熊果酸對舌鱗癌Tca8113細胞增殖及凋亡的作用研究

李青嶺，吳建勇，趙德璋（重慶醫(yī)科大學生命科學研究院，重慶400016）

舌鱗癌的治療多以手術切除為主，但可導致患者面部畸形和功能障礙，影響患者的生活質量。因此，尋找新型、高效、低毒的化療藥物對舌鱗癌的綜合治療具有重要意義。熊果酸是廣泛存在于天然植物中的一種三萜類化合物，具有抗炎、抗氧化、降血脂等多種藥理學效應。近年來發(fā)現(xiàn)，熊果酸還可抑制多種腫瘤細胞的增殖、遷移并誘導凋亡[1-5]。為探討該成分對舌鱗癌細胞的增殖及凋亡的作用，本研究以舌鱗癌細胞株Tca8113為研究對象，觀察不同濃度熊果酸對Tca8113細胞的增殖、凋亡的作用及其可能機制。

1 材料與方法

1.1 材料 Tca8113細胞由四川大學華西口腔醫(yī)院惠贈。熊果酸（南京替斯艾么中藥研究所，批號：TCM-036，純度98%），用二甲基亞砜（DMSO）配成1 mmol/L的貯存液；RPMI-1640培養(yǎng)基和胎牛血清購自美國Gibco公司；Hoechst333258檢測試劑盒購自南京凱基生物技術公司；AnnexinⅤ-異硫氰酸熒光素（AnnexinⅤ-FITC）檢測試劑盒購自美國BIPEC生物試劑公司；Rhodamine123和caspase 3活性檢測試劑盒購自北京碧云天生物技術公司；iQ SYBR Green supermix購自美國Bio-Rad公司。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養(yǎng)與細胞分組 細胞接種于RPMI-1640培養(yǎng)液（含10%胎牛血清及青霉素、鏈霉素各100 U/mL），置于37℃、5%CO2飽和濕度的孵箱中培養(yǎng)。傳代至細胞狀態(tài)穩(wěn)定后，將細胞按要求分組如下：陰性對照組，熊果酸低、中、高劑量處理組（10、20、40 μmol/L）。將上述細胞培養(yǎng)24 h后，按分組要求加入不同劑量的熊果酸作用24 h后，測定各項試驗指標。

1.2.2 MTT法檢測細胞增殖活性 取對數(shù)生長期細胞，調整細胞濃度為每毫升4×104個，接種于96孔板中，每孔150 μL。培養(yǎng)24 h后按分組要求加入不同劑量的熊果酸，溶劑對照組加等體積的DMSO，每組設5個復孔。培養(yǎng) 24 h 后，每孔加入 MTT 溶液（5 mg/mL）20 μL，繼續(xù)培養(yǎng)4 h。終止培養(yǎng)，小心吸棄孔內培養(yǎng)上清液。每孔加入150 μL DMSO，振蕩，使結晶充分溶解，采用酶標儀測定492nm處各孔吸光度（A）值。存活率=A藥物組/A對照組×100%。

1.2.3 熒光染色法觀察細胞DNA損傷 根據(jù)Hoechst 333258染色試劑盒說明書操作。取對數(shù)生長期細胞接種于24孔培養(yǎng)板，培養(yǎng)24 h后按分組要求給予不同的處理因素，繼續(xù)培養(yǎng)24 h，熒光顯微鏡檢測藍色的細胞核。激發(fā)波長在350 nm左右，發(fā)射波長在460 nm左右。

1.2.4 流式細胞儀檢測細胞凋亡率 將各處理組細胞用胰酶消化，離心收集細胞，PBS洗滌2次后重懸并計數(shù)。取 1×106個細胞離心后，加入 400 μL Binding buffer重懸細胞，并加入10 μL AnnexinⅤ-FITC和5 μL碘化丙啶（PI），輕輕混勻，避光室溫反應20 min后，流式細胞儀檢測細胞凋亡情況。

1.2.5 Real-time PCR法檢測Bcl-2和Bax mRNA的表達 用TRIzol抽提各處理組細胞總RNA，逆轉錄為互補 DNA（cDNA），取適量 cDNA為模板，Real-time PCR法擴增Bcl-2和Bax基因片段。以甘油醛-3-磷酸脫氫酶（GAPDH）作為內參，進行組間差異比較。引物如下：Bcl-2 F：5′-TGTGGCCTTCTTTGAGTTCG-3′；Bcl-2 R：5′-TCACTTGTGGCTCAGATAGG-3′；Bax F：5 ′-GCGTCCACCAAG AAGCTGAG-3′；Bax R：5′-ACCACCCTGGTCTTGGATCC-3′；GAPDH F：5′-GGTGGTCTCCTCTGACTTCAACA-3′；GAPDH R：5′-GTTGCTGTAGCCAAATTCGTTGT-3′。PCR擴增條件：95 ℃ 3 min，1 個循環(huán)；95 ℃ 10 s，55 ℃ 30 s，40個循環(huán)。

1.2.6 細胞線粒體膜電位檢測 收集各處理組細胞，加入5 mg/L的Rhodamine123 50 μL，輕輕彈勻，37℃避光孵育30 min（每隔10 min振搖1次），PBS洗滌細胞，流式細胞儀（EX488 nm，Em534 nm激光）檢測線粒體膜電位的變化。

1.2.7 casepase-3酶活性檢測 不同濃度熊果酸處理細胞24 h后，胰酶消化，離心收集細胞，PBS洗滌1次。根據(jù)試劑盒說明書操作，按照一定比例加入適量的細胞裂解液，冰浴裂解細胞15 min，4℃離心15 min。將裂解上清液轉移至4℃預冷的離心管中，立即采用酶聯(lián)免疫吸附試驗測定caspase-3酶活性，同時用Bradford法測定蛋白濃度。將檢測緩沖液、待測樣品和Ac-DEVD-pNA混勻后，37℃孵育，待顏色明顯變化時立即測定A405。通過與標準曲線對比，檢測各組細胞中caspase-3的酶活性。

1.3 統(tǒng)計學處理 應用SPSS12.0統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)分析，計量資料以±s表示，組間比較采用One-way ANOVA檢驗。Р＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結 果

2.1 熊果酸對細胞生長增殖的影響 通過MTT法觀察不同濃度熊果酸對細胞生長增殖的影響，結果顯示，熊果酸對Tca8113細胞增殖具有明顯的抑制作用，熊果酸各劑量組與對照組比較，差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），而且隨藥物濃度的增加，抑制作用逐漸增強，見表1。

表1 熊果酸對Tca8113細胞增殖的影響（±s，n=5）

表1 熊果酸對Tca8113細胞增殖的影響（±s，n=5）

注：與對照組比較，aP＜0.05，bP＜0.01；-表示未使用熊果酸。

組別對照組熊果酸組劑量（μmol/L）存活率（%）-10 20 40 100.4±3.2 83.3±5.2a 64.7±6.8b 38.5±7.3b

2.2 熊果酸對細胞DNA損傷的影響 熒光顯微鏡下觀察，活細胞的細胞核呈彌散均勻的藍色熒光；凋亡細胞的細胞核或細胞質內可見濃染致密的顆粒塊狀熒光，DNA發(fā)生損傷。與陰性對照組比較，熊果酸各處理組正常細胞的比例逐漸減少，DNA損傷逐漸增強，40 μmol/L處理組損傷最為明顯。研究結果表明，熊果酸可以導致DNA發(fā)生損傷，誘導細胞發(fā)生凋亡。見圖1。

圖1 熊果酸對Tca8113細胞形態(tài)學的影響（200×）

2.3 熊果酸對細胞凋亡率的影響 AnnexinⅤ-FITC和PI雙染各處理組細胞，流式細胞儀檢測得到細胞凋亡百分率。結果顯示，熊果酸各處理組凋亡率分別為（10.23±1.25）%、（18.93±0.92）%、（43.75±3.18）%，與陰性對照組（3.28±0.32）%比較，差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），見圖2。表明熊果酸具有明顯促細胞凋亡作用，且具有一定的劑量依賴性。

圖2 熊果酸對Tca8113細胞凋亡率的影響

2.4 熊果酸對細胞Bcl-2和Bax mRNA表達的影響熊果酸藥物處理24 h后，Real-time PCR檢測Bcl-2和Bax mRNA的表達，結果顯示，與陰性對照組比較，各熊果酸藥物處理組Bcl-2 mRNA表達量下降，中、高劑量藥物處理組Bax mRNA表達量升高，Bcl-2/Bax比值顯著下降，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），見圖 3。表明熊果酸可能通過改變Bcl-2/Bax基因表達，激活線粒體途徑誘導細胞發(fā)生凋亡。

圖3 熊果酸對Tca8113細胞Bcl-2和Bax mRNA表達的影響

2.5 熊果酸對細胞線粒體膜電位（△Ψm）的影響 結果顯示，10 μmol/L熊果酸低濃度處理組△Ψm為（73.73±3.14）%，與陰性對照組（64.31±3.25）%比較，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）；中、高劑量處理組與陰性對照組比較，△Ψm 分別上升為（96.28±6.09）%和（134.88±9.76）%，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。表明熊果酸可能通過線粒體途徑誘導細胞發(fā)生凋亡。

2.6 熊果酸對細胞caspase-3酶活性的影響 結果顯示，熊果酸藥物處理24 h后，低、中、高劑量藥物處理組酶活性分別提高到（0.218±0.009）、（0.388±0.007）和（0.523±0.012），與對照組（0.076±0.005）比較，差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），且酶活性與藥物濃度呈正相關。

3 討 論

從天然植物中提取高效低毒的抗腫瘤藥物是目前臨床藥理學研究的熱點之一。研究表明，熊果酸廣泛存在于木犀科植物女貞葉中，能夠抑制多種細胞系起源的腫瘤細胞的增殖[1-5]，提示其可以作為一種潛在的腫瘤治療藥物。本實驗利用MTT法檢測細胞增殖情況，結果顯示，熊果酸對Tca8113細胞增殖具有明顯的抑制作用。熒光顯微鏡下觀察可見熊果酸藥物處理組細胞呈現(xiàn)皺縮、變圓、脫落、細胞核染色質凝集、核固縮等凋亡細胞形態(tài)特征，結果與AnnexinⅤ-FITC/PI雙染流式細胞儀分析細胞凋亡情況一致，表明熊果酸可以抑制Tca8113細胞增殖并促進其發(fā)生凋亡。

Mao等[6]研究認為，細胞凋亡的發(fā)生是多基因參與的級聯(lián)反應的結果，藥物誘導腫瘤細胞的凋亡受多基因的調控。線粒體和caspase蛋白酶家族是細胞凋亡途徑中的兩個調控點，對細胞線粒體凋亡途徑的激活起著極其重要的作用[7-9]。當外界刺激啟動凋亡時，Bcl-2家族中促凋亡蛋白Bax與線粒體外膜結合，并與抑凋亡蛋白Bcl-2形成異源二聚體，Bcl-2/Bax基因表達蛋白比例失調，引起線粒體膜電位改變，線粒體外膜通透性增加，導致凋亡因子如細胞色素C釋放入細胞質，激活caspase蛋白酶家族啟動凋亡級聯(lián)反應，誘導細胞發(fā)生凋亡[10-14]。本實驗結果顯示，熊果酸作用Tca8113細胞后，可導致細胞Bax mRNA表達明顯增加，Bcl-2 mRNA和Bcl-2/Bax表達比例明顯下降，線粒體膜電位明顯增高，caspase-3酶活性顯著增強。結果表明，熊果酸誘導Tca8113細胞發(fā)生凋亡與其調節(jié)Bcl-2和Bax表達水平以及caspase-3蛋白酶活性有關。

綜上所述，熊果酸對舌鱗癌Tca8113細胞具有明顯抑制增殖及促凋亡作用，其機制可能是通過啟動細胞線粒體應激途徑，降低Bcl-2/Bax表達比例，提高細胞線粒體膜電位，增強caspase-3蛋白酶的活性，從而誘導Tca8113細胞發(fā)生凋亡。這一機制可能為熊果酸治療舌鱗癌的臨床應用帶來有意義的啟示。

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