植物乳桿菌L-45發(fā)酵南極磷蝦殼的影響因素研究

姜啟興，陳雪姣，許兆濱，許艷順，劉富俊，于沛沛，夏文水，*

（1．江南大學(xué)食品學(xué)院，江蘇無(wú)錫214122；2．遼寧省大連海洋漁業(yè)集團(tuán)公司，遼寧大連116113）

植物乳桿菌L-45發(fā)酵南極磷蝦殼的影響因素研究

姜啟興1，陳雪姣1，許兆濱2，許艷順1，劉富俊2，于沛沛1，夏文水1，*

（1．江南大學(xué)食品學(xué)院，江蘇無(wú)錫214122；2．遼寧省大連海洋漁業(yè)集團(tuán)公司，遼寧大連116113）

本文對(duì)植物乳桿菌L-45發(fā)酵南極磷蝦殼進(jìn)行了研究。研究了外加碳源、發(fā)酵時(shí)間、發(fā)酵溫度等因素對(duì)發(fā)酵過(guò)程中植物乳桿菌L-45產(chǎn)乳酸的變化及蝦殼脫鈣率的影響。確定了較好的發(fā)酵條件為：發(fā)酵周期48h，發(fā)酵溫度37℃，葡萄糖添加量為10%，料液比為1∶1，接種量為6%，此條件下脫鈣率為84.6%，得到的甲殼素與傳統(tǒng)化學(xué)法相比，性質(zhì)相近，且對(duì)環(huán)境污染小。

植物乳桿菌，南極磷蝦殼，pH，脫鈣率

南極磷蝦分布在南大洋輻合區(qū)以南的水域，屬甲殼動(dòng)物綱磷蝦目，其成體雖小，但生物量龐大，科學(xué)家最新的估計(jì)是6.5～10億噸，是人類可以利用的最大蛋白資源，具有較高的開發(fā)價(jià)值［1］。南極水域的磷蝦種類很多，常見(jiàn)的是南極大磷蝦（Euphausia superb），南極磷蝦的開發(fā)利用始于上世紀(jì)60年代［2］，是人類重要的后備蛋白庫(kù)［3］，除富含蛋白外，還富含亞油酸、亞麻酸等不飽和脂肪酸及鈣、鉀、鎂、鍶等多種礦物質(zhì)元素，且類胡蘿卜素色素含量高［4-5］。目前，國(guó)內(nèi)外研究更多的是南極磷蝦肉中蛋白、脂溶性成分等的分離和應(yīng)用［6］，對(duì)磷蝦殼資源的研究較少。

蝦殼大多作為廢棄物丟棄，亟需有效的開發(fā)利用，例如利用蝦殼廢棄物制備甲殼素，但是目前的技術(shù)存在明顯不足：如一般采用強(qiáng)酸脫鈣和強(qiáng)堿脫蛋白，不僅對(duì)甲殼素的分子鏈有一定的破壞，且能耗高，對(duì)環(huán)境污染較嚴(yán)重，而且其中的蛋白、鈣質(zhì)等礦物質(zhì)均無(wú)法回收［7］。國(guó)外已有利用微生物發(fā)酵，對(duì)蝦蟹等廢棄物進(jìn)行生物發(fā)酵制備甲殼素的研究，Zakaria［8］使用副干酪乳桿菌發(fā)酵蝦殼，蛋白質(zhì)去除率為77.5%。Jung［9］使用了副干酪乳桿菌發(fā)酵蟹殼，最終脫蛋白率達(dá)到52%。該方法比傳統(tǒng)的酸堿法反應(yīng)更溫和、甲殼素結(jié)構(gòu)更穩(wěn)定，成本低，是一種節(jié)能環(huán)保的清潔生產(chǎn)方法，發(fā)酵殘?jiān)礊榇旨讱に兀梢詫?shí)現(xiàn)對(duì)資源全面有效的利用，并且易于實(shí)現(xiàn)工業(yè)化生產(chǎn)［10］。

從上述可見(jiàn)關(guān)于干酪乳桿菌發(fā)酵蝦蟹殼國(guó)內(nèi)外已有研究報(bào)道，本研究以實(shí)驗(yàn)室篩選出的高產(chǎn)乳酸的植物乳桿菌L-45發(fā)酵南極磷蝦殼，利用發(fā)酵產(chǎn)生的乳酸脫除蝦殼中的碳酸鈣，研究發(fā)酵過(guò)程中磷蝦殼的pH及脫鈣率的變化情況，優(yōu)化發(fā)酵脫鈣條件。

1　材料與方法

1.1材料與設(shè)備

南極磷蝦（Euphausia superb） 遼寧省大連海洋漁業(yè)集團(tuán)公司提供，于-18℃凍藏，冷凍南極磷蝦自然解凍，經(jīng)采肉機(jī)采肉三次后得南極磷蝦殼，于-18℃凍藏備用；植物乳桿菌L-45（Lactobacillus plantarum）

為食品學(xué)院食品加工與配料中心實(shí)驗(yàn)室保藏菌種，活化后備用。

JB 5374-91電子天平、FE20實(shí)驗(yàn)室pH計(jì)梅特勒-托利多（上海）有限公司；YCR-180采肉機(jī)上海華夏漁業(yè)機(jī)械儀器工貿(mào)公司；501型超級(jí)恒溫器上海市實(shí)驗(yàn)儀器廠；90-2恒溫磁力攪拌器上海亞榮生化儀器廠；電熱恒溫水槽上海一恒科學(xué)儀器有限公司；電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱上海躍進(jìn)醫(yī)療器械廠；UV1000紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)上海天美科學(xué)儀器有限公司；4K-15高速冷凍離心機(jī)Sigma公司；THZ-D恒溫振蕩器太倉(cāng)市豪誠(chéng)實(shí)驗(yàn)儀器制造有限公司。

1.2實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1外加碳源對(duì)植物乳桿菌發(fā)酵蝦殼發(fā)酵產(chǎn)酸和蝦殼脫鈣率的影響稱取經(jīng)枯草芽孢桿菌發(fā)酵脫蛋白后的蝦殼殘?jiān)?5g，分別添加等量碳源（葡萄糖、果糖、乳糖、可溶性淀粉、淀粉、麥芽糊精），添加量均為10%；接種5%植物乳桿菌菌液，于37℃發(fā)酵12、24、36、48、60、72h，測(cè)發(fā)酵液pH；每個(gè)樣品平行3次，確定最合適的碳源。

1.2.2發(fā)酵時(shí)間對(duì)植物乳桿菌發(fā)酵蝦殼發(fā)酵產(chǎn)酸和蝦殼脫鈣率的影響稱取經(jīng)枯草芽孢桿菌發(fā)酵脫蛋白后的蝦殼殘?jiān)?5g，接種5%植物乳桿菌菌液，料液比為1∶2，10%的葡萄糖，于37℃發(fā)酵12、24、36、48、60、72h后分別測(cè)發(fā)酵液pH，灰分變化；每個(gè)樣品平行3次，確定最合適的發(fā)酵時(shí)間。

1.2.3葡萄糖添加量對(duì)植物乳桿菌發(fā)酵蝦殼發(fā)酵產(chǎn)酸和蝦殼脫鈣率的影響稱取經(jīng)枯草芽孢桿菌發(fā)酵脫蛋白后的蝦殼殘?jiān)?5g，接種5%植物乳桿菌菌液，料液比為1∶2，葡萄糖添加量分別為5%、10%、15%、20%、25%，于37℃發(fā)酵48h測(cè)發(fā)酵液pH，灰分變化；每個(gè)樣品平行3次，確定最合適的葡萄糖添加量。

1.2.4發(fā)酵溫度對(duì)植物乳桿菌發(fā)酵蝦殼發(fā)酵產(chǎn)酸和蝦殼脫鈣率的影響稱取經(jīng)枯草芽孢桿菌發(fā)酵脫蛋白后的蝦殼殘?jiān)?5g，接種5%植物乳桿菌菌液，料液比為1∶2，葡萄糖添加量為10%，分別于30、35、37、40、45℃發(fā)酵48h測(cè)發(fā)酵液pH，灰分變化；每個(gè)樣品平行3次，確定最合適的發(fā)酵溫度。

1.2.5接種量對(duì)植物乳桿菌發(fā)酵蝦殼發(fā)酵產(chǎn)酸和蝦殼脫鈣率的影響稱取已經(jīng)脫蛋白的下腳料殘?jiān)?5g，料液比為1∶2，葡萄糖添加量為10%，接種量分別為1%、2%、4%、6%、8%、10%，于37℃發(fā)酵48h測(cè)發(fā)酵液pH，灰分變化；每個(gè)樣品平行3次，確定最合適的接種量。

1.2.6料液比對(duì)植物乳桿菌發(fā)酵蝦殼發(fā)酵產(chǎn)酸和蝦殼脫鈣率的影響稱取經(jīng)枯草芽孢桿菌發(fā)酵脫蛋白后的蝦殼殘?jiān)?5g，葡萄糖添加量為10%，接種量分別為5%，料液比分別為1∶0.5、1∶1、1∶2、1∶3、1∶4，于37℃發(fā)酵48h測(cè)發(fā)酵液pH，灰分變化；每個(gè)樣品平行3次，確定最合適的料液比。

1.2.7傳統(tǒng)酸堿法與生物發(fā)酵法制備的甲殼素基本成分比較分析生物發(fā)酵法：稱取經(jīng)枯草芽孢桿菌發(fā)酵脫蛋白后的蝦殼殘?jiān)?5g，植物乳桿菌接種量6%，料液比為1∶1，葡萄糖添加量10%，于37℃發(fā)酵48h后，過(guò)濾酶解液得甲殼素濾渣，蒸餾水沖洗至中性，烘干后測(cè)定基本成分。傳統(tǒng)酸堿法：稱取50g南極磷蝦殼，用500mL 5%鹽酸浸泡24h，每4h攪拌一次，紗布過(guò)濾后水洗至中性，用6%氫氧化鈉溶液煮沸1h，紗布過(guò)濾，濾渣水洗至中性后烘干測(cè)定其基本成分。

1.3分析方法

1.3.1脫鈣率的測(cè)定脫鈣率的測(cè)定參照Aytekin［11］，按照以下公式計(jì)算：

1.3.2甲殼素得率的測(cè)定甲殼素得率［12］（%）=甲殼素的質(zhì)量/加工下腳料的質(zhì)量×100

1.4數(shù)據(jù)處理

數(shù)據(jù)分析采用SPSS軟件；數(shù)據(jù)繪圖采用Origin 8.0軟件。

2　結(jié)果與分析

2.1不同實(shí)驗(yàn)因素對(duì)發(fā)酵產(chǎn)酸及脫鈣率的影響

2.1.1碳源的選擇對(duì)植物乳桿菌產(chǎn)酸的影響由圖1可以看出，以葡萄糖作為碳源時(shí)，發(fā)酵液的pH最低。此外，可以發(fā)現(xiàn)以淀粉為碳源的發(fā)酵液pH最高，且難以抑制腐敗菌生長(zhǎng)，從而使發(fā)酵液發(fā)生腐敗。雖然蔗糖和果糖作為碳源時(shí)，植物乳桿菌的產(chǎn)酸效果也很好，但其成本較高，綜合考慮，最終選擇葡萄糖作為碳源。

圖1　碳源的選擇對(duì)發(fā)酵產(chǎn)酸的影響Fig.1　pH trends during fermentation with different carbon source

2.1.2發(fā)酵時(shí)間對(duì)植物乳桿菌產(chǎn)酸及蝦殼脫鈣率的影響由圖2可見(jiàn)，在12～72h內(nèi)，發(fā)酵液的pH迅速降低，pH達(dá)到3.5左右，此后變化趨緩；此外，蝦殼發(fā)酵脫鈣率在12～48h內(nèi)呈急劇增高趨勢(shì)，之后增長(zhǎng)速度趨于平緩，產(chǎn)生此結(jié)果的原因可能是植物乳桿菌在48h前碳源、氮源等充足，微生物代謝旺盛，但超過(guò)48h后，隨著營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的減少以及產(chǎn)物的反饋抑制，從而產(chǎn)酸變緩，pH下降不顯著。較高的酸度有利于蝦殼中鈣的脫除和抑制腐敗現(xiàn)象的發(fā)生，而超過(guò)48h后發(fā)酵液的pH下降已不顯著，因此，發(fā)酵時(shí)間選擇48h左右比較合適。

圖2　發(fā)酵時(shí)間對(duì)植物乳桿菌產(chǎn)酸及蝦殼脫鈣率的影響Fig.2　pH trends and DM rate during fermentation with different fermentation time

2.1.3葡萄糖添加量對(duì)植物乳桿菌產(chǎn)酸及蝦殼脫鈣率的影響在乳酸菌脫鈣的研究中，添加葡萄糖更有助于乳酸的產(chǎn)生［13-15］，由圖3可以看出，隨著葡萄糖添加量的增加，pH呈現(xiàn)下降趨勢(shì)，且當(dāng)添加量大于15%時(shí)，發(fā)酵液中pH無(wú)明顯變化，蝦殼的脫鈣率也無(wú)明顯變化。而對(duì)于脫鈣率而言當(dāng)葡萄糖添加量達(dá)到10%～15%，基本達(dá)到最大值，考慮葡萄糖添加量增大產(chǎn)生的生產(chǎn)成本增加，而且發(fā)酵液對(duì)于菌體的滲透壓也隨之增加，這時(shí)菌體的生長(zhǎng)可能會(huì)受到抑制，對(duì)發(fā)酵造成傷害［10］，因此葡萄糖糖添加量確定為10%。發(fā)酵過(guò)程中添加的葡萄糖一部分被當(dāng)作碳源，還有一部分被轉(zhuǎn)化成乳酸，乳酸與蝦殼中的碳酸鈣反應(yīng)，鈣被溶解形成乳酸鈣，因此，在發(fā)酵的開始階段，植物乳桿菌不斷消耗葡萄糖，乳酸不易積累，直到發(fā)酵時(shí)間的增加才產(chǎn)生更多的乳酸，因此，發(fā)酵過(guò)程中葡萄糖的消耗較大［16］。

圖3　葡萄糖添加量對(duì)植物乳桿菌產(chǎn)酸及蝦殼脫鈣率的影響Fig.3　pH trends and DM rate during fermentation with different glucose concentration

2.1.4發(fā)酵溫度對(duì)植物乳桿菌產(chǎn)酸及蝦殼脫鈣率的影響植物乳桿菌的最佳生長(zhǎng)溫度為30～38℃［17］，由圖4可以看出，在30～37℃溫度范圍內(nèi)發(fā)酵液的產(chǎn)酸量較高，pH較低，且37℃時(shí)達(dá)到最大，pH達(dá)到最低，脫鈣率較高。因此，選用37℃為最優(yōu)發(fā)酵溫度。

圖4　發(fā)酵溫度對(duì)植物乳桿菌產(chǎn)酸及蝦殼脫鈣率的影響Fig.4　pH trends and DM rate during fermentation with different temperature

2.1.5接種量對(duì)植物乳桿菌產(chǎn)酸及蝦殼脫鈣率的影響圖5可以看出，隨接種量提高pH降低，但當(dāng)接種量超過(guò)6%以后，pH反而有輕微上升，產(chǎn)生這種現(xiàn)象可能是當(dāng)接種量增大到一定量時(shí)，因?yàn)榫N的快速生長(zhǎng)導(dǎo)致營(yíng)養(yǎng)很快耗盡，發(fā)酵后期代謝產(chǎn)物的產(chǎn)生受到影響，不能累積足夠的酸，因此pH反而上升；同時(shí)，接種量為6%時(shí)，蝦殼脫鈣率也達(dá)到最大值?？紤]實(shí)際操作的成本，所以除首次發(fā)酵時(shí)接種6%用培養(yǎng)基活化的菌種之外，接下來(lái)的發(fā)酵過(guò)程可以用上一次發(fā)酵的發(fā)酵液進(jìn)行接種，這種生產(chǎn)上不僅可行而且更節(jié)約的方法值得推崇。

圖5　接種量對(duì)植物乳桿菌產(chǎn)酸及蝦殼脫鈣率的影響Fig.5　pH trends and DM rate during fermentation with different inoculum quanity

圖6　料液比對(duì)植物乳桿菌產(chǎn)酸及蝦殼脫鈣率的影響Fig.6　pH trends and DM rate during fermentation with different solid-liquid ratio

2.1.6料液比對(duì)植物乳桿菌產(chǎn)酸及蝦殼脫鈣率的影響由圖6可以看出，當(dāng)料液比小于1∶1時(shí)，蝦殼的脫鈣率呈上升趨勢(shì)，在液料比為1∶1時(shí)，蝦殼的脫鈣率達(dá)到最大值，而當(dāng)料液比達(dá)到1∶2以后時(shí)，蝦殼的脫鈣率明顯的急劇下降，發(fā)酵液pH隨料液比的增加而降低；在料液比1∶2時(shí)下降趨勢(shì)趨于平緩，且過(guò)大的料液比對(duì)副產(chǎn)物（乳酸鈣）濃縮等后續(xù)工藝操作不利。綜合考慮，最佳料液比為1∶1。

2.2生物發(fā)酵法與傳統(tǒng)酸堿法制備的甲殼素基本成分比較分析

在上述單因素研究初步確定的較好的發(fā)酵條件即：發(fā)酵周期48h，發(fā)酵溫度37℃，葡萄糖添加量為10%，料液比為1∶1，接種量為6%下發(fā)酵，進(jìn)行發(fā)酵制備甲殼素，并與傳統(tǒng)化學(xué)法制備的甲殼素進(jìn)行比較，結(jié)果見(jiàn)表1，由表1可以看出，在此條件下脫鈣率達(dá)到84.6%，略低于傳統(tǒng)酸堿法。傳統(tǒng)酸堿法與生物發(fā)酵法制備的成品甲殼素含量、水分等指標(biāo)均相近，且甲殼素中的灰分已經(jīng)很少，只有0.3g/100g左右，根據(jù)食品級(jí)甲殼素的要求［18］，簡(jiǎn)單的處理后即可成為商品甲殼素，不需要再經(jīng)酸堿處理，基本無(wú)廢水、廢渣產(chǎn)生，并且以傳統(tǒng)的酸堿法制備甲殼素，強(qiáng)酸和強(qiáng)堿對(duì)甲殼素的分子結(jié)構(gòu)有一定的破壞［19］，而且能耗高，下腳料污染環(huán)境。

表1　傳統(tǒng)酸堿法與生物發(fā)酵法制備的甲殼素基本成分及性質(zhì)Table 1　Compositions and properties of krill waste，residues after chemical treatments and fermentation

3　結(jié)論

比較了葡萄糖、果糖、乳糖、蔗糖及可溶性淀粉等碳源對(duì)植物乳桿菌發(fā)酵南極磷蝦殼的影響，表明以葡萄糖為碳源發(fā)酵效果好，體系pH最低。研究發(fā)現(xiàn)隨著發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng)體系pH逐漸降低，脫鈣率逐漸增高，到48h后趨于平緩，初步確定較好的發(fā)酵時(shí)間為48h。隨著葡萄糖添加量的增大體系pH逐漸降低，而鈣脫除率則先增大，后降低趨勢(shì)，在10%～15%達(dá)到最大，綜合考慮成本問(wèn)題，選擇添加量10%。隨著發(fā)酵溫度、接種量、料液比的增大，體系pH呈先下降后增大趨勢(shì)，而鈣脫除率則呈先增大后降低趨勢(shì)，最適發(fā)酵溫度為37℃左右，最適接種量為6%，最適料液比為1∶1。通過(guò)單因素實(shí)驗(yàn)確定的發(fā)酵條件：發(fā)酵周期48h，發(fā)酵溫度37℃，葡萄糖添加量10%，料液比1∶1，接種量6%下發(fā)酵制備甲殼素，脫鈣率達(dá)到84.6%，與傳統(tǒng)酸堿化學(xué)法制得的甲殼素相比各指標(biāo)相近，表明利用本方法生產(chǎn)甲殼素具有一定的開發(fā)應(yīng)用前景。

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Study on the influencing factors of fermentation of Antarctic krill shells with Lactobacillus plantarum L-45

JIANG Qi-xing1，CHEN Xue-jiao1，XU Zhao-bin2，XU Yan-shun1，LIU Fu-jun2，YU Pei-pei1，XIA Wen-shui1，*
（1.School of Food Science and Technology，Jiangnan University，Wuxi 214122，China；2.Liaoning Province Dalian Ocean Fishery Group，Dalian 116113，China）

In this study Lactobacillus plantarum L-45 was used as start strains to ferment Antarctic krill shells. The effects of carbon source，the fermentation time，the fermentation temperature and other factors on acid production of L-45 the variation and demineralization rate of krill shell were studied.The optimum fermentation conditions were as follows：fermentation time 48h，temperature 37℃，inoculums quantity 6%，glucose added 10%，and the ratio of material to liquid 1∶1.Under these conditions the demineralization rate was 84.6%.The obtained chitin was similar in nature and friendly to environment compared with the traditional chemical method. Key words：Lactobacillus plantarum L-45；krill shell waste；pH；decalcification rate

TS254.9

A

1002-0306（2015）14-0212-04

10.13386/j.issn1002-0306.2015.14.035

2014－09－26

姜啟興（1977-），男，博士，副教授，研究方向：食品加工與保藏。

夏文水（1958-），男，教授，研究方向：食品加工與保藏。

“十二五”國(guó)家“863”計(jì)劃項(xiàng)目（2011AA090801）。