基于磁性微球的免疫熒光法對癌胚抗原的檢測

李 蓉,馮 鋒,*,陳澤忠,白云峰,郭芳芳,吳芳英,周 高

（1.山西大同大學(xué)化學(xué)與環(huán)境工程學(xué)院，山西大同037009;2.南昌大學(xué)化學(xué)學(xué)院，江西南昌330047）

基于磁性微球的免疫熒光法對癌胚抗原的檢測

李 蓉2,馮 鋒1,2*,陳澤忠1,白云峰1,郭芳芳1,吳芳英2,周 高2

（1.山西大同大學(xué)化學(xué)與環(huán)境工程學(xué)院，山西大同037009;2.南昌大學(xué)化學(xué)學(xué)院，江西南昌330047）

采用雙夾心磁性微球免疫熒光顯微法對樣品中的癌胚抗原進(jìn)行分離與檢測。首先用EDC/NHS對磁性微球表面的羧基進(jìn)行活化后偶聯(lián)抗癌胚抗原單克隆抗體mAbCEA-C3制成免疫磁珠，再對樣品中的CEA進(jìn)行捕獲，并進(jìn)行免疫標(biāo)記，最后用熒光顯微鏡進(jìn)行檢測。考察洗滌次數(shù)和免疫時間等因素對實(shí)驗(yàn)的影響，在最優(yōu)條件下對CEA進(jìn)行檢測，結(jié)果表明：隨著CEA濃度的增加熒光強(qiáng)度逐漸增強(qiáng)，檢測限為9.67 ng/mL，可實(shí)現(xiàn)對CEA的定性和半定量測定。該方法操作簡單快捷，樣品用量少，選擇性好，可應(yīng)用于臨床檢驗(yàn)。

磁性微球；免疫熒光；癌胚抗原

癌胚抗原（Carcinoembryonic antigen，CEA）是一種廣泛應(yīng)用于胃腸道、乳腺癌和肺癌的腫瘤標(biāo)志物，其分子量約為180 kDa[1]。CEA在正常人體內(nèi)的含量約為2.5 ng/mL，在吸煙者體內(nèi)的含量約為5.0 ng/mL[2]。當(dāng)人體內(nèi)的組織發(fā)生病變或癌變時，CEA的濃度就會升高。因此，建立一種簡單、靈敏、快速、準(zhǔn)確的CEA檢測方法對腫瘤的鑒別診斷、病情檢測及療效評價等方面有重要的臨床價值。

目前檢測CEA的方法主要有電化學(xué)法[3-5]、熒光免疫法[6-8]、酶聯(lián)免疫法[9]、化學(xué)發(fā)光法[10-12]。這些方法存在一些缺點(diǎn)，如前處理復(fù)雜、需要標(biāo)記、檢測時間較長等。免疫磁珠既具有免疫分析的高特異性又具有磁性納米微球的超順磁性，分離過程高保真等優(yōu)點(diǎn)，將免疫磁珠和免疫熒光分析結(jié)合在一起，分離過程消耗時間少，效率高，把分離和富集結(jié)合在一起，對樣品的生物活性損耗幾乎可以忽略，實(shí)驗(yàn)操作簡單，靈敏度高，不需要昂貴的外用儀器，被廣泛應(yīng)用于各個領(lǐng)域[13-15]，在腫瘤標(biāo)志物檢測中已有應(yīng)用[16]。本文中使用羧基磁性微球?yàn)楣滔噍d體，通過EDC/NHS活化羧基偶聯(lián)抗體制成免疫磁珠，對CEA進(jìn)行捕獲，使用bio-mAbCEA進(jìn)行夾心，使用Avidin-FITC進(jìn)行熒光標(biāo)記，將磁珠免疫復(fù)合物制片放于正置熒光顯微鏡下進(jìn)行觀察，對CEA進(jìn)行了定性和半定量檢測，從而建立了一種結(jié)合磁性微球和免疫熒光的新型腫瘤標(biāo)志物分析方法。

1 實(shí)驗(yàn)方法

1.1 儀器與試劑

正置熒光顯微鏡（BX63）(奧林巴斯，日本)，漩渦振蕩器（IKA lab dancer，德國），溶劑過濾器及0.22 μm（水系）微孔濾膜購于天津市東康科技有限公司，超順磁性聚合物納米微球（羧基修飾，750 nm）、磁分離架購于上海奧潤微納新材料科技有限公司，氣浴恒溫振蕩器購于上海喬躍電子有限公司，N-羥基琥珀酰亞胺(N-hydroxysuccinimide，NHS)、N-乙基-N-（二甲氨基丙基）碳二亞胺(NEthyl-N'-(dimethyaminopropyl)-carbodiimide，EDC)購于Sigma公司，牛血清蛋白（BSA）、2-(N-嗎啉)乙磺酸（MES）購于阿拉丁，癌胚抗原(CEA)標(biāo)準(zhǔn)品、甲胎蛋白（AFP）、前列腺特異性抗原（PSA）購自鄭州博賽生物技術(shù)有限公司，mAbCEA-C3、mAbCEAB5、bio-mAbCEA-B5、異硫氰酸熒光素修飾的親和素（Avidin-FITC）購自北京博奧森生物技術(shù)有限公司。其余所有試劑均為分析純，實(shí)驗(yàn)所用水為二次蒸餾水。

1.2 免疫磁球的制備

免疫磁球制備原理如圖1所示，使用EDC/NHS法，在磁珠表面偶聯(lián)特異性抗體。

EDC/NHS活化磁珠：①取50μLL PM3-050磁珠于500μLL離心管中，用200μLMES/T（10 mmol/L pH 5.0）洗滌2次，磁分離后移除上清；②向其中加入新配制的EDC,NHS溶液各100μL，渦旋混勻使磁珠充分懸浮，在氣浴恒溫振蕩器中37℃活化30 min。③磁分離移除上清，加入200 μLMES/T（10 mmol/L pH 5.0）洗滌2次，磁分離后移除上清。

mAbCEA-C3的共價偶聯(lián)：①加入50μLmg mAbCEA-C3于上述活化的磁珠中，用PB溶液調(diào)節(jié)總體積至200μL，渦旋混勻使磁珠充分懸浮，在氣浴恒溫振蕩器中37℃活化3 h。②磁分離移除上清，加入200 μLPBS/T（10 mmol/L pH 7.4）洗滌2次，加入500 μLPBS/T(pH 7.4,含1%BSA)使磁珠重新處于懸浮狀態(tài)，將氣浴恒溫振蕩器中溫度調(diào)為37℃，振蕩封閉1 h，磁珠在該期間保持懸浮狀態(tài)。③磁分離移除上清，加入200μLPBS/T（10 mmol/L pH 7.4）洗滌4次，磁珠用500 μLPBS/T(pH 7.4,含0.5%BSA、0.02%NaN3)使之重新處于懸浮狀態(tài)，放于4℃的冰箱中保存。

圖1 羧基磁球與抗體的偶聯(lián)示意圖

1.3 夾心熒光免疫分析法對CEA的檢測

CEA的檢測的流程如圖2所示。具體操作步驟為：①取若干支500μL的離心管，向其中加入500 μLPBS(pH 7.4，含1%BSA)溶液，在氣浴恒溫振蕩器中37℃振蕩1 h，然后使用PBS/T(10 mmol/L，pH 7.4)洗滌3次，用氮?dú)獯蹈蓚溆?；②在包被好的離心管中分別加入15μL4.2.2中制備的免疫磁珠，使用100μLPBS/T溶液洗滌2次，磁分離，棄上清；③分別向每支離心管中加入15μL不同濃度的CEA溶液，使用PBS定容至100μL，在恒溫振蕩器中37℃振蕩45 min；④磁分離，100μL PBS/T洗滌3次，棄去上清液，加入15μL濃度為 1.5 μg/mL bio-mAbCEA-B5，在恒溫振蕩器中37℃振蕩45 min；⑤磁分離，100μLPBS/T洗滌3次，棄去上清液，加入15μL濃度為1.5 μg/mL Avidin-FITC，氣浴恒溫振蕩器中37℃振蕩45 min；⑥磁分離，100μLPBS/T洗滌3次，將上清液去除，使之重新懸浮于30μLPBS中，取10μL免疫復(fù)合微球滴在載玻片上，加入5μL熒光抗猝滅劑，蓋上蓋玻片，制片，在正置熒光顯微鏡下使用100×油鏡進(jìn)行熒光檢測，曝光時間設(shè)為800 ms，照片采集、曝光時間一致。

1.4 選擇性實(shí)驗(yàn)

為了驗(yàn)證方法的特異性，在相同的條件下，使用AFP和PSA替代CEA進(jìn)行1.3中的檢測，并記錄結(jié)果，其中PSA,AFP的濃度遠(yuǎn)大于CEA的濃度,為1μg/mL。

圖2 熒光免疫分析示意圖

2 結(jié)果與討論

2.1 免疫結(jié)合時間選擇

改變1.3的實(shí)驗(yàn)步驟中的免疫結(jié)合時間，對濃度為300 ng/mL的CEA進(jìn)行處理，在正置顯微鏡下觀察，拍照，使用Image-Pro?Plus 7.0分析其線性熒光強(qiáng)度，不同免疫結(jié)合時間對免疫磁球復(fù)合物在正置熒光顯微鏡下的線性熒光強(qiáng)度影響如圖3所示。從圖3中可以看出，免疫結(jié)合時間在10～90 min時，線性熒光強(qiáng)度隨時間延長增大，當(dāng)結(jié)合時間為45 min時，磁珠免疫復(fù)合物形成效率相對最高，45～90 min之間線性熒光強(qiáng)度趨于平緩。原因是免疫結(jié)合時間過短，抗原抗體之間結(jié)合不充分，結(jié)合的穩(wěn)定程度還不高，在實(shí)驗(yàn)中反復(fù)的洗滌、分離，因而效率較低，因此，我們選擇免疫結(jié)合實(shí)際時間為45 min。

圖3 免疫結(jié)合時間對磁球免疫復(fù)合物熒光強(qiáng)度的影響

2.2 洗滌次數(shù)對陰性對照的影響

在陰性對照組中，使用PBS/T在洗滌的次數(shù)對最后的檢測具有很重要的影響。洗滌次數(shù)過少，容易造成假陽性，故在本實(shí)驗(yàn)中考查了洗滌次數(shù)對檢測的影響，實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖4所示，洗滌次數(shù)過少，由于bio-mAbCEA-B5與Avidin-FITC結(jié)合形成的復(fù)合物非特異性的吸附到免疫磁珠上形成假陽性。隨著洗滌次數(shù)的增加，空白對照的熒光強(qiáng)度逐漸減弱，當(dāng)洗滌3次時，制片測得的熒光強(qiáng)度可以忽略，為節(jié)省時間，實(shí)驗(yàn)中選擇使用PBS/T洗滌3次。

圖4 洗滌次數(shù)對陰性對照的影響

2.3 熒光顯微檢測與熒光強(qiáng)度分析

在本實(shí)驗(yàn)中，我們使用Image-Pro?Plus 7.0和Sigmaplot 12.0軟件獲取和分析熒光免疫分析的數(shù)據(jù)。分析結(jié)果如圖5所示，CEA濃度為300,200,50 ng/mL時捕獲的熒光微球照片如圖A,B,C所示，使用Image-Pro?Plus 7.0軟件對其線性熒光強(qiáng)度進(jìn)行分析，波峰和波谷分別代表微球和背景的熒光強(qiáng)度，分析結(jié)果如圖a,b,c所示，由圖6看出隨CEA濃度增大，線性熒光強(qiáng)度增強(qiáng)，且各濃度熒光強(qiáng)度之間存在差異，對照熒光強(qiáng)度較弱或基本無熒光。熒光強(qiáng)度與CEA濃度在25～300 ng/mL之間線性關(guān)系良好，不勝數(shù)線性方程為Y=0.7153X+21.5659，檢測限為9.67 ng/mL。

A,B,C對應(yīng)CEA濃度分別為300,200,50 ng/mL，a,b,c是對應(yīng)的Image-Pro?Plus 7.0線性熒光強(qiáng)度分析結(jié)果

圖5 免疫復(fù)合物的熒光照片

圖6 正置熒光顯微鏡檢測免疫磁球復(fù)合物的線性熒光強(qiáng)度與CEA濃度關(guān)系圖

2.4 選擇性實(shí)驗(yàn)

在同樣的條件參數(shù)下，按1.3的實(shí)驗(yàn)步驟對AFP,PSA進(jìn)行同樣的處理，制片，在正置熒光顯微鏡下進(jìn)行觀察，熒光較弱，基本可以忽略，說明此磁球熒光免疫分析具有較好的特異性，選擇性良好。

3 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)采用免疫熒光法結(jié)合免疫微球?qū)EA進(jìn)行分離檢測。首先在磁性微球上通過EDC/NHS對抗體進(jìn)行偶聯(lián)，制成免疫磁珠對樣品中的CEA進(jìn)行捕獲，在使用免疫熒光法時，洗滌次數(shù)對檢測的假陽性影響很大，我們考察了洗滌次數(shù)和免疫時間的影響，最后選擇洗滌3次，免疫反應(yīng)時間為45 min，在最優(yōu)條件下對CEA進(jìn)行檢測，樣品消耗量僅為15μL，發(fā)現(xiàn)隨著CEA濃度的增加熒光強(qiáng)度逐漸增強(qiáng)，檢測限為9.67 ng/mL，實(shí)現(xiàn)了對CEA的定性和半定量分析，實(shí)現(xiàn)了對CEA快速高效檢測，與傳統(tǒng)分析方法相比較，此法操作簡單，所需儀器簡單，樣品用量少，選擇性好，有望應(yīng)用于臨床檢驗(yàn)。

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Determination of Carcinoembryonic Antigen Based on Magnetic Microsphere Assited Fluoroimmunoassay

LI Rong2,FENG Feng1,2,*,CHEN Ze-zhong1,BAI Yun-feng1,GUO Fang-fang1,WU Fang-ying2,ZHOU Gao2
(1.College of Chemistry and Environmental Engineering,Shanxi Datong University,Datong Shanxi 037009;2.School of Chemistry,Nanchang University,Nanchang Jiangxi,330047)

A novel immunoassay for the determination of CEA was established by combining a fluoroimmunoassay and immunomagnetic separation.Carboxyl groups on the magnetic beads were first activated with a mixture of EDC and NHS to give reactive succinimide esters.The mAbCEA-C3 was then passed over the surface and esters react spontaneously with amino groups to link mAbCEAC3 covalently to magnetic beads to form Immonumagnetic beads(IBMs).In the mixture samples,CEA was captured by mAbCEA-C3 with high specificity and affinity.The conditions,such as washing times and immune reaction time were optimized.The final choice of immune time is 45min,three times of washing.The results indicated that the fluorescence intensity increased with the increment of CEA concentration in the optimal condition.The LOD is 9.67 ng/mL.Qualitative and semiquantitative detection of CEA was conducted based on the combination of IBMs with fluoroimmunoassay.The method is simple and sensitive and could be a possible application for the detection of CEA in clinical diagnostics.

magnetic microspheres;fluoroimmunoassay;carcinoembryonic antigen

73-3

A

1674-0874(2015)04-0033-05

2015-05-15

李蓉(1988-),女，湖北恩施人，在讀碩士，研究方向：SPR生物傳感器。?馮鋒，男，博士，教授，通信作者。

〔責(zé)任編輯 楊德兵〕