高于對照組的35.91%，而水霉感染死卵率的18.17%顯著低于對照組的53.46%。試驗組和對照組由其他原因引起的死卵比率差異不顯著，結(jié)果為：E>B>D>A>對照>C。

2.2復(fù)方中藥水煎劑稀釋組消毒效果

按照方法所述，每日定時對試驗魚卵進行消毒處理，每服藥水煎劑為4 m3水體用量，并詳細記錄魚卵狀態(tài)及數(shù)量，將所得數(shù)據(jù)整理見圖2。

由圖2可見，復(fù)方中藥水煎劑稀釋組試驗魚卵的發(fā)眼及死亡情況與正常劑量給藥組有較大差異。試驗魚卵發(fā)眼結(jié)果為：B>對照>A>E>C>D，死卵結(jié)果為：D>C>E>A>對照>B，而水霉菌感染導(dǎo)致的死卵結(jié)果為：D>A>E>C>對照>B，其他原因?qū)е碌乃缆呀Y(jié)果為：D>C>對照>E>B>A。但試驗組與對照組數(shù)據(jù)差異較小，未形成顯著性差異。

圖1　中藥水煎劑消毒結(jié)果Fig. 1　Disinfection results of Chinese medicine water-extracted fraction

圖2　中藥水煎劑消毒結(jié)果Fig. 2　Disinfection results of Chinese medicine water-extracted fraction

2.3復(fù)方中藥水煎+醇提混合劑消毒效果

結(jié)果見圖3。

按照1.3方法所述，每日定時定量對試驗魚卵進行消毒處理，每服藥水煎劑為1 m3水體用量，并詳細記錄魚卵狀態(tài)及數(shù)量，將所得復(fù)方中藥水煎+醇提混合組的數(shù)據(jù)整理如圖3所示。

圖3　中藥水煎+醇提混合組消毒結(jié)果Fig. 3　Disinfection results of Chinese medicine water-extracted and alcohol extraction

由圖3可見，復(fù)方中藥水煎+醇提混合組消毒效果與水煎劑組有較大差別。試驗魚卵發(fā)眼結(jié)果為：E>C>D>B>對照>A，而水霉菌感染導(dǎo)致的死卵結(jié)果為：A>對照>B>C>D>E。

3　討論

藥用植物產(chǎn)生的活性物質(zhì)通常具有抑菌、抗病毒、抗腫瘤等功效[20]。繼孔雀石綠和甲醛先后被列入魚類禁用藥物名單后，研究人員相繼研究食鹽水、重金屬離子、生化防腐酸、防霉劑、過氧化氫等多種物質(zhì)的滅菌效果，但效果差強人意，且化學(xué)藥物的頻繁使用導(dǎo)致水霉菌耐藥性有逐漸增強趨勢，近年來，通過生物途徑防治水霉病引起廣泛關(guān)注和重視[21]。

3.1中藥對水霉病的防治效果

中草藥作為一種生物源的低毒無污染藥物，結(jié)合其藥用與營養(yǎng)的雙重功效，在水產(chǎn)養(yǎng)殖中應(yīng)用廣泛，也有部分中草藥防治水產(chǎn)動物水霉病的報道。張世奇等對20種中草藥對水霉菌的抑菌作用進行比較研究[22]；徐斌對中草藥在魚類真菌、細菌及寄生蟲病防治中的應(yīng)用進行研究[23]；陳曉艷等對烏龜水霉病致病菌進行中草藥抑制效果研究[24]。結(jié)果表明，中草藥在水生動物水霉病防治中有較好效果，是作為化學(xué)藥物替代物的理想選擇之一。

本研究選取的5個自組中藥方劑，在山女鱒受精卵孵化過程中水霉病的防治應(yīng)用上表現(xiàn)出良好效果，其水煎劑顯著提高受精卵的發(fā)眼率，降低水霉菌感染造成的死亡。特別是復(fù)方A作用效果極為突出，有效降低受精卵孵化過程中的水霉菌感染，顯著降低其死亡率。復(fù)方A中含有清熱解毒的五倍子、大黃等藥物，一方面促進受精卵的健康孵化，同時有效抑制水霉菌的感染，結(jié)果與李川等在研究大鯢水霉病時[25]，大黃和五倍子具有良好的抑制作用結(jié)果一致。而復(fù)方C雖然對卵水霉的抑制效果一般，但是與其他中藥組和對照組相比，有效降低其他原因引起的卵死亡，推測是復(fù)方中藥在提高卵的抗病力和抵抗力方面有一定效果。

3.2不同消毒劑量對中藥效果的影響

本試驗為篩選最適用藥濃度，設(shè)置復(fù)方中藥水煎劑的正常劑量組及稀釋組，試驗結(jié)果表明，同一復(fù)方不同濃度消毒效果差異極大。正常劑量組能有效提高山女鱒受精卵的發(fā)眼率，抑制水霉菌感染；而稀釋消毒組受精卵死亡率較高，甚至高于不用藥的對照組，水霉感染及其他原因?qū)е滤缆崖示兴仙?/p>

中草藥具有疾病防治、消毒除菌作用，還富含多種營養(yǎng)元素及活性物質(zhì)，可提高生物體體質(zhì)[26]。因而，推測在較低濃度的中藥消毒過程中，藥用有效成分的降低未能較好起到抑菌殺菌作用，還部分的促使水霉及其他致病因子滋生，導(dǎo)致受精卵的發(fā)眼率較正常消毒劑量組顯著下降。因此，在選用中草藥方劑進行水產(chǎn)品消毒的過程中，應(yīng)選擇適宜的消毒濃度及劑量，避免消毒濃度過低不僅達不到應(yīng)有效果，還有可能起到反作用。

3.3不同提取方法對中藥效果的影響

中藥制藥過程包括提取、分離、濃縮、干燥、制劑等多個環(huán)節(jié)，而提取是關(guān)鍵環(huán)節(jié)之一，影響最終藥物制劑的質(zhì)量、成本[27]。隨著現(xiàn)代科學(xué)技術(shù)的進步，出現(xiàn)微波輔助萃取、超聲波提取、超臨界提取等新型提取技術(shù)[28]。傳統(tǒng)的中藥提取方法雖然存在提取周期長、有效成分損失較多、提取物中雜質(zhì)含量高等問題，但是由于操作簡便、設(shè)備低廉、符合中醫(yī)藥理論等[29]情況，仍為目前養(yǎng)殖業(yè)者和小型試驗中草藥制劑提取采用的主要方法。

醇可以破壞細胞膜的完整性而提高細胞膜的通透性[30]，田洛等研究表明醇堿提取法提取黃芪多糖比水提法和堿提法提取率高[31]。本研究采用水煎和醇提兩種方法對5個自組方劑進行提取，對山女鱒受精卵進行消毒后，效果差異較大。復(fù)方中藥A水煎劑組能顯著提高發(fā)眼卵成活率，降低水霉菌感染造成死亡，而其水煎+醇提混合組則表現(xiàn)為水霉菌感染死卵率極高，發(fā)眼率極低。推測可能是由于混合組消毒液中醇含量對其效果有影響，也可能是醇提法對藥物中某種物質(zhì)提取率顯著提高，導(dǎo)致藥物提取物有效成分變化。

綜上所述，本研究對5中復(fù)方中藥2種提取方法2種消毒濃度進行篩選。結(jié)果表明，復(fù)方中藥A水煎劑正常消毒劑量組能顯著提高受精卵的發(fā)眼率，降低水霉菌感染造成的死亡，是一種適用于山女鱒受精卵孵化期間防治水霉感染的理想中藥制劑。但應(yīng)嚴格保證中藥消毒劑的濃度及作用時間，嚴格執(zhí)行其水煎提取方法。

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Li Shaowu, Liu Hongbai. Research on effects of Chinese herbal compounds on preventing and curing of Saprolegniasis in Oncorhynchus masou masou fertilized eggs[J]. Journal of Northeast Agricultural University, 2015, 46(4): 89-93. (in Chinese with English abstract)

Research on effects of Chinese herbal compounds on preventing and curing of Saprolegniasis in Oncorhynchus masou masou fertilized eggs

/LI Shaowu, LIU Hongbai(Heilongjiang River Fisheries Research Institute, Chinese Acade my of Fisheries Sciences, Harbin 150070, China)

Abstract:Effects of five self-made Chinese medical herbs on preventing and control Saproleginiasis of Oncorhynchus masou masou fertilized eggs were evaluated in this study. The active ingredients of Chinese medical herbs here were extracted by two different methods including water decoction and combination of water decoction and ethanol extraction. The normal dosage groups and dilution groups were set up to compare the effects of five different Chinese herbal compounds with two disinfection concentrations. Under the flowing water fish culture mode at 10℃, concentrated drugs were added into medicine flasks and dropped into the horizontal tanks to immerse the fertilized eggs for 40 min. The results indicated that among of five kinds of Chinese herbal compounds, Compound A could improve significantly eyed rate of fertilized eggs and decrease their mortalities caused by Saprolegnia infection under the normal dosage, which could be used as a good Chinese herbs preparation to prevent and control Saprolegniasis during the hatching period.

Key words:Chinese herbal compounds; Oncorhynchus masou masou; fertilized eggs; Saprolegniasis

*通訊作者：劉紅柏，研究員，研究方向為魚類病害及免疫研究。E-mail: liuhongbai@sina. com

作者簡介：李紹戊（1982-），男，副研究員，博士，研究方向為魚類病害防治。E-mail: swli_1982@163. com

基金項目：公益性行業(yè)（農(nóng)業(yè)）科研專項經(jīng)費（201003055）

收稿日期：2014-04-04

文章編號：1005-9369（2015）04-0089-05

文獻標志碼：A

中圖分類號：S948