培元抗癌湯對(duì)小鼠大腸癌肝轉(zhuǎn)移模型血清中IL-12水平的影響

【摘要】目的建立小鼠大腸癌（CT26）肝轉(zhuǎn)移模型，研究培元抗癌湯對(duì)小鼠大腸癌肝轉(zhuǎn)移模型血清中白介素（IL）-12的影響。方法將50只昆明小鼠隨機(jī)分為5組（每組各10只）：模型對(duì)照組、陽性藥對(duì)照組（安康欣膠囊組）、培元抗癌湯大、中、小劑量組。以小鼠大腸癌（CT26細(xì)胞）懸液接種于小鼠脾臟，建立大腸癌肝轉(zhuǎn)移模型。觀察各組一般情況，對(duì)肝臟轉(zhuǎn)移結(jié)節(jié)做小鼠大腸癌肝轉(zhuǎn)移癌抑瘤率的計(jì)算，檢測(cè)小鼠大腸癌肝轉(zhuǎn)移模型血清中IL-12的表達(dá)。結(jié)果與模型對(duì)照組相比，各用藥組肝臟轉(zhuǎn)移瘤質(zhì)量均減輕（均P＜0.05），其中各用藥組間無顯著差異（P＞0.05）；安康欣膠囊組、培元抗癌湯大、中、小劑量組IL-12含量較模型對(duì)照組明顯升高（均P＜0.05）。結(jié)論培元抗癌湯可通過升高小鼠大腸癌肝轉(zhuǎn)移模型血清中IL-12的表達(dá)，進(jìn)而抑制小鼠大腸癌肝轉(zhuǎn)移的發(fā)生及發(fā)展。

【關(guān)鍵詞】大腸癌肝轉(zhuǎn)移培元抗癌湯大腸癌肝轉(zhuǎn)移IL-12

·實(shí)驗(yàn)報(bào)告·

培元抗癌湯對(duì)小鼠大腸癌肝轉(zhuǎn)移模型血清中IL-12水平的影響

王乾1張泳1楊興武1王建華1時(shí)丹丹2△

（1.陜西中醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院，陜西咸陽712000；2.陜西中醫(yī)學(xué)院第二附屬醫(yī)院，陜西咸陽712000）

【摘要】目的建立小鼠大腸癌（CT26）肝轉(zhuǎn)移模型，研究培元抗癌湯對(duì)小鼠大腸癌肝轉(zhuǎn)移模型血清中白介素（IL）-12的影響。方法將50只昆明小鼠隨機(jī)分為5組（每組各10只）：模型對(duì)照組、陽性藥對(duì)照組（安康欣膠囊組）、培元抗癌湯大、中、小劑量組。以小鼠大腸癌（CT26細(xì)胞）懸液接種于小鼠脾臟，建立大腸癌肝轉(zhuǎn)移模型。觀察各組一般情況，對(duì)肝臟轉(zhuǎn)移結(jié)節(jié)做小鼠大腸癌肝轉(zhuǎn)移癌抑瘤率的計(jì)算，檢測(cè)小鼠大腸癌肝轉(zhuǎn)移模型血清中IL-12的表達(dá)。結(jié)果與模型對(duì)照組相比，各用藥組肝臟轉(zhuǎn)移瘤質(zhì)量均減輕（均P＜0.05），其中各用藥組間無顯著差異（P＞0.05）；安康欣膠囊組、培元抗癌湯大、中、小劑量組IL-12含量較模型對(duì)照組明顯升高（均P＜0.05）。結(jié)論培元抗癌湯可通過升高小鼠大腸癌肝轉(zhuǎn)移模型血清中IL-12的表達(dá)，進(jìn)而抑制小鼠大腸癌肝轉(zhuǎn)移的發(fā)生及發(fā)展。

【關(guān)鍵詞】大腸癌肝轉(zhuǎn)移培元抗癌湯大腸癌肝轉(zhuǎn)移IL-12

大腸癌是西方國家高發(fā)腫瘤之一，發(fā)病率位居第2。近20年來，我國大腸癌發(fā)病率以平均每年4.2%的速度增加［1］。大腸癌發(fā)病率上升至惡性腫瘤的第4位。大腸癌早期雖無明顯癥狀，但就診時(shí)卻有15%～35%的患者已發(fā)生轉(zhuǎn)移，其中肝臟是最常見也是最重要的轉(zhuǎn)移部位，進(jìn)展期患者肝轉(zhuǎn)移發(fā)生率高達(dá)50%～70%左右，可切除者5年生存率為11.5%～45%，保守治療患者平均生存期只有4～9個(gè)月，故肝臟轉(zhuǎn)移是導(dǎo)致大腸癌患者死亡的重要原因之一［2］。因此，提高大腸癌肝轉(zhuǎn)移的早期診斷及治療，對(duì)提高大腸癌患者的生存率及改善預(yù)后有極其重要的意義。培元抗癌湯是具有扶正活血化瘀抗癌的方劑，其具有抑瘤、抗轉(zhuǎn)移、防復(fù)發(fā)的作用。本實(shí)驗(yàn)通過培元抗癌湯對(duì)小鼠大腸癌細(xì)胞（CT26）肝轉(zhuǎn)移模型血清白介素（IL）-12表達(dá)水平的影響，發(fā)現(xiàn)該方對(duì)小鼠大腸癌肝轉(zhuǎn)移模型中小鼠腫瘤的生長有明顯的抑制作用?，F(xiàn)報(bào)告如下。

1　材料與方法

1.1藥物經(jīng)驗(yàn)方培元抗癌湯，由西洋參、白花蛇舌草、炒白術(shù)、黃芪、土茯苓、仙鶴草、厚樸、炙甘草等組成［3］。生藥均購自陜西中醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院中藥房，于冷水中浸泡2 h，加熱至沸騰后2 h，濾液；再加入冷水加熱煮沸1.5 h，濾液；將兩次濾液混合，混合后的濾液放置水浴鍋中制備使生藥含量為3.0 g/mL的煎劑，高溫消毒后于4℃冰箱保存?zhèn)溆?。安康欣膠囊（安徽高山藥業(yè)有限公司）。5%水合氯醛與注射用青霉素鈉等（購自陜西中醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院）。

1.2動(dòng)物健康昆明小鼠50只，雌雄各半，年齡6～8周，體質(zhì)量18～22 g，由西安市長安區(qū)斗門實(shí)驗(yàn)動(dòng)物養(yǎng)殖場提供。小鼠大腸癌細(xì)胞株CT26由（西安潤德生物技術(shù)有限公司）提供。

1.3造模及給藥小鼠CT26細(xì)胞用含10%小牛血清的RPMI1640培養(yǎng)基（內(nèi)加10 mmol/L HEPES、4.5 g/L葡萄糖、1.0 mmol/L丙酮酸鈉、0.1 mmol/L非必需氨基酸、0.4 mg/mL G418），置于37℃、50 mL/L CO2恒溫箱中培養(yǎng)。取對(duì)數(shù)生長期細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。取對(duì)數(shù)生長期細(xì)胞，用0.25%胰蛋白酶及0.02%EDTA消化收集細(xì)胞，PBS洗滌重懸制成單細(xì)胞懸液。臺(tái)盼藍(lán)染色測(cè)定活細(xì)胞率≥90%。術(shù)前進(jìn)行麻醉預(yù)試驗(yàn)，根據(jù)麻醉預(yù)試驗(yàn)結(jié)果選取5%水合氯醛（5 mg/kg）麻醉，左肋緣下切口開腹，顯露脾臟，用1 mL注射器于脾被膜下緩慢注射濃度為1×106個(gè)/mL的CT26單細(xì)胞懸液0.1 mL，止血后把脾臟送回腹腔，全層縫合關(guān)腹。50只昆明小鼠造模后第2日，隨機(jī)分成5組：模型對(duì)照組9只，每日正常喂養(yǎng)；安康欣膠囊組10只，每日灌胃0.4 mL（27 mg/kg，每毫升含生藥50 mg）；培元抗癌湯小劑量組10只，每日灌胃0.4 mL（30 g/kg，每毫升含生藥1.5 g）；培元抗

1.3標(biāo)本采集及檢測(cè)（1）一般情況觀察：造模用藥后，觀察每組小鼠的進(jìn)食、飲水、毛色變化、活動(dòng)情況、對(duì)刺激的反應(yīng)，有無腹瀉、消瘦、死亡等情況，并隨時(shí)記錄。（2）出瘤時(shí)間的觀察。（3）測(cè)肝轉(zhuǎn)移癌結(jié)節(jié)重及去瘤后體質(zhì)量，計(jì)算抑瘤率：15 d后各組小鼠斷頸處死，將血收集至離心管，迅速打開腹腔分離出肝臟，去除血污等非腫瘤組織，用天平（分析天平精確1/10000 g）稱瘤重，計(jì)算抑瘤率。抑瘤率=（對(duì)照組平均瘤重-用藥組平均瘤重）/對(duì)照組平均瘤重×100%。（4）ELISA法檢測(cè)小鼠血清IL-12的表達(dá)。雙抗體夾心法測(cè)定標(biāo)本中小鼠IL-12水平。取純化的小鼠IL-12抗體包被微孔板，制成固相抗體，將包被單抗的微孔中依次加入小鼠IL-12，再與HRP標(biāo)記的羊抗鼠抗體結(jié)合，形成抗體-抗原-酶標(biāo)抗體復(fù)合物，經(jīng)過徹底洗滌后加底物TMB顯色。TMB在HRP酶的催化下轉(zhuǎn)化成藍(lán)色，并在酸的作用下轉(zhuǎn)化成最終的黃色。顏色的深淺和樣品中的IL-12呈正相關(guān)。酶標(biāo)儀下450 nm波長測(cè)定吸光度（OD值），通過標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算樣品中小鼠IL-12濃度。

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)處理應(yīng)用SPSS18.0統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)量資料以（±s）表示，多樣本均數(shù)間比較用單因素方差分析，多樣本均數(shù)間兩兩比較用t檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2　結(jié)果

2.1一般情況觀察造模前所有小鼠均活躍，體毛均勻致密，進(jìn)食飲水良好，生長狀況良好。第5日：各組小鼠均存活，培元抗癌湯組、安康欣膠囊組小鼠進(jìn)食、飲水良好，活動(dòng)靈活，反應(yīng)敏捷，毛色欠光澤，未見腹瀉及消瘦，未見惡液質(zhì)出現(xiàn)；模型對(duì)照組小鼠消瘦，毛色枯槁，活動(dòng)欠靈活，腹部出現(xiàn)不同程度膨隆，反應(yīng)尚可。第7日：培元抗癌湯組、安康欣膠囊組小鼠開始出現(xiàn)飲食減少、消瘦，精神變差，腹部出現(xiàn)膨??；模型對(duì)照組動(dòng)物瘦弱明顯，毛色干枯。第10日：培元抗癌湯組、安康欣膠囊組小鼠飲食明顯減少、消瘦，精神變差；模型對(duì)照組動(dòng)物瘦弱更明顯，有個(gè)別動(dòng)物惡液質(zhì)現(xiàn)象發(fā)生。第15日：除模型對(duì)照組1只因惡液質(zhì)死亡外，均存活。

2.2各組小鼠出瘤時(shí)間的觀察見表1。培元抗癌湯組、安康欣膠囊組出瘤時(shí)間與模型組比較有顯著差異（P＜0.05），培元抗癌湯各組與安康欣膠囊組之間比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

2.3各組間轉(zhuǎn)移瘤質(zhì)量和抑瘤率比較見表2。用藥組轉(zhuǎn)移瘤質(zhì)量明顯小于模型對(duì)照組（P＜0.05），用藥組之間比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），表明培元抗癌湯與安康欣膠囊對(duì)轉(zhuǎn)移瘤均有抑制作用。

2.4各組間小鼠血清IL-12表達(dá)水平的測(cè)定見表3。與模型對(duì)照組比較，培元抗癌湯各組和安康欣膠囊組均能升高小鼠大腸癌細(xì)胞（CT-26細(xì)胞）肝轉(zhuǎn)移小鼠IL-12表達(dá)水平（P＜0.05），培元抗癌湯各組和安康欣膠囊組比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

表1　各組小鼠岀瘤時(shí)間比較（d，±s）

表1　各組小鼠岀瘤時(shí)間比較（d，±s）

與模型對(duì)照組比較，*P＜0.05。下同。

組別n模型對(duì)照組9安康欣膠囊組10培元抗癌湯大劑量組10出瘤時(shí)間5.30±0.82 7.10±0.99*6.90±0.99*培元抗癌湯中劑量組106.40±0.84*培元抗癌湯小劑量組106.36±0.99*

表2　各組間轉(zhuǎn)移瘤質(zhì)量和抑瘤率比較（±s）

表2　各組間轉(zhuǎn)移瘤質(zhì)量和抑瘤率比較（±s）

組別n模型對(duì)照組9安康欣膠囊組10培元抗癌湯大劑量組10培元抗癌湯中劑量組10培元抗癌湯小劑量組10轉(zhuǎn)移瘤質(zhì)量（g）抑瘤率（%）2.4696±0.33960 1.4478±0.297341.38*1.4720±0.314240.39*1.5444±0.306237.47*1.5719±0.358936.35*

表3　各組小鼠血清IL-12表達(dá)水平比較（pg/mL，±s）

表3　各組小鼠血清IL-12表達(dá)水平比較（pg/mL，±s）

組別n模型對(duì)照組9安康欣膠囊組10培元抗癌湯大劑量組10 IL-12 25.87±0.97 27.67±1.03*27.78±1.73*培元抗癌湯中劑量組1028.01±2.13*培元抗癌湯小劑量組1027.41±1.58*

3　討論

約20%大腸癌患者在確診的同時(shí)發(fā)現(xiàn)有肝轉(zhuǎn)移，40%發(fā)生異時(shí)肝轉(zhuǎn)移。如不治療，大腸癌肝轉(zhuǎn)移生存4.8～9.8個(gè)月者僅50%，2年生存率僅3%，4年生存率為0，預(yù)后較差。因此，研究大腸癌轉(zhuǎn)移及抗轉(zhuǎn)移的機(jī)理對(duì)于大腸癌防治具有十分重要的意義。這些研究必需借助于適當(dāng)?shù)膭?dòng)物模型，為此本實(shí)驗(yàn)建立了小鼠CT26脾種植肝轉(zhuǎn)移小鼠模型。在本研究中，經(jīng)脾接種癌細(xì)胞的50只小鼠，除了1只造模后死亡外，其他小鼠均有不同程度的肝轉(zhuǎn)移，其肝臟表面分布有大小不等的不規(guī)則結(jié)節(jié)，轉(zhuǎn)移率為96%，成功率較高。

惡性腫瘤的發(fā)展過程中，肝臟是比較常見的轉(zhuǎn)移器官之一，單發(fā)轉(zhuǎn)移結(jié)節(jié)可積極外科手術(shù)治療，但彌漫性多發(fā)肝轉(zhuǎn)移結(jié)節(jié)則缺乏有效治療方法。近年來，免疫治療、基因治療為肝轉(zhuǎn)移腫瘤治療開辟了新的路徑。而IL-12被認(rèn)為是細(xì)胞免疫應(yīng)答過程中的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子［5-6］，已成為腫瘤免疫治療及綜合治療中的熱點(diǎn)。

培元抗癌湯是根據(jù)中醫(yī)基礎(chǔ)理論，通過豐富的臨床經(jīng)驗(yàn)，在大量臨床應(yīng)用的基礎(chǔ)上，結(jié)合現(xiàn)代藥理學(xué)研究進(jìn)展，精心研制成的抗惡性腫瘤發(fā)生、發(fā)展、復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移的中藥制劑?！罢龤獯鎯?nèi)，邪不可干”，“邪之所湊，其氣必虛”。疾病的發(fā)生、發(fā)展都是因正、邪相爭，正氣不足，正不勝邪而致，腫瘤的發(fā)生、發(fā)展和轉(zhuǎn)移亦然，故治療當(dāng)以《難經(jīng)》所言之“補(bǔ)不足，損有余”，即以扶正祛邪為立方原則。腫瘤從發(fā)生至轉(zhuǎn)移必先因正氣不足，后疾病發(fā)展而致正氣更虛，因此，扶正固本抗癌在治療腫瘤的過程中意義重大。腫瘤的主要特征是“腫塊、固定不移、痛有定處”等，其從形成開始，就存在“瘀血內(nèi)阻”的現(xiàn)象?！皻鉃檠畮?，血為氣之母”，氣能攝血行血，血能載氣化氣，氣虛則血行無力而致瘀血，瘀血內(nèi)阻化氣受限，則氣虛更重。氣虛血瘀互為因果，形成惡性循環(huán)。故腫瘤早期以血瘀為主，中期氣虛血瘀并重，到晚期則以氣血兩虛為主，基本病機(jī)是氣虛血瘀，虛實(shí)夾雜，故以益氣活血化瘀，扶正培本抗癌為治法。培元抗癌湯主要由西洋參、白花蛇舌草、炒白術(shù)、黃芪、土茯苓、仙鶴草、厚樸、炙甘草等組成，方中西洋參味甘、微苦，性涼，能益氣養(yǎng)陰，清火生津；白花蛇舌草與西洋參同用可清熱生津、補(bǔ)氣養(yǎng)陰、解毒、抗癌，二者一攻一補(bǔ)，共奏益氣養(yǎng)陰、活血化癖之效，且驅(qū)邪不傷正，共為君藥。白術(shù)健脾化濕，研究表明其能使免疫功能低下的小鼠的TH細(xì)胞數(shù)明顯增加，提高TH/TS比值，糾正TC細(xì)胞亞群分布紊亂狀態(tài)，可使低下的IL-2水平顯著提高，并能增加T淋巴細(xì)胞表面IL-2R的表達(dá)［6］；黃芪，味甘，性微溫，歸肺、脾經(jīng)，功能補(bǔ)中益氣，益衛(wèi)固表，健脾利水，托毒生?。幌生Q草具有攻堅(jiān)活血、化瘀散結(jié)止痛的功效，現(xiàn)代藥理證實(shí)，仙鶴草有抑制腫瘤細(xì)胞增殖的作用；土茯苓具有解毒、除濕、利關(guān)節(jié)的功效，可用于治療梅毒、淋濁、腫瘤等疾病，土茯苓總皂苷具有一定的抗腫瘤活性；甘草補(bǔ)脾益氣、清熱解毒、緩急止痛、調(diào)和諸藥。諸藥合用，共奏益氣養(yǎng)陰，活血化瘀，解毒消積止痛，充分體現(xiàn)了扶正而不留邪，驅(qū)邪而不傷正的治療原則。

綜上所述，培元抗癌湯中諸藥具有直接抑瘤或殺瘤細(xì)胞作用，能增強(qiáng)宿主免疫功能，抑制血栓形成及抗菌消炎。本研究結(jié)果示，培元抗癌湯對(duì)小鼠CT26肝轉(zhuǎn)移小鼠腫瘤組織及腫瘤細(xì)胞的浸潤轉(zhuǎn)移具有抑制作用，提升血清中IL-12的表達(dá)，這可能是其抗惡性腫瘤發(fā)生發(fā)展的作用機(jī)理之一，其確切機(jī)理有待進(jìn)一步研究。

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R285.5

A

1004-745X（2015）01-0109-03

10.3969/j.issn.1004-745X.2015.01.039

（電子郵箱：shidan0324@163.com）癌湯中劑量組10只，每日灌胃0.4 mL（40 g/kg，每毫升含生藥2.0 g）；培元抗癌湯大劑量組10只，每日灌胃0.4 mL（60 g/kg，每毫升含生藥3.0 g）。每日給藥1次，連續(xù)用藥15 d。

2014-10-12）