甜菜（Beta vulgaris L.）葉片GOGAT與GS協(xié)同變化分析

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甜菜（Beta vulgaris L.）葉片GOGAT與GS協(xié)同變化分析

李彩鳳，徐影，郭劍，陳明，桑麗敏，劉磊，王玉波，馬鳳鳴

（東北農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院，哈爾濱150030）

摘要：GS/GOGAT循環(huán)是甜菜氮素同化主要途徑。甜菜幼苗在氮素誘導(dǎo)下，通過使用不同濃度重氮乙酰絲氨酸處理，并在處理后2、6、9、12和24 h分別取樣，利用qRT-PCR技術(shù)檢測幼苗GS1、GS2及GOGAT的mRNA表達(dá)水平，同時測定GOGAT和GS酶活性，分析GOGAT與GS協(xié)同變化作用。結(jié)果表明，重氮乙酰絲氨酸處理后，GOGAT酶活性在6 h時開始被抑制。GS活性在9 h時開始被抑制；GOGAT的mRNA表達(dá)量于6 h時開始下調(diào)，GS1的mRNA表達(dá)量在2 h時開始下調(diào)，而GS2的mRNA表達(dá)量于9 h時開始下調(diào)，甜菜葉片NH4+的同化以GS2/GOGAT為主。

關(guān)鍵詞：甜菜；谷氨酸合成酶；谷氨酰胺合成酶；基因表達(dá)

網(wǎng)絡(luò)出版時間2015-4-23 10:11:56

[URL]http://www.cnki.net/kcms/detail/23.1391.S.20150423.1011.007.html

李彩鳳,徐影,郭劍,等.甜菜（Beta vulgaris L.）葉片GOGAT與GS協(xié)同變化分析[J].東北農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報, 2015, 46(4): 17-22.

甜菜是我國北方主要糖料作物，而氮素是蔗糖代謝主要影響因子。在氮素同化代謝中谷氨酰氨合成酶（GS）和谷氨酸合成酶（GOGAT）循環(huán)起關(guān)鍵作用，植物體內(nèi)NH4+95%以上通過GS/GOGAT循環(huán)同化[1-2]，谷氨酸合成酶GOGAT是連接氮無機同化和有機同化的紐帶，在作物氮代謝中具有重要作用。GOGAT在葉片韌皮組織中分布較多，主要參與氮化合物的轉(zhuǎn)移運輸[3]。GS（EC 6.3.1.2）有兩種同工酶，即胞液型GS（GS1）和葉綠體型GS（GS2），GS1功能是直接同化氮的轉(zhuǎn)移再利用和固氮形成的各種NH4+[4]，GS2主要生理功能是調(diào)控光呼吸和氨基酸代謝中NH4+的再同化[5]。目前對甜菜GOGAT的研究不夠深入，多處于酶活性動態(tài)層面，氮素對甜菜GS誘導(dǎo)的研究也主要集中在GS活性方面[6-7]。關(guān)于甜菜葉片GOGAT與GS協(xié)同作用研究不夠具體，兩種酶的基因表達(dá)是否存在協(xié)同作用以及兩者的協(xié)同方式，尚不清楚。

重氮乙酰絲氨酸是GOGAT的抑制劑，本試驗主要對氮素誘導(dǎo)下的甜菜幼苗進行GOGAT抑制處理，測定GOGAT和GS活性，同時使用熒光定量PCR方法分析甜菜GOGAT和GS抑制劑處理下基因表達(dá)變化，探討GS/GOGAT協(xié)同作用機制。

1　材料與方法

1.1材料

供試品種：KWS0143（購自德國KWS公司）。

1.2設(shè)計

試驗于2013年在東北農(nóng)業(yè)大學(xué)進行。土壤介質(zhì)為草炭土與蛭石1?1混合。甜菜種子播于20 cm營養(yǎng)缽中，每缽10粒，于光照培養(yǎng)箱中進行培養(yǎng)（25℃，1 800 lx）。待甜菜幼苗兩對真葉完全展開，取長勢良好，大小一致甜菜幼苗經(jīng)霍格蘭營養(yǎng)液培養(yǎng)24 h，再進行NO3-/NH4+為2?1氮素比誘導(dǎo)24 h。繼續(xù)下一步GOGAT抑制試驗。抑制劑為重氮乙酰絲氨酸，設(shè)抑制劑濃度為0、0.5、2、5和10 μmol·L-1，分別對甜菜幼苗進行處理，處理時間分別為2、6、9、12和24 h。取抑制處理后幼葉作為待測定材料。采集后樣品錫紙包好后液氮速凍，置于-80℃冰箱保存。

1.3酶活性測定方法

GS活性測定參照文獻[8]。

1 g左右材料放入預(yù)冷研缽中，研缽置于冰盒上。每一樣品加0.05 mol·L-1預(yù)冷咪唑-鹽酸緩沖液（pH 7.2）5 mL。每0.05 mol·L-1咪唑-鹽酸緩沖液（pH 7.2）內(nèi)含：0.05 mol·L-1咪唑；0.05 mmol·L-1β-巰基乙醇；0.05 mmol·L-1EDTA。用6 mol·L-1HCL調(diào)pH。冰浴研磨均勻，4℃12 000 r·min-1離心20 min，得到上清為GS粗酶。酶活力用μmol GHA·mg-1Pr·min-1表示。蛋白質(zhì)含量測定采用考馬斯亮藍(lán)G-250快速測定法，紫外光分光光度計于595 nm下測定吸光值。

GOGAT活性測定參照趙鵬等[9]和閆桂萍等[10]方法并加以改進。

取1 g左右甜菜幼苗葉片材料放入預(yù)冷研缽，每樣品加5 mL粗酶提取緩沖液[100 mmol·L-1磷酸鈉（pH 7.5），5 mmol·L-1EDTA，0.1%（V/V）巰基乙醇，100 mmol·L-1KCl，0.5 mmol·L-1PMSF（現(xiàn)用現(xiàn)加），0.1%（V/V）TritonX-100]充分研磨均勻，4℃12 000 r·min-1離心20 min，取上清液用于酶活力測定，GOGAT活力用μmol Glu·g-1FW·min-1表示。

1.4基因表達(dá)分析方法

1.4.1總RNA提取和鑒定

RNA抽提參照Trizol Reagent（Invitrogen）公司提供的Trizol（Invitrogen，Rockville MD）試劑盒說明書提取總RNA，確?？俁NA中的DNA消除。用紫外光分光光度計（Beckman, DU640）測定OD260、OD280、OD310下紫外吸收值。繼而完成RNA純度分析及濃度估測。RNA純度=OD260/OD280，總RNA濃度（μg·mL-1）=（OD260-OD310）×稀釋倍數(shù)×40 μg·mL-1。RNA樣品純度根據(jù)OD260/OD280比值而定，比值達(dá)到1.85~2.0為最佳。1%瓊脂糖電泳檢測RNA質(zhì)量。

1.4.2反轉(zhuǎn)錄合成cDNA

使用TOYOBO公司的REeverTra Ace qPCR RT Master Mix with gDNA Remover的操作方法，在冰上配制反應(yīng)液。RNA在去RNA酶的Eppendorff離心管65℃熱變性5 min，立即置于冰上。加4×DN Master Mix（已添加gDNA Remover）2 μL，RNA template 2 μL，水補足體系到8 μL，將反應(yīng)液均勻混合后在37℃條件下溫育5 min。冰浴后加入5× RT Master MixⅡ2 μL，反應(yīng)液輕輕震蕩進行逆轉(zhuǎn)錄，逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)條件：37℃15 min，50℃5 min，酶失活：98℃5 min，4℃hold。獲得cDNA模板，用于qRT-PCR。

1.4.3實時熒光定量PCR

參照GenBank甜菜GS1基因（AF343667）、GS2基因（AY026353）、GOGAT基因（JN967620）和GAPDH基因（EF408234）的cDNA序列設(shè)計引物，引物由Primer Premier 5軟件設(shè)計,經(jīng)NCBI Blast檢索，確保其專一性，引物均由博仕生物公司合成（見表1）。每樣品定量PCR重復(fù)3次，以GAPDH為內(nèi)參基因，未經(jīng)抑制劑處理樣品為對照。

表1　qRT-PCR檢測GS與GOGAT基因表達(dá)的引物序列Table 1　Sequences of primers to detect the expression of qRT-PCR GS and GOGAT gene

qRT-PCR體系20 μL。每毛細(xì)管可加體系：THU NDERBIRDRSYBR 10.0 μL，10 μmol·L-15' PCR和3' PCR Primer各1 μL，cDNA模板4 μL，RNase-Free Water補足體系到20 μL。將qRT-PCR毛細(xì)管放入羅氏Light Cycler 2.0熒光定量PCR儀內(nèi)，設(shè)定PCR反應(yīng)條件，預(yù)變性[95℃30 s（20℃·s-1），定量及延伸95℃5 s（20℃·s-1），60℃30 s（20℃·s-1）]× 40，溶解曲線分析95℃15 s，65℃15 s，95℃0 s （20℃·s-1），4℃冷卻保存。

反應(yīng)將結(jié)束時PCR產(chǎn)物開始溶解，qRT-PCR儀開始對每個樣品的熒光值進行檢測，通過溶解曲線對引物質(zhì)量進行分析，選擇溶解曲線峰單一，峰型順滑的樣品進行分析。

2　結(jié)果與分析

2.1甜菜葉片GOGAT活性

由圖1可以看出，不同抑制時間，各處理濃度GOGAT活性變化不同。處理2 h時，濃度0.5和2 μmol·L-1酶活性均高于對照，且0.5 μmol·L-1處理酶活性高于對照7%，10 μmol·L-1處理酶活性低于對照13%，其余時間段各濃度處理GOGAT活性均低于對照。隨抑制劑濃度加大，處理6~24 h，重氮乙酰絲氨酸處理的GOGAT活性均低于對照，說明增加重氮乙酰絲氨酸濃度和抑制時間GOGAT活性能得到有效抑制，且活性隨濃度增加而呈下降趨勢。GOGAT各處理活性6 h時被有效抑制。

圖1　不同濃度重氮乙酰絲氨酸處理下甜菜葉片GOGAT活性變化Fig. 1　Change of GOGAT activities in suger beet leaves under diffirent azaserine concentrations

2.2甜菜葉片GS活性

由圖2可知，0.5和2 μmol·L-1處理2 h時GS活性高于對照。其中0.5 μmol·L-1處理的GS活性高于對照13%，2 μmol·L-1處理的GS活性高于對照14%，而0.5 μmol·L-1處理6 h GS活性低于對照，并且差異明顯。當(dāng)抑制時間達(dá)到9 h，各濃度處理GS活性均有明顯下降，12~24 h下降幅度不明顯，GS各濃度處理9 h開始出現(xiàn)抑制。

綜上所述，經(jīng)重氮乙酰絲氨酸處理后的甜菜幼苗，6 h時GOGAT酶活性開始迅速下降，直至12 h后，酶活性降低速度減慢，并與24 h酶活性無明顯差異。GS在各濃度抑制劑處理后，于9 h酶活性呈明顯下降趨勢，9~24 h，酶活性下降趨勢不明顯。

2.3甜菜葉片GOGAT mRNA的表達(dá)分析

如圖3所示，不同抑制濃度和時間下GOGAT mRNA的表達(dá)呈現(xiàn)明顯變化，整體處理濃度在2~ 6 h間表達(dá)量上調(diào)。6 h以后表達(dá)量呈下降趨勢，9~ 12 h表達(dá)均下調(diào)明顯，24 h各濃度的GOGAT mRNA表達(dá)量均低于對照，說明GOGAT mRNA的表達(dá)量受到重氮乙酰絲氨酸抑制。

圖2　不同濃度重氮乙酰絲氨酸處理下甜菜葉片GS活性變化Fig. 2　Change of GS activities in suger beet leaves under diffiren azaserine concentrations

圖3　不同重氮乙酰絲氨酸處理濃度和時間下GOGAT mRNA表達(dá)特異性分析Fig. 3　Expression patterns of GOGAT mRNA in sugar beet leaves treated with ranges of azaserine concentrations at different time

2.4甜菜葉片GS1 mRNA的表達(dá)分析

結(jié)果見圖4。

從圖4得知，重氮乙酰絲氨酸處理后甜菜葉片GS1 mRNA表達(dá)量整體呈逐步下降趨勢。6 h后各濃度處理表達(dá)量迅速下調(diào)，12~24 h各濃度處理表達(dá)量下降緩慢，24 h表達(dá)量降到最低。

圖4　不同重氮乙酰絲氨酸處理濃度和時間下GS1 mRNA表達(dá)特異性分析Fig. 4　Expression patterns of GS1 mRNA in sugar beet leaves treated with ranges of azaserine concentrations at different time

2.5甜菜葉片GS2 mRNA的表達(dá)分析

由圖5可知，各濃度抑制劑處理后，GS2 mRNA表達(dá)量在2~9 h呈現(xiàn)先降后升趨勢，9 h表達(dá)量低于對照，從9~24 h各濃度處理表達(dá)量呈穩(wěn)步下降趨勢，24 h表達(dá)量降到最低。

由上述分析可知，在不同抑制劑濃度處理下，GOGAT mRNA、GS1 mRNA、GS2 mRNA表達(dá)量呈現(xiàn)不同程度明顯變化。各處理GOGAT mRNA表達(dá)量在2~6 h為上調(diào)表達(dá)，6~24 h為下調(diào)表達(dá)。各處理GS1 mRNA在2 h表達(dá)量開始下降。GS2 mRNA表達(dá)量變化同GOGAT mRNA表達(dá)量變化趨勢類似，上調(diào)表達(dá)出現(xiàn)6~9 h，9~24 h為下調(diào)表達(dá)，可看出兩者在基因水平上呈同步變化趨勢，協(xié)同作用緊密。

圖5　不同濃度重氮乙酰絲氨酸處理下GS2 mRNA表達(dá)特異性分析Fig. 5　Expression patterns of GS2 mRNA in suger beet leaves treaded with ranges of of azaserine concentrations at different time

3　討　論

GOGAT和GS是高等植物氮素同化的兩個核心酶。GS/GOGAT循環(huán)又是植物同化吸收氮素的主要途徑[11]，GOGAT因其表達(dá)既有組織器官專一性，又受環(huán)境（氮素、植物生長調(diào)節(jié)物質(zhì)）和發(fā)育因子影響，篩選最佳硝態(tài)氮和銨態(tài)氮氮素比例為2?1，對甜菜幼苗進行誘導(dǎo)，并在抑制劑條件下對其酶活性及基因表達(dá)進行檢測。重氮乙酰絲氨酸與谷氨酰胺結(jié)構(gòu)類似，可以阻止次黃嘌呤核苷酸合成，使嘌呤核苷酸合成受阻，RNA合成缺乏原料，因此使GOGAT在轉(zhuǎn)錄水平上受抑制。本研究表明，一定處理濃度和時間條件，重氮乙酰絲氨酸對氮素誘導(dǎo)的GOGAT活性抑制作用明顯，6 h各處理酶活性均低于對照。GS活性被抑制是在9 h。由于谷氨酰胺+α-酮戊二酸+2e-+2H+→2谷氨酸（谷氨酸合酶催化），NH3+谷氨酸+ATP→谷氨酰胺+ ADP+Pi（谷氨酰胺合成酶催化）。因此，可能是GS/GOGAT循環(huán)過稱中，谷氨酸合成酶被抑制，不能生成足量谷氨酸，因此谷氨酰胺合成酶底物不充足，活性降低。GOGAT mRNA在2~6 h和GS2 mRNA在6~9 h的表達(dá)均呈上調(diào)趨勢，抑制處理條件下GOGAT mRNA于6 h表達(dá)開始下調(diào)，GS2 mRNA各濃度處理9 h表達(dá)量開始下調(diào)，可能因為GS本身具有抗逆性特點，抑制劑脅迫暫時表現(xiàn)出抗性[12-16]，短時間抑制處理并不足以引起GS基因在轉(zhuǎn)錄及翻譯水平的變化，導(dǎo)致表達(dá)下調(diào)時間較GOGAT mRNA延后，二者基因表達(dá)下調(diào)時間與酶活性下降的時間處理一致。GOGAT mRNA基因下調(diào)表達(dá)和酶活性下降發(fā)生時間均為6 h，而GS2 mRNA基因在9 h表達(dá)開始下調(diào)，與GS酶活性下降時間相同。GOGAT mRNA和GS2 mRNA表達(dá)量隨時間變化呈同步下降趨勢。進一步說明GS與GOGAT的協(xié)同作用。GS2 mRNA的表達(dá)量均高于GS1 mRNA，證明葉片中GS以GS2為主，葉片中NH4+的同化主要通過GS2與GOGAT協(xié)同作用完成。

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Li Caifeng, Xu Ying, Guo Jian, et al. Synergetic analysis of GOGAT and GS in sugar beet (Beta vulgaris L.) leaves[J]. Journal of Northeast Agricultural University, 2015, 46(4): 17-22. (in Chinese with English abstract)

Synergetic analysis of GOGAT and GS in sugar beet (Beta vulgaris L.)

leaves

/LI Caifeng, XU Ying, GUO Jian, CHEN Ming, SANG Limin, LIU Lei, WANG Yubo, MAFengming(School of Agriculture, Northeast Agricultural University, Harbin 150030, China)

Abstract:GS/GOGAT cycle is the main assimilation ways in sugar beet. This study is based on nitrogen induction of sugar beet seedings. We processed sugar beet seedings with ranges of azaserine concentrations at different time, and quantified the GS1, GS2 and GOGAT mRNA expression level using qRT-PCR method. Simultaneously GOGAT and GS enzyme activity was also determined, further to elaborate the synegy changes of two enzymes. The results showed that after azaserine treatment of sugar beet leaves, GOGAT activity began to be inhibited at 6 h, GS activity began to be inhibited at 9 h. In addition, GOGAT mRNA expression level started to decrease at 6 h, GS1 mRNA expression level began to drop at 2 h, and GS2 mRNA expression levels started to decrease at 9 h, indicated GS2/GOGAT cycle was the main synergy way in sugar beet seedlings.

Key words:sugar beet; glutamate synthase; glutamine synthetase; gene expression

作者簡介：李彩鳳（1965-），女，教授，博士，博士生導(dǎo)師，研究方向為作物生理與分子生物學(xué)。E-mail: licaifeng@neau. edu. cn

基金項目：國家自然科學(xué)基金項目（31171493）；國家甜菜現(xiàn)代產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系建設(shè)項目（CARS-210306-04）

收稿日期：2014-12-22

文章編號：1005-9369（2015）04-0017-06

文獻標(biāo)志碼：A

中圖分類號：S566.3