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    紫薯內(nèi)生真菌代謝產(chǎn)物抑菌、抗氧化活性研究

    2015-11-07 05:14:54楊林石紅霞薛鴻燕周小凱劉曉風
    中國食品工業(yè) 2015年11期
    關(guān)鍵詞:紫薯正丁醇內(nèi)生

    楊林,石紅霞,薛鴻燕,周小凱,劉曉風

    (1.蘭州理工大學 生命科學與工程學院,甘肅 蘭州 730050)

    紫薯內(nèi)生真菌代謝產(chǎn)物抑菌、抗氧化活性研究

    楊林1,石紅霞1,薛鴻燕1,周小凱1,劉曉風1

    (1.蘭州理工大學 生命科學與工程學院,甘肅 蘭州 730050)

    紫薯具有很高的營養(yǎng)價值,且含有豐富的內(nèi)生菌,是抑菌及抗氧化等活性物質(zhì)的重要來源。本研究采用濾紙片法和紫外分光光度法對紫薯塊莖中分離得到的14株內(nèi)生真菌的發(fā)酵產(chǎn)物,進行體外抑菌和抗氧化實驗。實驗結(jié)果表明:紫薯內(nèi)生真菌發(fā)酵產(chǎn)物中乙酸乙酯萃取部位抑菌活性最強,正丁醇部位活性強于菌體甲醇提取部位,其中,菌株ZS107的乙酸乙酯部位對革蘭氏陰性菌具有極顯著的抑菌活性;抗氧化實驗,結(jié)果表明ZS101和ZS102的乙酸乙酯部位Vc當量大于100mg/mL,ZS204的乙酸乙酯部位樣品的DPPH自由基清除能力明顯高于其他樣品,清除羥基自由基能力較弱。紫薯內(nèi)生真菌代謝產(chǎn)物,具有較好的抗菌及一定的抗氧化等活性,具有較高的研究價值。

    紫薯 內(nèi)生真菌 抑菌 抗氧化

    紫薯(Solanum tuberodsum L.),為旋花科甘薯屬草本植物,俗稱紫山芋、黑薯,薯肉為紫色至深紫色,又稱黑薯。具有通便、防癌、抗癌、清除自由基、抗衰老、抗突變、改善肝功能、降血壓、預防動脈硬化等功能,是當前首推的無公害、綠色、有機保健食品[1]。目前對紫薯的研究都集中在對紫薯色素的提取及性質(zhì)研究以及對紫薯花青素的研究,而對紫薯內(nèi)生菌的研究尚未見報道。本研究結(jié)果表明,紫薯中含有較為豐富的內(nèi)生真菌,是抗菌及抗氧化等活性物質(zhì)的重要來源,為進一步從紫薯內(nèi)生菌中分離篩選新藥先導化合物提供了科學依據(jù)。

    1、材料與方法

    1.1 材料

    內(nèi)生真菌 于2014年,從新鮮無病害的紫薯塊莖中分離得到的14株內(nèi)生真菌,菌種保存于蘭州理工大學生命科學實驗中心。

    試劑 DPPH(Aladdin chemistry Co.Ltd,96%,批號46046)、維生素C、水楊酸、無水乙醇、30% 過氧化氫,硫酸亞鐵、鐵氰化鉀、磷酸氫二鈉、磷酸二氫、三氯乙酸、氯化鐵等試劑均為分析純。

    儀器 AB104-N電子天平(Mettle-Toledo);ES-2002H電子天平(長沙湘平);CARY 50 Probe UV-Visible spectrophotometer (VARIAN Australia RTY LTD),RE-52CS型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(上海亞榮),SHB-ⅢA型循環(huán)水式多用真空泵(鄭州長城科工貿(mào)有限公司),DZF-6020型真空干燥箱(上海博迅實業(yè)有限公司)。

    指示菌:G+性菌:金黃色葡萄球菌(Staphyloccocus aureus)、地衣芽孢桿菌(Bacillus licheniformis)、乳鏈球菌(Streptococcus uberi)和G-性菌:大腸桿菌(Escherichia coli)、綠膿桿菌(Pseudomonas aeruginosa)、肺炎克雷伯菌(Klebsiella pneumoniae),菌種引自蘭州理工大學生命科學實驗中心。

    1.2 實驗方法

    1.2.1 代謝產(chǎn)物的發(fā)酵及處理

    內(nèi)生真菌接種于PDA培養(yǎng)基,28℃培養(yǎng)箱內(nèi)活化3天,后接種于含200mL PDB培養(yǎng)基的500mL錐形瓶內(nèi)。置于轉(zhuǎn)速為160r/min的搖床中28℃下培養(yǎng)兩周。發(fā)酵結(jié)束后,將菌體與菌液離心分離。菌液依次用等體積的乙酸乙酯、正丁醇萃取3次,分別合并有機相并回收溶劑,得乙酸乙酯萃取部位和正丁醇萃取部位;菌體50℃烘箱干燥,研缽研磨均勻后,用30倍體積甲醇回流提取3次,每次1h,過濾,濾液回收甲醇,得菌體甲醇提取部位。各于50℃干燥至恒重,備用[2]。

    1.2.2 抑菌活性測定

    抑菌活性測定采用濾紙片法[3]。樣品用DMSO配制成5mg/mL樣液。調(diào)節(jié)菌體濃度至106CFU/mL,取100μL涂布于牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基,并將直徑5mm的無菌濾紙片置于帶菌平板上,輕壓使其與培養(yǎng)基表面接觸,后用微量移液器吸取15μL樣液滴于紙片上,溶劑DMSO為陰性對照,10U的硫酸鏈霉素或25U的青霉素鈉為陽性對照,每個樣品設(shè)3個平行。于37℃培養(yǎng)24h,十字交叉法測定各樣品抑菌圈的大小。并對有較好抑菌效果的樣品使用二倍稀釋法[73]進行最小抑菌濃度的測定,樣品用DMSO稀釋為5mg/mL、2.5mg/mL、1.25mg/mL、0.625mg/mL、0.3125mg/mL、0.15625mg/mL濃度。

    1.2.3 抗氧化活性測定

    總還原力的測定 采用鐵氰化鉀還原法。將樣品用DMSO配成1mg/mL溶液,取樣液2.5mL,依次加入0.2mol/L pH=6.6的磷酸鹽緩沖液2.5mL和l%鐵氰化鉀(K3Fe(CN)6)溶液2.5mL。50℃水浴中保溫20min后快速冷卻。再加10%三氯乙酸溶液2.5mL(如有沉淀離心除去),取上清液2.5mL,依次加入蒸餾水2.5mL和0.1%三氯化鐵溶液0.5mL,振蕩混勻,靜置10min后,在700nm處測定其吸光度值,同時以陽性對照Vc做標準曲線,算出樣品Vc當量[4]。

    DPPH自由基清除活性的測定 采用水楊酸法,將樣品用DMSO配成0.05mg/mL溶液。在同一具塞試管中加入0.025mg/mL的DPPH·乙醇溶液和樣品溶液各2mL,搖勻,室溫避光靜置30min,用無水乙醇作參比溶液,在5l7nm處測量吸光度值A(chǔ)樣品。用2mL無水乙醇代替樣品,測定空白吸光度A空白。用2mL無水乙醇代替DPPH·乙醇溶液,測定吸光度值為A對照[5]。如下公式計算:

    羥基自由基清除活性的測定:將樣品用DMSO配成0.8mg/mL溶液。于10mL比色管中依次加入6mmol/L的硫酸亞鐵水溶液1mL,6mmol/L的水楊酸·乙醇溶液1mL后,加入1mL樣液,再加0.1%的過氧化氫1mL,用蒸餾水定容,搖勻后于37℃水浴30min, 510nm測吸光度值A(chǔ)樣。用1mLDMSO溶液代替樣品,測定空白吸光度A空白。用1mL水溶液代替H2O2,測定吸光度A對照 。按下式計算:

    2、結(jié)果與分析

    2.1 抑菌活性測定結(jié)果

    42個樣品中有17個樣品對6種指示菌均表現(xiàn)出抑制活性,占總測試樣品的40%;其中乙酸乙酯部位對6種指示菌均有抑制作用的有11個,正丁醇部位有4個,菌體甲醇部位有2個;有5個樣品對6種指示菌有較強的抑制作用(抑菌圈直徑10-20mm),分別是ZS102、ZS112、ZS204、ZS301的乙酸乙酯部位和ZS302的正丁醇部位;ZS107和ZS108的乙酸乙酯部位和ZS101、ZS102的正丁醇部位對6種指示菌均有很強的抑制作用(抑菌圈直徑20-45mm),其中對金黃色葡萄球菌抑制作用最強的為ZS107的乙酸乙酯部位,抑菌圈直徑為35mm,對地衣芽孢桿菌和乳鏈球菌抑制作用最強的為ZS108的乙酸乙酯部位,抑菌圈都為27mm,對大腸桿菌、綠膿桿菌、肺炎克雷伯菌抑制作用最強的均為ZS107的乙酸乙酯部位,抑菌圈直徑分別為41mm、42mm、41mm。抑菌試驗數(shù)據(jù)如表1所示:(+++++) <35mm;(++++++)40mm;(+++++++)<45mm③低活性:中<15mm:中等活性1 5mm≤中<20mm:高活性:中≥20 mm

    表1 紫薯內(nèi)生真菌發(fā)酵產(chǎn)物抑菌活性測定結(jié)果

    對抑菌圈直徑大于20mm的樣品進行最小抑菌濃度的測定結(jié)果表明,ZS107的乙酸乙酯部位對肺炎克雷伯菌的抑制效果最強,其最小抑菌濃度為0.15625mg/mL,ZS108的乙酸乙酯部位對地衣芽孢桿菌、綠膿桿菌、肺炎克雷伯菌的最小抑菌濃度均達到0.15625mg/mL,ZS301的乙酸乙酯部位對地衣芽孢桿菌的最小抑菌濃度達到0.15625mg/mL;ZS101的正丁醇部位對金黃色葡萄球菌和綠膿桿菌的最小抑菌濃度達到0.15625mg/mL,ZS102的正丁醇部位只有對肺炎克雷伯菌的最小抑菌濃度達到0.15625mg/mL,而ZS302的正丁醇部位除了對乳鏈球菌和大腸桿菌的最小抑菌濃度為2.5mg/mL為對其余4個指示菌的最小抑菌濃度都達到0.15625mg/mL, 最小抑菌濃度測定結(jié)果如表2:

    表2 紫薯內(nèi)生真菌最小抑菌濃度MIC測定結(jié)果(mg/mL)

    2.2 抗氧化活性測定結(jié)果

    2.2.1 總還原力測定結(jié)果

    42個樣品中表現(xiàn)出有還原總力的有41個,其中還原能力乙酸乙酯部位>正丁醇部位>菌體部位;Vc相當含量超過100的有2個樣品,分別是ZS101和ZS102的乙酸乙酯部位;其中ZS102的乙酸乙酯部位最高,達到129.6μg/mL。如圖1

    所示:

    圖1 紫薯內(nèi)生真菌總還原力測定結(jié)果

    2.2.2 清除DPPH.測定結(jié)果

    42個樣品表現(xiàn)出DPPH自由基清除活性的有26個,占總樣品的61.9%;其中只有ZS204的乙酸乙酯部位的清除率大于50%(84.57%);其他樣品對DPPH自由基的清除作用均較弱。Vc的清除率為96%。測定結(jié)果如圖2所示:

    圖2 紫薯內(nèi)生真菌對DPPH·自由基清除作用測定結(jié)果

    2.2.3 清除羥基自由基測定結(jié)果

    40個樣品有一定的清除作用,清除率均小于50%,整體清除效果較差。對羥基自由基的清除作用最強的是ZS107的乙酸乙酯部位(40.23%)。整體來看,乙酸乙酯部位樣品清除率高于正丁醇和菌體部位。如圖3所示:

    圖3 紫薯內(nèi)生真菌對羥基自由基的清除作用

    3、結(jié)果及討論

    抑菌實驗結(jié)果表明,大多數(shù)內(nèi)生菌發(fā)酵產(chǎn)物對指示菌具有一定的抑菌活性,乙酸乙酯部位抑菌活性強于正丁醇部位,正丁醇部位強于菌體甲醇部位。其中,ZS107的乙酸乙酯部位對3種革蘭氏陰性菌的抑菌效果極明顯,抑菌圈均大于40mm,超過Vc的抑菌圈,有必要對該菌進行進一步研究,有望從中發(fā)現(xiàn)抑菌活性較好的化合物。

    抗氧化結(jié)果表明,總還原能力測試中Vc相當含量高的樣品較少,DPPH自由基清除實驗中ZS204的乙酸乙酯部位的清除率較高。對羥基自由基的清除作用不太明顯,說明紫薯內(nèi)生真菌發(fā)酵產(chǎn)物的抗氧化活性較弱。

    本研究為后續(xù)紫薯研究和利用作了一定的鋪墊,也為從紫薯內(nèi)生真菌代謝產(chǎn)物中分離得到抗氧化,抑菌作用的化合物提供依據(jù)。

    [1]楊巍,黃潔瓊,陳英,王和才,朱慶珍,徐家榮.紫薯的營養(yǎng)價值與產(chǎn)品開發(fā).農(nóng)產(chǎn)品加工學刊[J],2011,253(8):41-42

    [2]Verraest, Peter, et al.Modiication of inulin with amidoxime groups and coordination with copper ions [J].Carbohydrate Polymers,1998,37:209-214

    [3]張佳,王瑩,張峰.濾紙片法測定黃花蒿提取物對霉菌的抑制活性[J].湖北農(nóng)業(yè)科學,2009, 48(5):1153-1154

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