六味地黃丸方對IgA腎病大鼠的治療作用*

彭亞軍　李旭華　何澤云△　廖春來　何雅琴　胡淑娟

（1.湖南中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院，湖南長沙410007；2.湖南中醫(yī)藥大學，湖南長沙410208）

·研究報告·

六味地黃丸方對IgA腎病大鼠的治療作用*

彭亞軍1李旭華1何澤云1△廖春來1何雅琴1胡淑娟2

（1.湖南中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院，湖南長沙410007；2.湖南中醫(yī)藥大學，湖南長沙410208）

目的觀察六味地黃丸方對IgA腎病大鼠的治療作用。方法SD大鼠40只隨機分為正常對照組、模型組、雷公藤多苷片組、六味地黃丸方組，各10只。除正常組外均采用運用牛血清白蛋白+脂多糖+四氯化碳方法建立實驗性IgAN模型。造模成功后連續(xù)灌胃4周，正常對照組及模型組均采用蒸餾水灌胃；雷公藤多苷片組以6 mg/（kg·d）溶于等體積0.9%氯化鈉溶液灌胃；六味地黃湯組以大鼠及人體質(zhì)量與相應體表面積比值計算給藥量。分別在每周末檢測尿蛋白定量及尿紅細胞計數(shù)，第4周末處死各組大鼠，進行肝腎功能檢測，IgA免疫熒光檢測，腎臟組織石蠟切片進行HE、PAS染色，光鏡及電鏡下觀察病理改變及半定量評估。結(jié)果六味地黃丸方組IgA腎病大鼠食欲、精神及毛發(fā)情況均較模型組相對較好，但仍較正常對照組差，從六味地黃丸方組尿蛋白及紅細胞計數(shù)與模型組比較，均較模型組降低（P＜0.05），六味地黃丸方組較模型組血肌酐及尿素下降（P＞0.05）、血漿白蛋白上升（P＜0.05）；雷公藤多苷片組及六味地黃丸方組腎小球系膜細胞增生和系膜基質(zhì)增多情況較模型組減輕（P＜0.05）；電鏡下觀察各治療組系膜增生、系膜基質(zhì)增多及足突融合較模型組輕；六味地黃湯組大鼠免疫熒光IgA沉積較模型組弱，但較雷公藤多苷片組強（P＜0.05）。結(jié)論六味地黃丸方可在一定程度上減少IgA腎病大鼠尿蛋白及尿紅細胞數(shù)，改善其腎功能及升高血漿白蛋白，病理上可減輕IgA在腎臟的沉積和改善腎臟病理病變程度。

六味地黃湯IgA腎病大鼠尿蛋白尿紅細胞腎臟病理

IgA腎病臨床表現(xiàn)多種多樣，主要表現(xiàn)為血尿，可伴不同程度的蛋白尿、高血壓和腎臟功能受損，是導致終末期腎臟病的常見的原發(fā)性腎小球疾病之一［1］，由于IgA腎病病因不清，發(fā)病機制不明，臨床及病理表現(xiàn)的多樣化及預后的異質(zhì)性，所以目前尚缺乏統(tǒng)一的治療方案，六味地黃丸出自于宋代錢乙《小兒藥證直訣》，又名六味丸、地黃丸。筆者前期研究表明［2-4］，六味地黃丸方對5/6腎切除大鼠、UUO模型大鼠等就有防治腎臟間質(zhì)纖維化的作用，為此，本次實驗復制IgA腎病大鼠，探討六味地黃丸方對IgA腎病大鼠的治療作用，為其臨床運用提供理論依據(jù)?，F(xiàn)報告如下。

1　材料與方法

1.1實驗動物清潔級雄性SD正常大鼠40只，體質(zhì)量（150±20）g，購于湖南斯萊克景達實驗動物有限公司，動物合格編號：SCXK（湘）2011-0003。

1.2藥物與試劑六味地黃丸方（熟地黃24 g，山茱萸肉12 g，山藥12 g，澤瀉9 g，茯苓9 g，牡丹皮9 g），均購自湖南中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院藥劑科，每劑藥經(jīng)水煎、過濾、濃縮至1 g/mL，置4℃冰箱保存。雷公藤多苷片，生產(chǎn)廠家為江蘇美通制藥有限公司，批號為Z32021007。牛血清白蛋白（BSA）（美國MBCHEM公司），四氯化碳（CCl4）、脂多糖（LPS）（Sigma）、谷丙轉(zhuǎn)氨酶、谷草轉(zhuǎn)氨酶、白蛋白、總蛋白、肌酐及尿素氮試劑盒均由南京建成生物技術(shù)有限公司提供。

1.3分組與造模按隨機數(shù)字表法分為正常對照組（10只）、模型組（10只）、六味地黃湯組（10只）、雷公藤多苷片組（10只），除正常對照組外，其他組根據(jù)文獻［5］，運用BSA+LPS+CCl4方法建立實驗性IgAN模型。具體方案如下：口服免疫原BSA 400 mg/kg隔天灌胃，持續(xù)6周；CCl4注射方式由為皮下注射，用誘導肝纖維化劑量的1/3（皮下注射蓖麻油0.5 mL+CCl40.10 mL，每周1次，持續(xù)9周），并聯(lián)合運用LPS（分別于第6、8周以LPS 0.05 mg尾靜脈注射）。造模成功后連續(xù)灌胃4周，六味地黃丸方組4 mL（按60 kg的人服藥劑量為標準進行換算），模型組及正常對照組用（等體積蒸餾水灌胃），雷公藤多苷片組［6 mg/（kg·d）溶于等體積0.9%氯化鈉溶液灌胃］，各組每日灌胃1次。

1.4觀察指標1）一般情況測定。包括大鼠行為和體態(tài)變化，記錄大鼠外觀、飲食、飲水活動、對刺激的反應、皮毛光澤、脫毛等情況。每周用電子天平稱取各組大鼠體質(zhì)量情況。各時間點用代謝籠收集尿液，用量筒測定尿量。統(tǒng)計各組大鼠死亡情況。2）全自動生化分析儀檢測生化指標。參照相應測定試劑盒，采用美國雷杜（Rayto）半自動生化儀檢測，尿蛋白（CBB法）、肌酐（苦味酸法）、尿素（酶偶聯(lián)速率法）、ALT（速率法）、AST（速率法）、白蛋白（溴甲酚綠法）。3）尿紅細胞細胞檢測。收集尿液5 mL先以1500 rpm離心5 min，傾取上清液，用管底的沉渣以Diasys（R/S 2003UF）尿沉渣分析儀進行分析。4）腎組織病理評分［6］。對分別以HE、PAS染色的病理片進行綜合評定。腎小球病變：觀察至少10個腎小球，計量每個腎小球病變范圍，取其平均值定為腎小球病變范圍。腎小球病變累計得分0～18分。0～6分為輕度損害，7～11分為中度損害，12～18分為重度損害。5）電鏡下觀察腎臟組織。取左腎皮髓質(zhì)交界處約3 mm×3 mm×3 mm大小方塊；2.5%戊二醛，浸泡24 h以上；后固定應用2%鋨酸固定2 h；梯度脫水，50%、70%、90%、100%的丙酮脫水，每級10 min×3次；浸泡環(huán)氧樹脂混合液∶純丙酮=1∶1，37℃，浸泡24 h；Epon812（Epoxiaquivalentgewicht145-160）、DDSA（Dodecencylsuccinic Anhydride）、MNA（Methyl Nadic Anhydride）、DMP30（dimethylaminomethyt phenol），60℃，24 h包埋成塊；半薄切片，甲苯氨藍染色觀察，選取所需要的部位；應用LKB-Ⅲ型超薄切片機切片，厚約500埃；醋酸鈾、硝酸鉛雙重染色；H-7500透射電鏡以不同倍數(shù)觀察切片，并拍照。6）免疫組織化學法檢測腎組織IgA的表達的表達。熒光半定量標準：參照文獻［7］國內(nèi)外通用的五級法（－～4+）分級。

1.5統(tǒng)計學處理采用SPSS20.0統(tǒng)計軟件分析。計量資料以（±s）表示，多組比較采用單因素方差分析，滿足正態(tài)性、方差齊性多組比較采用LSD法，兩組比較采用獨立樣本t檢驗，不滿足正態(tài)性、方差齊性多組比較采用Tamhane′s t2檢驗，兩組比較采用Mann-Whitney U檢驗，等級資料比較采用Kruskal-wallis H檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2　結(jié)果

2.1一般情況在藥物干預期間，正常組食欲、毛色、活動均未見明顯變化，無大鼠死亡；雷公藤多苷片組、六味地黃丸方組及模型組少數(shù)大鼠不同程度精神萎靡倦怠，毛色蓬松雜亂，活動度下降，模型組死亡1只，死亡原因不明。

2.2各組大鼠給藥后24 h尿蛋白定量比較見表1。六味地黃丸方組第1周尿蛋白定量與模型組及雷公藤多苷片組相當（P＞0.05）；與正常對照組比較，尿蛋白定量顯著高于正常對照組（P＜0.05）；第2、3、4周與模型組相比較，尿蛋白定量顯著低于模型組（P＜0.05）；第2、3、4周與雷公藤多苷片組相比，尿蛋白定量均高于雷公藤多苷片組（P＜0.05）；六味地黃湯組第4周與第1周前后比較，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。

表1　各組大鼠給藥后24 h尿蛋白定量比較（mg/24 h，）

表1　各組大鼠給藥后24 h尿蛋白定量比較（mg/24 h，）

與模型組及雷公藤多苷片組比較，*P＞0.05；與模型組及雷公藤多苷片組比較，#P＜0.05；與六味地黃湯組第1周尿蛋白定量相比較，△P＜0.05。下同

組別n 第1周第4周第2周第3周正常對照組10模型組10雷公藤多苷片組10 2.01±0.411.97±0.20 16.62±1.6521.56±1.66 14.01±0.919.27±0.85 1.83±0.381.91±0.26 18.48±1.15 19.54±1.42 11.96±1.32 10.65±0.54六味地黃丸方組1015.26±0.88*12.57±1.29#△13.56±1.19#12.92±1.32#

2.3各組大鼠給藥后尿紅細胞計數(shù)比較見表2。六味地黃丸方組第1周尿紅細胞計數(shù)與模型組及雷公藤多苷片組相當（P＞0.05）；與正常對照組比較，尿紅細胞計數(shù)顯著高于正常對照組（P＜0.05）；第2、3、4周與模型組相比較，尿紅細胞低于模型組（P＜0.05）；第2、3、4周與雷公藤多苷片組相比，尿紅細胞計數(shù)均高于雷公藤多苷片組（P＜0.05）；六味地黃丸方組第4周與第1周前后比較，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。

表2　各組大鼠尿紅細胞計數(shù)比較（個/μL，）

表2　各組大鼠尿紅細胞計數(shù)比較（個/μL，）

組別n 第1周第4周第2周第3周正常對照組10模型組10雷公藤多苷片組10 8.10±1.6610.5±2.75 320.44±15.48344.11±21.16 308.10±17.81187.70±16.50 8.70±2.219.60±1.89 335.00±21.61 334.00±32.98 289.90±15.75 263.70±22.93六味地黃丸方組10316.90±15.94*238.10±15.58#△305.40±15.14#281.40±18.38#

表3　各組大鼠給藥后生化指標比較（）

表3　各組大鼠給藥后生化指標比較（）

與正常對照組、模型組、雷公藤多苷片組比較，*P＞0.05；與模型組比較，#P＜0.05；與模型組比較，△P＜0.05。

組別n AST（U/L）ALT（U/L）ALB（g/L）BUN（mmol/L）Cr（μmol/L）正常對照組10模型組10雷公藤多苷片組10 105.72±8.7555.49±9.2635.20±2.82 113.65±13.39 56.73±11.6722.34±2.21 107.96±14.92 58.16±9.3429.65±1.42 3.92±0.6732.35±5.13 8.03±0.8672.50±4.73 7.05±0.78△66.20±3.50△六味地黃丸方組10106.99±15.81*61.70±10.34*26.14±1.74#7.42±0.50△69.64±2.31△

2.4各組大鼠給藥后生化指標比較見表3。六味地黃湯組第4周末AST、ALT較其他3組無顯著差異，無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），六味地黃丸方組ALB含量較模型組升高（P＜0.05），與雷公藤多苷片組比較含量下降（P＜0.05）；六味地黃丸方組及雷公藤多苷片組BUN、 Cr含量較模型組下降，但差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。

2.5各組大鼠腎組織光鏡下病理改變情況見圖1。光鏡下觀察正常對照組大鼠腎小球形態(tài)大致正常，系膜區(qū)基質(zhì)及細胞未見明顯增加，毛細血管袢開放良好，腎小管及間質(zhì)均未無明顯變化。模型組大鼠腎組織光鏡下主要表現(xiàn)為部分腎小球肥大，系膜細胞輕到中度增生，系膜基質(zhì)輕到中度增寬，部分毛細血管袢呈節(jié)段性阻塞，部分Bowman囊壁呈節(jié)段性粘連。部分腎小管內(nèi)可見紅細胞管型；部分腎小管擴張伴小管上皮細胞刷狀緣消失，空泡變性。雷公藤多苷片組及六味地黃丸方組腎小球系膜細胞增生和系膜基質(zhì)增多情況較模型組明顯減輕。

圖1　各組大鼠腎組織光鏡下病理改變情況（×400）

2.6各組大鼠腎臟評分比較對各組腎臟病理評分，正常組為（1.00±0.66）分。六味地黃丸方組及雷公藤多苷片組腎小球病理積分分別為（5.50±1.26）分、（3.70± 0.94）分，均低于模型組的（7.00±1.73）（P＜0.05）；六味地黃丸方組腎小球病理積分高于雷公藤多苷片組（P＜0.05）。

2.7各組大鼠腎組織電鏡下病理改變比較見圖2。電鏡下觀察正常對照組無系膜基質(zhì)及細胞增生及電子致密物沉積，足突細胞形態(tài)正常，排列整齊有序。模型組可見腎小球系膜細胞增生，系膜基質(zhì)明顯增寬，有電子致密物沉積及部分足突融合；各治療組系膜細胞增生、系膜基質(zhì)增多及足突融合相對較少。

圖2　各組大鼠腎組織電鏡下病理改變情況（×400）

2.8各組大鼠免疫熒光IgA沉積比較見表4和圖3。正常對照組在大鼠腎組織均未見明顯的IgA沉積，熒光強度為陰性；模型組各大鼠腎臟組織均表現(xiàn)IgA沉積陽性（+～++++）；雷公藤多苷片組大鼠腎臟組織較模型組IgA沉積弱（+～+++）；六味地黃丸方組大鼠腎臟組織較模型組IgA沉積稍弱（+～+++）。

表4　各組大鼠IgA沉積情況比較（）

表4　各組大鼠IgA沉積情況比較（）

組別n －＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋正常對照組10模型組10雷公藤多苷片組10 000 022 054 00 32 10六味地黃湯組1003520

3　討論

隨著我國各大醫(yī)院腎臟活檢開展，在主要腎小球腎炎被確定在61.7%～68.6%的腎活檢樣本中。IgA腎病構(gòu)成約45.3%～54.3%；其他原因系膜增生性腎小球腎炎構(gòu)成為11.1%～25.6%，膜性腎病9.9%～15.0%，微小病變性腎病10.9%，和局灶節(jié)段7.75%［8-9］。目前認為其中IgA腎病是導致終末期腎病（ESRD）的主要原因之一［10］。IgA腎病臨床及病理表現(xiàn)的多樣性，其治療及預后相差懸殊，目前IgA腎病尚無特效的藥物治療方法，也沒有公認的治療指南，治療的主要目標是減少尿蛋白、減輕腎臟損害及延緩腎衰竭的進展。目前公認的原則是IgA腎病的治療方案要依據(jù)臨床及病理表現(xiàn)，根據(jù)已有的循證醫(yī)學證據(jù)，采用不同的方法。西醫(yī)的治療以預防及治療感染、控制血壓、糖皮質(zhì)激素及免疫抑制劑的使用等［11］，中醫(yī)藥在治療IgA腎病上有一定的優(yōu)勢，在病理及癥狀較輕階段，可以控制病情發(fā)展；在使用激素及其他免疫抑制劑時，能夠發(fā)揮減毒增效的作用；中晚期慢性腎衰竭階段，改善生活質(zhì)量，延長患者生命等方面發(fā)揮中醫(yī)藥的優(yōu)勢，為臨床治療IgA腎病提供有益的思路［12］。

圖3　各組大鼠免疫熒光IgA沉積情況（×400）

《小兒藥證直決箋正》云“仲陽意中，謂小兒陽氣甚，因去桂、附而創(chuàng)立此丸，以為幼科補腎專藥”。該方適用于腰膝酸軟、頭暈目眩、耳鳴耳聾、盜汗、遺精、消渴、骨蒸潮熱、舌燥咽干、小便淋漓，以及小兒囟門不合、舌紅少苔、脈沉細數(shù)等癥。方用熟地黃滋陰補腎，填精益髓為君藥。李中梓曰“六味丸以之為首，天一所生之本也”。輔以山茱萸肉滋養(yǎng)肝腎而固腎氣；山藥健脾益胃以助運化；共為臣藥。三藥相伍，滋養(yǎng)肝腎脾，為“三補”，重用熟地黃以補腎陰為主，是以補其不足而固其本之故。澤瀉淡泄腎濁；茯苓滲利脾濕，而二藥合用引濁邪下行，起“推陳致新”之用；牡丹皮涼泄肝火，以利山萸之養(yǎng)肝?？v觀全方，補泄結(jié)合，開合相濟，以補為主，以泄為次，共奏滋陰補腎之劑。費伯雄在《醫(yī)方論》有云“藥止六味，而有開有合，三陰并治，洵補方之正鵠也”。

國內(nèi)許多臨床及實驗研究表明，六味地黃丸是慢性腎臟病防治有效方劑之一，筆者也做了一系列關(guān)于六味地黃丸方防治慢性腎臟的研究，本次探討六味地黃丸方對IgA腎病的治療作用。結(jié)果提示六味地黃湯組尿蛋白定量及紅細胞計數(shù)與模型組比較，均較模型組降低，但較雷公藤多苷片組高，這也提示六味地黃丸綜上所述，六味地黃湯可在一定程度上減少尿蛋白及尿紅細胞，改善腎功能及升高血漿白蛋白，病理上可改善IgA腎病腎臟病理變化及減少IgA在腎臟的沉積。其具體機制將需要進一步

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Therapeutic Effect of Liuwei Dihuang Decoction on IgA Nephropathy Rats

PENG Yajun，LI Xuhua，HE Zeyun，et al.
The First Affiliated Hospital Of Hunan University of TCM，Hunan，Changsha 410007，China

Objective：To examine the therapeutic effect of Liuwei Dihuang Decoction on IgA Nephropathy Rats. Methods：Forty SD rats were equally randomized into 4 groups：the conrol group，the model group，tripterygium glycosides group，Liuwei Dihuang decoction group.Except the control group，IgAN rat model was established with bovine serum albumin（BSA），lipopolysaccharide（LPS）and carbon tetrachloride（CCl4）.After 4 weeks of continuous perfusion，the control group and the model group were perfused with distilled water，Tripterygium glycosides tablet group with 6mg/kg/d soluble in equal volume of saline，Liuwei Dihuang Decoction group by rats and human body weight and body surface area ratio of the corresponding calculation of dosage.Respectively in the weekly proteinuria and urinary red blood cell count were detected，and at the 4th weekend，all the rats were sacrificed for liver and kidney function test.IgA was detected by immunofluorescence，and paraffin sections of renal tissue were HE，Masson and PAS staining，observed under light microscope and semi quantitativeassessment of pathological change.Rerults：In Liuwei Dihuang Decoction group，diet，mental and hair of IgA nephropathy rat were better than those of the model group，and worse than those of the control group.The urine protein and red blood cell count of Liuwei Dihuang Decoction group were lower than those of the model group（P＜0.05），but more than those of Tripterygium Glycosides tablet group（P＜0.05）；serum creatinine and urea of Liuwei Dihuang Decoction group decreased more than those of the model group（P＞0.05）and the plasma albumin increased（P＜0.05）. Mesangial cell proliferation and mesangial matrix increase situation of Tripterygium glycosides tablet group and Liuwei Dihuang Decoction was slighter than those of the model group（P＜0.05）.Under electronic microscope，mesangial proliferation and mesangial matrix increased and foot process fusion was lighter than those of the model group.IgA immunofluorescence deposition of Liuwei Dihuang Decoction group was weaker than that of the modelgroup，but better than that of tripterygium glycosides tablet group，with significant difference（P＜0.05）.Conclusion：Liuwei Dihuang Decoction can reduce the urine protein and urine red blood cell count of IgA nephropathy rat to a certain extent，improve the renal function and increasing albumin，relieve IgA deposition in kidney and improve the degree of renal pathological changes.

Liuwei Dihuang Decoction；IgA nephropathy rats；Urine protein；Urine red blood cells；Renal pathology

R285.5

A

1004-745X（2015）12-2093-05

10.3969/j.issn.1004-745X.2015.12.008

2015-08-21）

湖南省科技廳項目基金（No.2013SK3099）

（電子郵箱：pengyajun927@163.com）