歐洲型PRRSV的分離鑒定及其ORF5基因序列分析

?

歐洲型PRRSV的分離鑒定及其ORF5基因序列分析

劉建奎，魏春華，戴愛玲，李曉華，楊小燕*

（龍巖學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院，福建省預(yù)防獸醫(yī)學(xué)與獸醫(yī)生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，福建省人畜寄生與病毒性疫病防控工程技術(shù)研究中心，福建龍巖364012）

摘要：采自福建省規(guī)?；i場的疑似病料進(jìn)行PRRSV分離鑒定，采用RT-PCR方法擴(kuò)增PRRSV ORF5全基因并進(jìn)行序列測定分析。從采集的病料中成功分離2株P(guān)RRSV，2株分離毒株ORF5與GenBank中選擇的參考毒株比較發(fā)現(xiàn)，其核苷酸同源性為82.5%~90.6%，氨基酸同源性為80.6%~91.5%。通過序列進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化分析均顯示分離毒株屬于歐洲型PRRSV，ORF5基因與LV相比變異較大，應(yīng)加大對歐洲型PRRSV的監(jiān)控。

關(guān)鍵詞：歐洲型PRRSV；分離鑒定；ORF5基因；序列分析

網(wǎng)絡(luò)出版時間2015-4-23 9:34:12

[URL]http://www.cnki.net/kcms/detail/23.1391.S.20150423.0934.005.html

劉建奎,魏春華,戴愛玲,等.歐洲型PRRSV的分離鑒定及其ORF5基因序列分析[J].東北農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報, 2015, 46(4): 70-75.

豬生殖與呼吸綜合征病毒（Porcine reproductive and respiratory syndrome virus，PRRSV）是引起豬繁殖與呼吸綜合征（Porcine reproductive and respiratory syndrome，PRRS）的主要病原[1-2]。自1987年在美國首次報道以來，相繼在全世界范圍爆發(fā)，1991年荷蘭科學(xué)家從患有母豬繁殖障礙癥狀的病豬中分離到PRRSV，基因組為不分節(jié)段，有囊膜的單股正鏈RNA病毒，基因組長約15 kb，含有9個開放閱讀框架（ORF），病毒基因組的每個ORF均與相鄰的ORF有部分重疊[3-4]。自1996年郭寶清等在國內(nèi)分離到PRRSV，該病毒已成為最重要病原之一[5-6]。目前，根據(jù)PRRSV的不同來源地及其核苷酸序列的差異，將其分為歐洲型與美洲型，其代表株分別為Lelystad virus（LV）株和VR-2332（VR）株，前者主要流行于歐洲地區(qū)，而后者主要流行于美洲和亞太地區(qū)。雖然兩個基因型的基因組核苷酸一致性僅60%，但其形態(tài)結(jié)構(gòu)、復(fù)制特點(diǎn)、細(xì)胞嗜性、流行傳播方式及其引發(fā)的疾病特征等生物學(xué)特性均相同。GP5蛋白是PRRSV的主要結(jié)構(gòu)蛋白，能誘導(dǎo)抗體產(chǎn)生中和抗體，雖然美、歐洲型毒株的ORF5基因不同，但兩者編碼的GP5蛋白疏水側(cè)翼卻很相似。近年來，PRRSV的流行已打破地域限制，在亞洲和北美均有歐洲型PRRSV流行報道[7-8]，歐洲也出現(xiàn)野生型PRRSV的美洲株。自1996年國內(nèi)首次發(fā)現(xiàn)PRRSV以來，國內(nèi)報道流行的致病株基本為北美型PRRSV，雖然歐洲型PRRSV在國內(nèi)田間也存在，但是研究相對較少[9]。因此，加強(qiáng)對歐洲型PRRSV的檢測和研究勢在必行。

1　材料與方法

1.1材料

1.1.1病料

無菌采集疑似PRRSV感染的肺臟、扁桃體、淋巴結(jié)、脾臟和血液等。

1.1.2主要試劑

M-MuLV反轉(zhuǎn)錄酶、HRR I RNA酶抑制劑、ExTaq DNA聚合酶、DNA Marker DL2000、pMD18-T克隆載體試劑盒均購自寶生物公司；膠回收試劑盒購自天根生化科技有限公司。

1.1.3 PCR引物

按照參考文獻(xiàn)[10]方法設(shè)計歐洲型PRRSV ORF5引物，引物由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成，擴(kuò)增目的片段的大小約為700 bp。

1.2方法

1.2.1病料的處理

無菌采集疑似PRRSV感染的肺臟、淋巴結(jié)、脾臟剪碎，充分研磨，反復(fù)凍融3次，離心后取上清液備用。

1.2.2病毒的分離培養(yǎng)

將處理過的病料上清液接種于長成單層的Marc-145細(xì)胞，PBS輕洗后加入DMEM維持液，37℃CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每天觀察CPE。當(dāng)CPE出現(xiàn)80%時收毒，反復(fù)凍融，離心后取上清-70℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 RT-PCR擴(kuò)增

按照RNA提取試劑盒說明書提取RNA，按Takara試劑盒說明書，采用兩步法進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增。

①反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)

20 μL反轉(zhuǎn)錄體系中，隨機(jī)引物1 μL，模板11 μL，70℃作用10 min，冰浴2 min；加入10 mmol·L-1dNTP 2.0 μL，5×M-MuLV Buffer 4.0 μL，HRRI RNA酶抑制劑1.0 μL，M-MuLV反轉(zhuǎn)錄酶1.0 μL，42℃60 min，70℃15 min，冰浴2 min。

②PCR擴(kuò)增反應(yīng)

25 μL反應(yīng)體系：10×PCR buffer 2.5 μL、2.5 mmol·L-1dNTP 2 μL，cDNA模板2 μL，20 mmol·L-1上下游引物各0.6 μL，ExTaq DNA聚合酶0.25 μL，用ddH2O補(bǔ)至25 μL。PCR擴(kuò)增程序?yàn)椋?5℃4 min；94℃45 s；55℃45 s；72℃45 s，35個循環(huán)；72℃延伸10 min，同時設(shè)不加模板的陰性對照。PCR產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測。

1.2.4目的基因的克隆與序列分析

目的基因經(jīng)膠回收后連接至pMD18-T載體中，構(gòu)建重組質(zhì)粒，轉(zhuǎn)化至DH5а中，經(jīng)PCR和酶切鑒定后，送往上海生工公司測序。按照Cha等建立的方法進(jìn)行ORF5基因序列分析[l1]，采用MEGA 6.0軟件繪制系統(tǒng)遺傳進(jìn)化樹。

2　結(jié)果與分析

2.1病毒的分離培養(yǎng)

病料接種于Marc-145細(xì)胞后出現(xiàn)典型CPE。表現(xiàn)為細(xì)胞聚集成叢，變圓、脫落（見圖1）。

2.2病毒的RT-PCR鑒定

病變細(xì)胞經(jīng)總RNA提取，經(jīng)RT-PCR擴(kuò)增后，產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定，結(jié)果顯示在約700 bp出現(xiàn)擴(kuò)增條帶，大小與預(yù)期結(jié)果相符（見圖2）。

圖1　分離毒株感染MARC-145細(xì)胞后第60小時的形態(tài)觀察（100×）Fig. 1　Morphological observation of Marc-145 cells infected with PRRSV at hour 60 post-infection

圖2　歐洲型PRRSV ORF5基因的RT-PCR擴(kuò)增結(jié)果Fig. 2　Amplified of ORF5 gene by RT-PCR fromEuropean type PRRSV strains

2.3 ORF5基因及推導(dǎo)氨基酸序列的變異分析

2株P(guān)RRSV分離毒株ORF5基因與20世紀(jì)90年代以來陸續(xù)分離的LV、CreSA-V1、BJEU06-1、NVDC-NM1等國內(nèi)外歐洲型PRRSV毒株ORF5核苷酸序列和推導(dǎo)氨基酸序列的同源性分別為82.5%~90.6%和80.6%~91.5%，尤其與北京分離毒株NVDC-NM1同源性最高，而分離株LY-ZHOU與疫苗毒株P(guān)orcillis（AF378819）和Pyrsvac（AF378820）的核苷酸和推導(dǎo)氨基酸同源性分別為83.3%、83.3%和86.1%、88.2%。分離株LY-ZHOU分離株與疫苗毒株P(guān)orcillis（AF378819）和Pyrsvac（AF378820）的核苷酸和推導(dǎo)氨基酸同源性分別在83.8%、83.8%和86.1%、88.9%。分離株與VR-2332、CH-1а等北美毒株的核苷酸、推導(dǎo)氨基酸的同源性分別為61.6%~62.6%和57.1%~59.4%（見表1，2），結(jié)果表明所分離的PRRSV為歐洲型PRRSV。

表1　2株分離毒株與國內(nèi)外分離毒株ORF5核苷酸序列的同源性比較Table 1　Comparison of nucleotide sequences of ORF5 of two PRRSV isolates with other isolates

表2　2株分離毒株與國內(nèi)外分離毒株ORF5推導(dǎo)氨基酸序列的同源性比較Table 2　Comparison of deducted amino acid sequences of ORF5 of two PRRSV isolates with other isolates

2.4 ORF5基因氨基酸序列分析

ORF5基因推導(dǎo)氨基酸位點(diǎn)變異分析如圖3所示。

由圖3可知，分離株與LV株相比，GP5所編碼的201個氨基酸中均存在25個氨基酸的差異（見圖3A），而與疫苗株P(guān)yrsvac（AF378820）相比GP5所編碼的144個氨基酸（33-176aa）存在16~17個氨基酸的差異（見圖3B），與疫苗株P(guān)orcillis（AF378819）相比GP5所編碼的144個氨基酸（33-176aa存在21個氨基酸的差異（見圖3C）。

2.5 ORF5基因的遺傳進(jìn)化樹分析

將福建省PRRSV分離株與國內(nèi)外PRRSV分離株的ORF5氨基酸序列進(jìn)行遺傳進(jìn)化樹分析，結(jié)果見圖4，由進(jìn)化樹可見分離的毒株與LV、CreSAV1等歐洲分離株位于同一大分支中，親緣關(guān)系較近，尤其與北京分離毒株NVDC-NM1親緣關(guān)系最近，與疫苗毒株P(guān)orcillis（AF378819）和Pyrsvac （AF378820）處于同一大分支上的不同小分支上，親緣關(guān)系稍遠(yuǎn)。分離株與VR-2332、CH-la等美洲毒株處在兩個大的分支上，親緣關(guān)系較遠(yuǎn)。

圖3　2株分離毒株與國內(nèi)外分離毒株ORF5推導(dǎo)氨基酸序列分析Fig. 3　Comparison of deducted amino acid sequences of ORF5 of two PRRSV isolates with other isolates

圖4　PRRSV福建分離株(▲)與參考病毒株ORF5氨基酸序列系統(tǒng)進(jìn)化樹分析Fig. 4　Phylogenetic tree based on the amino acid sequences of ORF5 gene ofFujian PRRSV isolates and PRRSV reference strains

2.6分離毒株GP5蛋白抗原性變異分析

用DNA Star 7.0軟件預(yù)測分離毒株與LV株的抗原性如圖5所示。

由圖5可知，結(jié)果表明分離的2株毒株抗原性幾乎相同，而與參考毒株LV株抗原性差異較大，在0~20位氨基酸、100~110位氨基酸、160~180位氨基酸和190~200位氨基酸有差異（見圖5A）。2株分離毒株與疫苗株P(guān)orcillis（AF378819）的抗原性差異比與疫苗株P(guān)yrsvac（AF378820）的抗原性差異?。ㄒ妶D5B）。

圖5　GP5蛋白的抗原性變異分析Fig. 5　Variation analysis of antigenicity of GP5 proteins

3　討論與結(jié)論

研究表明，PRRSV的GP5是該病毒最重要的結(jié)構(gòu)蛋白之一，具有良好的抗原性，在病毒吸附和進(jìn)入宿主細(xì)胞過程中起關(guān)鍵作用[12-14]。目前PRRSV的遺傳變異分析和基因進(jìn)化樹的構(gòu)建主要依據(jù)ORF5基因，因此本研究選用分離毒株的ORF5進(jìn)行遺傳變異分析[15]。

2株分離毒株的ORF5基因與VR-2332、CH-1а等北美毒株的核苷酸、推導(dǎo)氨基酸的同源性分別在62.6%以下和59.4%以下，而與20世紀(jì)90年代以來陸續(xù)分離的LV、CreSA-V1、BJEU06-1、NVDCNM1等國內(nèi)外歐洲型PRRSV毒株ORF5核苷酸序列和推導(dǎo)氨基酸序列分別在82.5~90.6%和80.6~ 91.5%，尤其與北京分離毒株NVDC-NM1同源性最高，核苷酸和推導(dǎo)氨基酸同源性分別在90.3%、90.6%和91.5%、91.5%，分離株與疫苗毒株P(guān)orcillis和疫苗毒株P(guān)yrsvac的核苷酸和推導(dǎo)氨基酸同源性分別在83.3%~83.8%和86.1%~88.9%。分離株與LV株相比，GP5所編碼的201個氨基酸中均存在25個氨基酸的差異，抗原性差異較大，而與疫苗株P(guān)orcillis（AF378819）相比在GP5所編碼的144個氨基酸（33-176aa）中，分離株與疫苗株P(guān)orcillis （AF378819）存在21個氨基酸的差異，與疫苗株P(guān)yrsvac（AF378820）存在16~17個氨基酸差異，抗原性分析表明，分離毒株與疫苗株P(guān)orcillis的抗原性差異比與疫苗株P(guān)yrsvac的抗原性差異小，因此考慮使用疫苗株P(guān)orcillis防控歐洲型PRRS[7, 15]。遺傳進(jìn)化樹表明，2株分離株GP5基因與LV為代表的歐洲型毒株處于同一個大分支中親緣關(guān)系較近，與北京分離毒株NVDC-NM1親緣關(guān)系最近，與歐洲型PRRS疫苗毒株處于同一大分支的兩個分支中，表明分離的毒株與疫苗株的親緣關(guān)系較遠(yuǎn)，但分離毒株的來源、致病性及生物學(xué)特性尚需深入研究。

PRRSV ORF5基因與LV毒株相比發(fā)生一定程度的變異，這種變異導(dǎo)致免疫表位發(fā)生變化需進(jìn)一步研究。同時，加大對歐洲型PRRSV監(jiān)控力度，采取有效防控措施，避免其流行。

[參考文獻(xiàn)]

[1]Dea S, Bilodeau R, Sauvageau R, et al. Outbreaks in Quebec pig farms of respiratory and reproductive problems associated with encephalomyocarditis virus[J]. J Vet Diagn Invest, 1991, 3(4): 275-282.

[2]Goyal S M. Porcine reproductive and respiratory syndrome[J]. J Vet Diagn Invest, 1993, 5(4): 656-664.

[3]Neumann E J, Kliebenstein J B, Johnson C D, et al. Assessment of the economic impact of porcine reproductive and respiratory syndrome on swine production in the United States[J]. J Am Vet Med Assoc, 2005, 227: 385-392.

[4]Stadejek T, Stankevicius A, Storgaard T, et al. Identification of radically different variants of porcine reproductive and respiratory syndrome virus in Eastern Europe: towards a common ancestor for European and American viruses[J]. J Gen Virol, 2002, 83: 1861-1873.

[5]Zhou L, Zhang J L, Zeng J W, et al. The 30-Amino-Acid Deletion in the Nsp2 of Highly Pathogenic Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome Virus Emerging in China Is Not Related to Its Virulence[J]. J Virol, 2009: 5156-5167.

[6]白子金,趙華鷹.豬繁殖呼吸綜合征的診治簡報[J].東北農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報, 2001(2): 205-208.

[7]Thanawongnuwech R, Amonsin A, Tatsanakit A, et a1.Genetics and geographical variation of porcine reproductive and respiratory syndrome virus(PRRSV) in Thailand[J]. Vet Microbiol, 2004, 101 (1): 9-21．

[8]Ropp S L, Wees C E, Fang Y, et al．Characterization of emerging European-like porcine reproductive and respiratory syndrome virus isolates in the United States[J]. J Virol, 2004, 78(7): 3684-3703．

[9]Chen N H, Cao z, Yu X L, et al. Emergence of novel European genotype porcine reproductive and respiratory syndrome virus in mainland China[J]. J Gen Virol, 2011, 92: 880-892.

[10]Mateu E, Martín M, Vidal D. Genetic diversity and phylogenetic analysis of glycoprotein 5 of European-type porcine reproductive and respiratory virus strains in Spain[J]. J Gen Virol, 2003, 84: 529-534.

[11]Cha S H, Choi E J, Park J H, et al. Molecular characterization of recent Korean porcine reproductive and respiratory syndrome (PRRS) viruses and comparison to other Asian PRRS viruses[J]. Vet Microbiol, 2006, 117: 248-257.

[12]石娜,尹杰超, Dante Z,等.豬IL-15與PRRS病毒GP5基因核酸疫苗免疫效力[J].東北農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報, 2010, 41(1): 97-102.

[13]Liu J K, Wei C H, Yang X Y, et al. Genetic diversity and evolutionary characterization of Chinese porcine reproductive and respiratory syndrome viruses based on NSP2 and ORF5[J]. Arch Virol, 2013, 158: 1811-1816.

[14]Li B, Fang L R, Liu S Y, et al. The genomic diversity of Chinese porcine reproductive and respiratory syndrome virus isolates from 1996 to 2009[J]. Vet Microbiol, 2010, 146: 226-237.

[15]Labarque G, Reeth K V, Nauwynck H, et al. Impact of genetic diversity of European-type porcine reproductive and respiratory syndrome virus strains on vaccine efficacy[J]. Vaccine, 2004, 22: 4183-4190.

Liu Jiankui, Wei Chunhua, Dai Ailing, et al. Isolation and identification of european type PRRSV and sequence analysis of ORF5 gene[J]. Journal of Northeast Agricultural University, 2015, 46(4): 70-75. (in Chinese with English abstract)

Isolation and identification of european type PRRSV and sequence

analysis of ORF5 gene

/LIU Jiankui, WEI Chunhua, DAI Ailing, LI Xiaohua, YANGXiaoyan

(School of Life Sciences, Longyan University; Key Laboratory of Preventive Veterinary Medicine and veterinarian Biotechnology of Fujian Province; Engineering Research Center for the Prevention and Control of Zoonosis, Longyan Fujian 364000, China)

Abstract:The samples were collected from sick pigs suspected of having PRRS from some large-scale pig farms in Fujian province. The virus isolates were propagated in Marc-145 cells and were determined by RT-PCR and the ORF5 genes were sequenced and analyzed. Two strains of PRRSV were isolated and comparison of the ORF5 genome sequences of different PRRSV isolates showed isolations was 82.5%-90.6% nucleotide sequence homology among them, which resulted in 80.6%-91.5% amino acid sequence homology. Phylogenetic analysis through GP5 showed that the isolated strains belonged to European type PRRSV. European type PRRSV existed in Fujian Province, gene ORF5 sequence of virulent strains of isolations variation was significant comparing with LV. We should increase monitoring of European type PRRSV.

Key words:European type PRRSV; isolation and identification; ORF5 gene; sequence analysis

*通訊作者：楊小燕，教授，研究方向?yàn)樾笄輦魅静≡\斷與防治。E-mail: lyyxy1988@126. com

作者簡介：劉建奎（1982-），男，實(shí)驗(yàn)師，碩士，研究方向?yàn)榉肿硬≡瓕W(xué)。E-mail: liujiankui99@126. com

基金項(xiàng)目：福建省自然科學(xué)基金項(xiàng)目（2011J01233）；福建省科技重大專項(xiàng)項(xiàng)目（2014NZ0002-3）；龍巖學(xué)院百名青年教師攀登項(xiàng)目（LQ2013022）；龍巖市科技項(xiàng)目（2013LY07）

收稿日期：2014-06-26

文章編號：1005-9369（2015）04-0070-06

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

中圖分類號：S852.65