黑龍江口岸斑點熱群立克次體調(diào)查研究*

鞠文東 程 成** 付維明 王延祿 呼滿霞 梁慧杰 王紅霞 徐 寧 耿 聰

(1. 黑龍江國際旅行衛(wèi)生保健中心，哈爾濱 150001；2. 綏芬河出入境檢驗檢疫局，黑龍江綏芬河 157301；3.蘿北出入境檢驗檢疫局，黑龍江蘿北 154201；4. 同江出入境檢驗檢疫局，黑龍江同江 156401)

斑點熱群立克次體(Spotted fever groupRickettsia, SFGR)是引起斑點熱的一組病原體，可引起包括落磯山斑點熱、鈕扣熱、北亞熱、昆士蘭斑點熱、立克次體痘和日本紅斑熱在內(nèi)的多種疾病(孫秀峰等，2007)。SFGR種類繁多，目前已確認10多種對人致病的立克次體(Steveetal., 2006)，從最早發(fā)現(xiàn)的立氏立克次體，到后來逐漸發(fā)現(xiàn)的小蛛立克次體Rickettsiaakari、蒙他拿立克次體Rickettsiamontanensis和扇頭蜱立克次體R.rhipicephali，目前已發(fā)現(xiàn)多種新型的病原體(范明遠，2005)，如日本立克次體R.japonica、黑龍江立克次體R.heilongjiangii、斯洛伐克立克次體R.slovaca、非洲立克次體R.africa、虎林立克次體R.hulinii以及最新發(fā)現(xiàn)的勞氏立克次體R.raoultii和新塔拉塞維奇立克次體CandidatusR.tarasevichiae。

現(xiàn)已證實SFGR是一組經(jīng)蜱或螨叮咬傳播的專性細胞內(nèi)寄生菌，引起的斑點熱屬于自然疫源性特征的人獸共患疾病(Cameretal., 2003)。在野生動物、節(jié)肢動物與SFGR三者的生態(tài)循環(huán)中，蜱、螨既是重要的傳播媒介又是立克次體的保菌宿主(葉曉東等，2008)，尤其是黑龍江中俄口岸生物資源豐富，適合蜱類大量繁殖，具備蜱媒傳染病的生態(tài)學與生物學基礎(chǔ)(吳瓊等，2012)，所以能了解黑龍江口岸地區(qū)斑點熱群立克次體在人群、鼠類、蜱類中的分布特征是有重要意義的。本研究針對黑龍江多個口岸，從口岸人群血液樣本、鼠類樣本、蜱類樣本角度出發(fā)，在2014年4～7月份開展了針對斑點熱群立克次體監(jiān)測和實驗室檢測，現(xiàn)報告如下：

1 材料與方法

1.1 樣本的采集

1.1.1人員樣本的采集：(1)監(jiān)測地區(qū)：東寧、牡丹江、同江、密山、蘿北。(2)監(jiān)測人群：從上述口岸入出境人員中選擇如下重點人群：森林采伐、皮毛加工、畜牧業(yè)等行業(yè)從業(yè)人員；多次往返于中俄兩國的勞務(wù)人員；有發(fā)熱或其他疑似傳染病癥狀者。以上人群填寫流行病學調(diào)查表及知情同意書。(3)實驗室處理：血液樣本采用未使用抗生素的EDTA抗凝血，4 000 r/min離心5 min后，吸取血液白細胞層200 μL提取DNA(張麗娟，2005)。

1.1.2鼠類樣本的采集：(1)監(jiān)測地區(qū)：東寧、哈爾濱機場、嘉蔭、虎林、密山。(2)實驗室處理：選取鼠脾臟，低溫研磨處理，吸取200 μL勻漿液備用。

1.1.3蜱類樣本的采集：(1)監(jiān)測地區(qū)：東寧、虎林、嘉蔭、密山、綏芬河。(2)實驗室處理：將蜱在液氮下研磨至粉末狀，加入300 μL的生理鹽水，吸取200 μL液體備用。

1.2 實驗方法

1.2.1引物：引用斑點熱群立克次體編碼外膜蛋白 ompA 基因，引物名稱為Rr190.70p，Rr190.602n，目前該引物因其擴增的基因序列片段具有良好的特異性，同時能夠?qū)ζ溥M行分類。該引物已較為廣泛用于斑點熱群立克次體感染的實驗室診斷與調(diào)查研究(Regneryetal.,1991)。

1.2.2DNA提?。何街ǎ瑢?00 μL實驗樣本按照細菌基因組DNA提取試劑盒說明書進行操作。

1.2.3PCR擴增及測序：PCR反應(yīng)體系：總體積為25 μL，去離子水18.5 μL，10×PCR緩沖液2.5 μL，2.5 mmol/L的dNTP 0.5 μL，Taq DNA聚合酶0.2 μL，10 mmol/L上下游引物各0.5 μL，樣本DNA 2 μL；PCR擴增條件為95 ℃預(yù)變性5 min; 95 ℃變性30 s，54 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，38個循環(huán); 最后72 ℃延伸7 min。取PCR產(chǎn)物5 μL，用1.5 %的瓊脂糖凝膠電泳，溴化乙錠染色，凝膠成像儀觀察結(jié)果。鑒定確定后，經(jīng)PCR產(chǎn)物進行回收與純化，送與生物公司測序。所測序列與NCBI網(wǎng)上序列進行同源行比較，以確定所測菌液的種型。

2 結(jié)果

2.1 監(jiān)測結(jié)果

2.1.1人群監(jiān)測結(jié)果：將此次口岸重點監(jiān)測人群針對年齡、性別、職業(yè)進行了細化(表1)。從年齡上看，以中年人群為主，其中年齡在41～60歲的人群比例最高，為67.44 %；性別上以男性為主，占比90.69 %；職業(yè)上，農(nóng)民群體占比為92.55 %。其中部分人群有蜱叮咬史。

表1 不同口岸的人群分布特征

續(xù)表1Tab.lContinued

口岸Port因素Factor組別Group檢測人數(shù)The number of detected總計Total職業(yè)Occupation伐木工人woodcutter0其他Other0蘿北Luobei年齡Age性別Gender職業(yè)Occupation< 21021～40241～608> 600男Male9女Female1農(nóng)民Farmer10伐木工人woodcutter1其他Other010合計 Total215

2.1.2鼠類監(jiān)測結(jié)果：本次調(diào)查各口岸共捕獲鼠類動物204只，經(jīng)鑒定隸屬于3科8屬10種，名錄如下：

鼠科 Muridae

鼠屬RattusFischer,1803

褐家鼠Rattusnorvegicus(Berkenhout,1769)

小家鼠屬MusLinnaeus,1758

小家鼠MusmusculusLinnaeus,1758

姬鼠屬ApodemusKaup,1829

黑線姬鼠Apodemusagrarius(Pallas,1771)

大林姬鼠Apodemusspeciosus(Temminck,1845)

倉鼠科 Cricetidae

倉鼠屬CricetulusMine-Edwards,1867

大倉鼠Cricetulustriton(de Winton,1899)

田鼠屬Microtus(Schrant,1798)

東方田鼠Microtusfortis(Buchner,1889)

松鼠科 Sciuridae

花鼠屬Eutamias(Trouessont,1880)

花鼠Eutamiassibiricus(Laxmann,1769)

黃鼠屬Citellus(Curier,1825)

達烏爾黃鼠Citellusdauricus(Brand，1844)

從各口岸鼠的監(jiān)測結(jié)果可以看出，黑線姬鼠為優(yōu)勢鼠種，其次為褐家鼠，其中除哈爾濱機場，黑線姬鼠在各口岸的監(jiān)測比例均超過50%，占捕鼠總數(shù)的52.94%。(表2)

2.1.3蜱類監(jiān)測結(jié)果：本次調(diào)查各口岸共捕獲蜱188只，共4種，分別是森林革蜱Dermacentorsilvarum、全溝硬蜱Ixodespersulcatus、嗜群血蜱Haemaphysalisconcinna、日本血蜱Hae.japonica。從表3可以看出，每個口岸的優(yōu)勢蜱種并不相同，這可能與地區(qū)分布和時間有關(guān)。

2.2 SFGR檢測結(jié)果

2.2.1人群中SFGR檢測結(jié)果：經(jīng)實驗室檢測，在所調(diào)查的口岸出入境人員中，并未檢出斑點熱群立克次體感染者。

2.2.2鼠類中SFGR檢測結(jié)果：在哈爾濱太平國際機場、嘉蔭兩個口岸捕獲的鼠脾臟樣本中分別檢出斑點熱群立克次體，經(jīng)測序鑒定比對后發(fā)現(xiàn)，兩例陽性樣本與勞氏立克次體MDJ4株(GenBank；JX885458)同源性最高(99.16 %～ 99.79%)，動物宿主分別是大倉鼠和小家鼠。這是首次在黑龍江口岸鼠類中檢測出R.raoultii。(表4)

2.2.3蜱類中SFGR檢測結(jié)果：本研究在所檢測的188份樣本中，共檢測出斑點熱群立克次體的陽性樣本101例，感染率高達53.7 %，經(jīng)測序鑒定比對后，與勞氏立克次體 Dsm2 株(KF003015)同源性最高(98.57 %～ 99.59 %)，確定R.raoultii89例；與新塔拉塞維奇立克次體C3H3株(KF008252)同源性最高(96.65 %～ 99.79 %)，確定C.R.tarasevichiae11例；與黑龍江立克次體 054株(CP002912)同源性最高達99.79 %，確定R.heilongjiangii1例。森林革蜱是感染勞氏立克次體的優(yōu)勢蜱種，而在全溝硬蜱中檢測出的C.R.tarasevichiae，這也是在黑龍江口岸地區(qū)首次在全溝硬蜱中檢測出C.R.tarasevichiae。(表4、5)

表2 不同口岸鼠分布特征Tab.2 Rodents collected in different ports

表3 不同口岸蜱分布特征Tab.3 Ticks distribution of different ports

3 結(jié)論

人感染SFGR的典型的臨床癥狀出現(xiàn)在蜱叮咬后的6～10 d，并伴有發(fā)熱、頭痛、肌肉酸痛等臨床癥狀(Brouquietal., 2004)，但人感染SFGR的報道并不多見，2013年10月，曹務(wù)春等在中國東北地區(qū)251例因蜱蟲叮咬患者中檢測到新型立克次體C.R.tarasevichiae，引起了黑龍江口岸一線人員對出入境人員可能存在SFGR感染的高度關(guān)注(Jiaetal., 2013)。此次在215份出入境人群血液樣本中未檢出SFGR感染陽性樣本，分析原因，其一為樣本絕對數(shù)目較少；其二為本實驗未應(yīng)用血清樣本檢測，對于無臨床癥狀的人群采用全血檢測可能敏感性不高，下一步應(yīng)完善血清檢測結(jié)果，與全血檢測結(jié)果形成對比，對人群感染性分析更為準確；其三為按照預(yù)設(shè)目標獲得的樣本多數(shù)為農(nóng)民勞務(wù)群體，大多無發(fā)熱、皮疹等臨床癥狀，該類人群雖然存在蜱叮咬可能，但幾率較低。對于林業(yè)從業(yè)人員等暴露風險較大的重點出入境人群，由于受到俄羅斯近年來相關(guān)政策原因，造成近期經(jīng)黑龍江各口岸出入境的相關(guān)人群數(shù)量銳減，本次研究獲得該類人群的數(shù)量更少。

表4 斑點熱群立克次體檢測結(jié)果Tab.4 Detection results of spotted fever group rickettsia

表5 斑點熱群立克次體分型結(jié)果Tab.5 Genotyping results of spotted fever group rickettsia

2007年黑龍江口岸對SFGR感染調(diào)查時發(fā)現(xiàn)北亞蜱疹傷寒R.sibirica在蜱中感染率最高，其次是黑龍江立克次體R.heilongjiangii和虎林立克次體R.hulinii(孫秀鋒等，2007)，相對于2007年的調(diào)查，本年度的調(diào)查發(fā)生了巨大變化，勞氏立克次體作為新型SFGR的普遍存在于蜱中，根據(jù)此次調(diào)查，勞氏立克次體總感染率達到47.34 %(89/188)，新塔拉塞維奇立克次體感染率為5.85 %(11/188)，而黑龍江立克次體感染率僅為0.53 %(1/188)。這種明顯的的變化和勞氏立克次體的高感染率值得口岸一線人員的重點關(guān)注。

調(diào)查數(shù)據(jù)顯示，森林革蜱感染勞氏立克次體的感染率為65.96 %、全溝硬蜱感染率為33.3 %、嗜群血蜱感染率為18.4 %、日本血蜱感染率為58.3 %，學者在對黑河地區(qū)勞氏立克次體檢測時發(fā)現(xiàn)，森林革蜱感染率最高可達97 %(Wenetal., 2014)，并可通過經(jīng)卵和經(jīng)期傳播，在體內(nèi)可維持4～7代(Samoylenkoetal., 2009)。結(jié)合本次黑龍江中俄其他口岸，我們分析可能是森林革蜱對勞氏立克次體有較高的感染性和病原保存性。

本研究首次在黑龍江口岸地區(qū)鼠類的脾臟中檢出勞氏立克次體，分別是在大倉鼠和小家鼠的脾臟中檢出，感染率為1.00 %(2/204)。1999年，勞氏立克次體首次在西伯利亞的草原革蜱中分離(Rydkinaetal., 1999)，2002年，勞氏立克次體又在一名被蜱蟲叮咬的法國患者中分離(Mediannikovetal., 2008)，勞氏立克次體作為一種新型SFGR逐漸受到研究者的關(guān)注。蜱蟲在生長發(fā)育的過程中，其作為一種SFGR的傳播媒介，每一次蛻化通常需要飽血于嚙齒動物、野兔或鼠兔(Wenetal., 2014)，因此鼠作為易感宿主，同樣參與了SFGR的生態(tài)循環(huán)，本文印證了這一推論。

本研究在黑龍江口岸地區(qū)全溝硬蜱中首次檢測到新塔拉塞維奇立克次體。據(jù)報道新塔拉塞維奇立克次體對人群存在致病性，而且臨床癥狀與其他斑點熱群立克次體感染者有所不同，感染患者不會出現(xiàn)任何皮膚斑點，但蜱蟲叮咬處會出現(xiàn)焦痂和淋巴結(jié)腫痛等臨床表現(xiàn)，更嚴重者會出現(xiàn)嚴重的中樞神經(jīng)系統(tǒng)癥狀和腦膜刺激征，最終死于腎功能衰竭和呼吸性酸中毒(Jiaetal., 2013)，提示該種新病原體可引起與已知蜱傳斑點熱不同的臨床癥狀。勞氏立克次體和塔氏立克次體在黑龍江口岸地區(qū)的發(fā)現(xiàn)是蜱媒病的防治和口岸衛(wèi)生監(jiān)測檢驗的新挑戰(zhàn)。建立敏感的檢測技術(shù)形成有效的監(jiān)測體系對于維護口岸生物安全，保障人民健康具有重要的作用。