黃瓜霜霉菌對嘧菌酯抗藥性的研究

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黃瓜霜霉菌對嘧菌酯抗藥性的研究

張艷菊，王瑩，黨悅嘉，柴洪慶

（東北農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院，哈爾濱150030）

摘要：嘧菌酯為甲氧基丙烯酸酯類殺菌劑，具有殺菌譜廣、殺菌活性高等優(yōu)點(diǎn)，但同時該類藥劑也屬于高抗性風(fēng)險(xiǎn)藥劑。為明確我國黃瓜主產(chǎn)區(qū)黃瓜霜霉菌對嘧菌酯的抗藥性，采用葉盤漂浮法測定來自黑龍江、吉林、遼寧、北京、山東、江蘇、湖北和廣東8個省份13個黃瓜主產(chǎn)區(qū)36個黃瓜霜霉病菌（Pseudoperonospora cubensis）菌株對嘧菌酯的抗藥性。黃瓜霜霉菌對嘧菌酯的EC50值為0.0107~0.2408 μg·mL-1，平均EC50值為0.1004 μg·mL-1。36個菌株中有26個中抗菌株、9個低抗菌株和1個敏感菌株，無高抗菌株。山東省菌株對嘧菌酯的抗性水平最高，其余省份菌株對嘧菌酯抗性水平相對較低。

關(guān)鍵詞：黃瓜霜霉菌；抗藥性；嘧菌酯；敏感性

網(wǎng)絡(luò)出版時間2015-4-23 9:33:32

[URL]http://www.cnki.net/kcms/detail/23.1391.S.20150423.0933.004.html

張艷菊,王瑩,黨悅嘉,等.黃瓜霜霉菌對嘧菌酯抗藥性的研究[J].東北農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào), 2015, 46(4): 23-28.

由藻界卵菌綱古巴假霜霉菌[Pseudoperonospora cubensis（Berk. & M.A. Curtis）Rostovzev]侵染引起的霜霉病是黃瓜生產(chǎn)中的最主要病害，分布廣泛，在適宜環(huán)境條件下，傳播流行速度快，涉及范圍廣，是保護(hù)地黃瓜生產(chǎn)中的一種毀滅性病害。大約有70多個國家先后發(fā)生過這種病害，對黃瓜生產(chǎn)危害極大[1]。目前對于該病害主要通過抗病品種使用、生態(tài)防治以及化學(xué)防治等措施協(xié)調(diào)運(yùn)用進(jìn)行綜合防治。甲霜靈和嘧菌酯等是目前生產(chǎn)上常用的防治黃瓜霜霉病的殺菌劑，由于殺菌劑使用頻率高、劑量大，連年使用，導(dǎo)致病菌抗藥性逐步增強(qiáng)，致使防治效果下降[2]。

嘧菌酯（Asoxystrobin）是以天然產(chǎn)物Strobilurin A為先導(dǎo)化合物開發(fā)的甲氧基丙烯酸酯類殺菌劑，殺菌譜廣、殺菌活性高[3]，對幾乎所有真菌（子囊菌門、擔(dān)子菌門、無性菌類）和卵菌病害均顯示良好活性。其作用原理與其他殺菌劑不同，是通過鎖住細(xì)胞色素B和C1之間的電子傳遞，阻止細(xì)胞ATP合成，通過抑制線粒體呼吸而發(fā)揮抑菌作用，對于已對甾醇抑制劑（如三唑類）、苯基酰胺類、二羧酰胺類、苯并咪唑類產(chǎn)生抗性的菌株有效。具有保護(hù)、治療、鏟除、滲透、橫向輸導(dǎo)和內(nèi)吸作用，能抑制孢子萌發(fā)、菌絲生長和孢子形成[4]。在病菌侵入前或病害發(fā)生早期使用效果較好，可用于莖葉噴霧處理和灌根處理，也可以進(jìn)行種子和土壤處理，在推薦劑量下使用對作物無藥害，對環(huán)境安全。在黃瓜霜霉病等蔬菜病害的防治中有較好防治效果[5]。盡管該類殺菌劑作用機(jī)制獨(dú)特，但對于病原菌抗藥性的產(chǎn)生依然具有很高的風(fēng)險(xiǎn)性[6]。Ishii等報(bào)道日本由于黃瓜霜霉菌對嘧菌酯的抗藥性導(dǎo)致防治黃瓜霜霉病失敗，并且檢測到抗性菌株[7]。劉曉雨在47株黃瓜霜霉菌株中沒有發(fā)現(xiàn)對嘧菌酯產(chǎn)生抗性的菌株，并且表明嘧菌酯與甲霜靈不存在交互抗藥性[8]。張曉從山東省壽光地區(qū)溫室大棚中采集的106個黃瓜霜霉菌株中沒有監(jiān)測到對嘧菌酯產(chǎn)生抗性的菌株，但在2007年采集的97個黃瓜霜霉菌株中，檢測到57株為抗性菌株[9]。本文研究來自我國8個省13個黃瓜主產(chǎn)區(qū)霜霉菌對嘧菌酯的抗藥性，為科學(xué)防治黃瓜霜霉病提供理論依據(jù)。

1　材料與方法

1.1材料

1.1.1供試黃瓜品種

感病黃瓜品系L18，由東北農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝學(xué)院黃瓜課題組提供。在網(wǎng)室內(nèi)種植，正常管理。

1.1.2病原菌

2012~2013年，在黃瓜霜霉病發(fā)病盛期，從黑龍江、吉林、遼寧、北京、山東、江蘇、湖北和廣東8個省市13個黃瓜主產(chǎn)區(qū)的大田或溫室中采集黃瓜霜霉病葉（見表1），低溫保存帶回實(shí)驗(yàn)室。沖去葉面雜物和原有孢子囊，20~25℃下保濕24 h，長出大量濃密新鮮孢子囊后用于抗藥性研究。

1.1.3供試藥劑

95%嘧菌酯（Azoxystrobin）原藥，由先正達(dá)（中國）投資有限公司提供。

將上述原藥用丙酮溶解配制成1×104μg·mL-1母液，放置于4℃冰箱中保存?zhèn)溆?。對離體葉盤進(jìn)行藥劑處理時，將母液用無菌水稀釋成系列濃度梯度的藥液，并加入0.005%吐溫20。

嘧菌酯系列濃度為0、0.0001、0.001、0.005、0.01、0.05、0.1、0.5和1 μg·mL-1懸浮液。

1.2方法

1.2.1菌株對嘧菌酯的敏感性測定

采用離體葉盤漂浮法測定黃瓜霜霉菌對嘧菌酯的敏感性[10]。采集健康黃瓜植株葉片全展的第3~5片葉，用打孔器制成直徑1.5 cm葉盤，準(zhǔn)備直徑90 mm培養(yǎng)皿，每皿放入10片葉盤，加入15 mL藥液，葉盤背面朝上置于不同系列濃度藥液中浸泡l h，對照加蒸餾水，每濃度重復(fù)3次。將配制好的2×103個孢子囊·mL-1懸浮液點(diǎn)滴接種于葉盤中心點(diǎn)，每滴10 μL，置于12 h光暗交替的培養(yǎng)箱中，培養(yǎng)箱溫度為18℃、RH>80%。培養(yǎng)7 d后測量葉盤上的發(fā)病面積，計(jì)算防治效果。

病情調(diào)查：根據(jù)病斑面積占葉盤面積的百分率劃分病級：0級：無病斑；1級：病斑占整個葉片<5%；3級：病斑占整個葉片的5%~25%；5級：病斑占整個葉片的26%~50%；7級：病斑占整個葉片的51%~75%；9級：病斑占整個葉片> 75%。

病情指數(shù)及防治效果計(jì)算公式：

通過DPS 14.0軟件，進(jìn)行藥劑濃度與防治效果之間的線性回歸分析。將防治效果轉(zhuǎn)化為機(jī)率值（Y），藥劑濃度（μg·mL-1）轉(zhuǎn)化為負(fù)對數(shù)（X），求出毒力回歸方程Y=A+BX，相關(guān)系數(shù)R2，并根據(jù)方程計(jì)算嘧菌酯對不同菌株有效抑制中濃度EC50（μg·mL-1）。

1.2.2菌株對嘧菌酯的抗性水平及抗藥類型

黃瓜霜霉菌對嘧菌酯的敏感基線采用劉曉雨測得的敏感基線：0.0062 μg·mL-1[8]。根據(jù)黃瓜霜霉菌對嘧菌酯的敏感基線值，由下式求出各菌株對嘧菌酯的抗性水平。

參照抗藥類型分級標(biāo)準(zhǔn)[11]，根據(jù)抗性水平將不同黃瓜霜霉菌分為4個類型：敏感型S：抗性水平≤2倍；低抗型LR：2<抗性水平≤10倍；中抗型MR：10<抗性水平≤100倍；高抗型HR：抗性水平>100。

表1　黃瓜霜霉病菌株代碼及采集地點(diǎn)Table 1　Isolates and their origins in P. cubensis

2　結(jié)果與分析

2.1菌株對嘧菌酯的敏感性

黃瓜霜霉菌對嘧菌酯敏感性測定結(jié)果見表2，36株菌株對嘧菌酯平均EC50值0.0107~0.2408 μg·mL-1，對嘧菌酯最不敏感菌株EC50值為0.2408 μg·mL-1，最敏感菌株EC50值為0.0107 μg·mL-1，最大值是最小值的22.4倍，平均EC50值為0.1004 μg·mL-1。來源于不同省市菌株對嘧菌酯敏感性表現(xiàn)出一定差異，各省市平均EC50為0.0137~0.1786 μg·mL-1。其中最敏感的是廣東菌株，平均EC50值最小，為0.0137 μg·mL-1；最不敏感的是山東菌株，平均EC50值最大，為0.1786 μg·mL-1；最大值是最小值的13.08倍。不同年份采集菌株對嘧菌酯敏感性不同，2012年采集的17個菌株EC50分布范圍為0.0107~ 0.2046 μg·mL-1，平均EC50值為0.0870 μg·mL-1；2013年采集的19個菌株EC50分布范圍為0.0391~ 0.2408 μg·mL-1，平均EC50值為0.1124 μg·mL-1。從表2各省市間方差分析可以看出，各省市間差異達(dá)到極顯著（P<0.01）。

表2　黃瓜霜霉菌對嘧菌酯的敏感性Table 2　Sensitivity to azoxystrobin in P. cubensis

2.2菌株對嘧菌酯的抗性水平

對嘧菌酯抗藥性檢測結(jié)果見表3。

由表3可知，36個菌株中有26個中抗菌株，占總菌株數(shù)的72.2%，為優(yōu)勢群體；9個低抗菌株，占25.0%；1個敏感菌株，占2.8%；無高抗菌株出現(xiàn)。菌株對嘧菌酯抗性水平范圍為1.7~38.8倍，平均抗性水平為16.2倍；山東省菌株對嘧菌酯抗性水平最高，其余菌株對嘧菌酯抗性水平相對較低，在廣東省試材檢測到1株敏感菌株。2012年采集的17個菌株中有11個中抗菌株、5個低抗菌株和1個敏感菌株，2013年采集的19個菌株中有15個中抗菌株和4個低抗菌株。

表3　黃瓜霜霉菌對嘧菌酯的抗性水平Table 3　Resistance level to azoxystrobin in P. cubensis

3　討論

對來自全國8個省市13個黃瓜主產(chǎn)區(qū)的36個黃瓜霜霉病菌株進(jìn)行嘧菌酯敏感性測定。結(jié)果顯示，最不敏感菌株EC50值為0.2408 μg·mL-1，最敏感菌株EC50值為0.0107 μg·mL-1，平均EC50值為0.1004 μg·mL-1。來源于不同省市菌株對嘧菌酯敏感性表現(xiàn)出一定差異，最敏感的是廣東省菌株，平均EC50值最小，為0.0137 μg·mL-1，最不敏感的是山東省菌株，平均EC50值最大，為0.1786 μg·mL-1。不同年份采集的菌株對嘧菌酯敏感性不同，2012年采集的17個菌株中有11個中抗菌株、5個低抗菌株和1個敏感菌株，平均EC50值為0.0870 μg·mL-1；2013年采集的19個菌株中有15個中抗菌株和4個低抗菌株，平均EC50值為0.1124 μg·mL-1。對嘧菌酯抗藥性進(jìn)行檢測結(jié)果發(fā)現(xiàn)，36個菌株中有26個中抗菌株、9個低抗菌株和1個敏感菌株，無高抗菌株。表明黃瓜霜霉菌對嘧菌酯產(chǎn)生一定抗藥性。山東省菌株對嘧菌酯抗性水平最高，其原因可能是因?yàn)殚L期大量使用嘧菌酯作為黃瓜霜霉病的殺菌劑，使菌株產(chǎn)生抗藥性。

霜霉病是保護(hù)地黃瓜上的一種毀滅性病害，在適宜發(fā)病條件下，流行速度快，一兩周內(nèi)即可使葉片枯死，有些只采收1~2次即提早拉秧，造成嚴(yán)重?fù)p失。為避免黃瓜霜霉病發(fā)生及減輕危害，生產(chǎn)上需多次用藥進(jìn)行防治。單一藥劑使用和同一季節(jié)多次使用將使黃瓜霜霉病菌對嘧菌酯抗藥性產(chǎn)生幾率增加[4]。甲氧基丙烯酸酯類殺菌劑在生產(chǎn)上使用2~ 3年后即可檢測到某些作物病害的抗藥菌株[5]。德國、比利時、法國、英國和丹麥依次發(fā)現(xiàn)小麥白粉病菌抗甲氧基丙烯酸酯類藥劑菌株[12]。新西蘭也報(bào)道葡萄霜霉病菌對甲氧基丙烯酸酯類藥劑具有抗藥性[13]。病原菌產(chǎn)生抗藥性的原因主要有兩方面：一是病原菌本身產(chǎn)生抗藥性，即病原物遺傳物質(zhì)發(fā)生變化，抗藥性狀可穩(wěn)定遺傳；二是抗藥突變體對環(huán)境有一定適合度，與敏感野生群體相比具有較強(qiáng)的生存競爭能力，如在越冬、越夏、生長、繁殖和致病性等方面均有較高適合度。P. cubensis被FRAC認(rèn)定為世界上抗性風(fēng)險(xiǎn)較高的10個病菌之一。本試驗(yàn)中菌株對嘧菌酯已表現(xiàn)出一定抗性，為克服抗藥性，應(yīng)避免長期單一使用一種殺菌劑，合理進(jìn)行殺菌劑輪換和使用，嚴(yán)格控制藥劑單季使用次數(shù)，降低藥劑選擇壓力，有助于適合度低的抗藥性菌株群體數(shù)量減少。同時加強(qiáng)病害短期預(yù)測預(yù)報(bào)，科學(xué)用藥，嚴(yán)格按照藥劑生產(chǎn)商的推薦劑量施藥，達(dá)到降低抗藥性產(chǎn)生風(fēng)險(xiǎn)，延長藥劑使用壽命，減少環(huán)境污染，降低病害防治成本。此外應(yīng)采用預(yù)防為主、綜合防治技術(shù)措施，通過采用抗病品種、加強(qiáng)栽培管理等綜合進(jìn)行病害防治。

4　結(jié)論

采用葉盤漂浮法測定來自黑龍江、吉林、遼寧、北京、山東、江蘇、湖北和廣東8個省份13個黃瓜主產(chǎn)區(qū)的36株黃瓜霜霉菌對嘧菌酯敏感性。黃瓜霜霉菌對嘧菌酯EC50值為0.0107~0.2408 μg·mL-1，平均EC50值為0.1004 μg·mL-1。36個菌株中有26個中抗菌株、9個低抗菌株和1個敏感菌株，無高抗菌株。

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Zhang Yanju, Wang Ying, Dang Yuejia, et al. Study on fungicide resistance of Pseudoperonospora cubensis to azoxystrobin [J]. Journal of Northeast Agricultural University, 2015, 46(4): 23-28. (in Chinese with English abstract)

Study on fungicide resistance of Pseudoperonospora cubensis to

azoxystrobin

/ZHANG Yanju, WANG Ying, DANG Yuejia, CHAI Hongqing(School of Agriculture, Northeast Agricultural University, Harbin 150030, China)

Abstract:Azoxystrobin is a strobilurin fungicide, it has a broad antimicrobial spectrum and high activity, but at the same time the agent also runs the risk of becoming a resistance agent. In order to understand the resistance of the cucumber downy mildew's (Pseudoperonospora cubensis) sensitivity to azoxystrobin, 36 cucumber downy mildew isolates were tested using the leaf disk floating method. The isolates were collected from 13 production areas over eight provinces: Heilongjiang, Jilin, Liaoning, Beijing, Shandong, Jiangsu, Hubei and Guangdong. EC50of Pseudoperonospora cubensis to azoxystrobin was 0.0107-0.2408 μg·mL-1and the average EC50was 0.1004 μg·mL-1. Of the 36 strains, 26 had a medium level of resistance, nine had low resistance, one was sensitive and none were highly resistant. The resistance level of Shandong Province strains to azoxystrobin was the highest and the resistance levels of other provinces' resistant strains to azoxystrobin were relatively low.

Key words:Pseudoperonospora cubensis; fungicide resistance; azoxystrobin; sensitivity

作者簡介：張艷菊（1968-），女，教授，博士，博士生導(dǎo)師，研究方向?yàn)橹参锊≡飳W(xué)及植物病害綜合防治。E-mail: zhangyanju1968@ 163.com

基金項(xiàng)目：國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（31171792）

收稿日期：2014-12-16

文章編號：1005-9369（2015）04-0023-06

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

中圖分類號：S482.2；S432.1