姜黃素對(duì)人表皮黑素細(xì)胞活性、遷移及c-kit mRNA表達(dá)量的影響

李其林 陸小娟 牛牧

姜黃素對(duì)人表皮黑素細(xì)胞活性、遷移及c-kit mRNA表達(dá)量的影響

李其林 陸小娟 牛牧

目的 探討姜黃素對(duì)人表皮黑素細(xì)胞活性、黑素細(xì)胞遷移及c-kit mRNA相對(duì)表達(dá)量的影響。方法 不同濃度（5、10、20、30 μmol/L）姜黃素對(duì)人表皮黑素細(xì)胞活性影響實(shí)驗(yàn)，分為陰性對(duì)照組（添加MelM-2完全培養(yǎng)基＋細(xì)胞）、藥物對(duì)照組（MelM-2完全培養(yǎng)基＋姜黃素）、空白對(duì)照組（僅添加MelM-2完全培養(yǎng)基）及實(shí)驗(yàn)組（MelM-2完全培養(yǎng)基＋姜黃素＋細(xì)胞），用MTS法分別檢測(cè)培養(yǎng)24 h、48 h后細(xì)胞活性。劃痕實(shí)驗(yàn)檢測(cè)黑素細(xì)胞遷移的情況，實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)黑素細(xì)胞c-kit mRNA相對(duì)表達(dá)量。實(shí)驗(yàn)分為對(duì)照組（僅添加MelM-2完全培養(yǎng)基＋細(xì)胞）及3個(gè)濃度（5、10、20 μmol/L）實(shí)驗(yàn)組。結(jié)果 不同濃度（5、10、20、30 μmol/L）姜黃素培養(yǎng)基培養(yǎng)黑素細(xì)胞24 h、48 h時(shí)，與對(duì)照組相比，30 μmol/L組均可明顯抑制黑素細(xì)胞的增殖（P＜0.05），其他濃度差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＞0.05）。劃痕實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，在培養(yǎng)48 h時(shí)，5、10、20 μmol/L姜黃素均能顯著抑制黑素細(xì)胞遷移（均P＜0.05）。實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，經(jīng)各濃度（5、10、20 μmol/L）姜黃素作用48 h后，均可明顯抑制黑素細(xì)胞c-kit mRNA相對(duì)表達(dá)量（均P＜0.05）。結(jié)論 低濃度的姜黃素（≤20 μmol/L）對(duì)黑素細(xì)胞無(wú)明顯細(xì)胞毒性，30 μmol/L的姜黃素能夠促進(jìn)黑素細(xì)胞的凋亡。姜黃素（≤20 μmol/L）可抑制黑素細(xì)胞的遷移，并下調(diào)人表皮黑素細(xì)胞c-kit mRNA的相對(duì)表達(dá)量。

黑素細(xì)胞；姜黃素；細(xì)胞運(yùn)動(dòng)；原癌基因蛋白質(zhì)c-kit；基因表達(dá)

黃褐斑是常見(jiàn)的色素增多性皮膚病，發(fā)病與色素代謝障礙［1］、氧化與抗氧化損傷系統(tǒng)失衡［2］、激素（孕激素、雌激素）、精神因素、遺傳等因素有關(guān)［3］。臨床上黃褐斑治療方法較多，但療效欠佳。姜黃素是從姜黃屬植物根莖中提取出的一種植物多酚，研究發(fā)現(xiàn)其具有抗氧化、抗病毒、抗炎、抗動(dòng)脈粥樣硬化、抑制酪氨酸酶活性及抑制腫瘤生長(zhǎng)等多種藥理作用［4-5］。為了進(jìn)一步研究姜黃素對(duì)黃褐斑等色素沉著性疾病的作用，我們用姜黃素處理體外培養(yǎng)人表皮黑素細(xì)胞，探討對(duì)人表皮黑素細(xì)胞活性、遷移及與遷移密切相關(guān)的c-kit mRNA相對(duì)表達(dá)量的影響，為姜黃素對(duì)人表皮黑素細(xì)胞的調(diào)節(jié)作用提供更多實(shí)驗(yàn)依據(jù)，也為臨床治療黃褐斑等色素沉著性疾病拓展新的方向。

資料與方法

一、資料

1.細(xì)胞來(lái)源：正常人表皮黑素細(xì)胞來(lái)自廣州市紅十字會(huì)醫(yī)院泌尿科手術(shù)室提供的青少年男性包皮環(huán)切術(shù)的包皮組織。本研究經(jīng)過(guò)醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，患者均簽署知情同意書(shū)。

2.主要試劑：姜黃素為美國(guó)Sigma公司產(chǎn)品，以二甲基亞砜（DMSO）溶解配制成10 mmol/L的母液，置于-20℃冰箱避光保存，保質(zhì)期半個(gè)月，藥品臨用前加新鮮MelM-2完全培養(yǎng)基（美國(guó)Sciencell公司）調(diào)配至實(shí)驗(yàn)所需濃度。人黑素細(xì)胞生長(zhǎng)添加劑MelGS-2（美國(guó)Sciencell公司），鼠抗人HMB-45單克隆抗體（美國(guó)Abcam公司），RNase（上海瑞齊生物科技有限公司），熒光定量PCR試劑（日本Takara公司）。

二、方法

1.黑素細(xì)胞的分離培養(yǎng)：收集包皮組織，70%乙醇消毒后沖洗，剔除真皮及皮下脂肪組織，將組織剪成1 mm×2 mm長(zhǎng)方形，加入0.25%DispaseⅡ分離酶，消化16～18 h后，分離表皮、真皮。加入胰蛋白酶室溫下消化后制成黑素細(xì)胞懸液。過(guò)濾，離心，接種至25 cm2無(wú)菌培養(yǎng)瓶中。

2.多巴染色法鑒定黑素細(xì)胞：將細(xì)胞接種于蓋玻片，貼壁后，加入預(yù)熱至37℃的4%甲醛固定。將蓋玻片浸潤(rùn)于左旋多巴（L-Dopa）染色液中，置于37℃下孵育40 min，隨后更換新染液。約3 h后，染液呈棕色或黑色，停止染色。漂洗，蘇木素復(fù)染細(xì)胞核，脫色，梯度酒精法逐級(jí)脫水，二甲苯透明，最后中性樹(shù)膠封片。

HMB-45免疫化學(xué)染色法鑒定黑素細(xì)胞：爬片固定后，加入過(guò)氧化物酶溶液，孵育后沖洗，再加入0.1%Triton X100/PBS，室溫下放置30 min。每張細(xì)胞爬片滴入1滴正常非免疫動(dòng)物血清，置于孵箱中30 min，用槍頭吸取血清后，加入一抗置4℃冰箱過(guò)夜。次日，將細(xì)胞爬片溫箱中30min，沖洗后每張細(xì)胞爬片加入1滴生物素標(biāo)記二抗，置于孵箱中30 min，PBS緩沖液清洗。每張細(xì)胞爬片滴入1滴鏈霉素抗生物素過(guò)氧化物酶溶液后，置于37℃溫箱中孵育30 min，PBS緩沖液沖洗后，加入DAB顯色，觀察到棕黃或棕褐顆粒為陽(yáng)性，終止顯色。蘇木素復(fù)染細(xì)胞核，脫色，梯度酒精法逐級(jí)脫水，二甲苯透明，最后中性樹(shù)膠封片。

3.姜黃素對(duì)人表皮黑素細(xì)胞活性的測(cè)定（MTS法）：設(shè)立陰性對(duì)照組（添加MelM-2完全培養(yǎng)基＋細(xì)胞）、藥物對(duì)照組（MelM-2完全培養(yǎng)基＋姜黃素）、空白對(duì)照組（僅添加MelM-2完全培養(yǎng)基）及實(shí)驗(yàn)組（MelM-2完全培養(yǎng)基＋姜黃素＋細(xì)胞），實(shí)驗(yàn)組設(shè)4個(gè)復(fù)孔。根據(jù)預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，設(shè)定姜黃素的實(shí)驗(yàn)濃度。將黑素細(xì)胞接種于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，細(xì)胞貼壁后棄上清液，分別加入新鮮配制的濃度分別為5、10、20、30 μmol/L的姜黃素完全培養(yǎng)基100 μl；陰性對(duì)照組更換MelM-2完全培養(yǎng)基100 μl；藥物對(duì)照組分別添加上述濃度姜黃素培養(yǎng)基100 μl；空白對(duì)照組僅添加MelM-2完全培養(yǎng)基100 μl。培養(yǎng)24、48 h后分別加入冷藏的MTS顯色液，每孔20 μl，4 h后終止培養(yǎng)。將96孔細(xì)胞培養(yǎng)板置于酶標(biāo)儀490 nm波長(zhǎng)處行各孔光吸收值（A）的檢測(cè)。用增殖比例表示細(xì)胞增殖情況，即各實(shí)驗(yàn)組的細(xì)胞增殖比例=（A實(shí)驗(yàn)組-A藥物對(duì)照組）/（A陰性對(duì)照組-A空白對(duì)照組）× 100%。本實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，取均值。

4.姜黃素對(duì)人表皮黑素細(xì)胞遷移能力的測(cè)定（劃痕實(shí)驗(yàn)）：設(shè)立對(duì)照組（僅添加MelM-2完全培養(yǎng)基）及3組實(shí)驗(yàn)組（設(shè)定姜黃素的實(shí)驗(yàn)濃度為5、10、20 μmol/L）。先用絲裂霉素提前16 h作用于黑素細(xì)胞，再將黑素細(xì)胞接種于6孔培養(yǎng)板內(nèi)。在黑素細(xì)胞完全融合的6孔板細(xì)胞內(nèi)，采用無(wú)菌的1 ml槍頭在每孔中劃出等寬的直線劃痕，然后用PBS緩沖液輕輕洗去脫落細(xì)胞的碎片，分別加入含有各試驗(yàn)濃度的姜黃素完全培養(yǎng)基（不含F(xiàn)BS和MelGS-2），置于培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)。48 h后拍照并使用圖像分析軟件IPP 6.1分析。倒置顯微鏡下觀察、照相、計(jì)數(shù)、計(jì)數(shù)劃痕部位各組遷移細(xì)胞數(shù)量，本實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，取均值。

5.熒光定量PCR檢測(cè)姜黃素對(duì)c-kit mRNA相對(duì)表達(dá)量的影響（SYBR Green法）：設(shè)立對(duì)照組（僅添加MelM-2完全培養(yǎng)基）及3組實(shí)驗(yàn)組（設(shè)定姜黃素的實(shí)驗(yàn)濃度為5、10、20 μmol/L），每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔。將黑素細(xì)胞接種于6孔細(xì)胞培養(yǎng)板，置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，待細(xì)胞貼壁后棄上清液，分別加入上述新配制的姜黃素完全培養(yǎng)液繼續(xù)孵育。對(duì)照組更換MelM-2完全培養(yǎng)基。各實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組均于48 h后終止培養(yǎng)并檢測(cè)各項(xiàng)指標(biāo)。

6.引物探針設(shè)計(jì)合成：在基因庫(kù)上查找目的基因mRNA序列，在CDS區(qū)設(shè)計(jì)特異性引物使用Primer express 2.0軟件設(shè)計(jì)引物探針，序列如下：HC-KIT（擴(kuò)增片段長(zhǎng)度121 bp）上游引物：5′-GGCAG CCAGAAATATCCTCCT-3′，下游引物：5′-CACAGG TAGTCGAGCGTTTCCT-3′。H-β肌動(dòng)蛋白（擴(kuò)增片段長(zhǎng)度106 bp）上游引物：5′-GCATGGGTCAGAAG GATTCCT-3′，下游引物：5′-TCGTCCCAGTTGGTGA CGAT-3′。RNA的提取：各實(shí)驗(yàn)組及對(duì)照組的黑素細(xì)胞總RNA采用Trizol一步法進(jìn)行提取。β肌動(dòng)蛋白作為內(nèi)參照。去基因組：使用Nase-free的DNaseⅠ（美國(guó)Promega公司）以下體系配置反應(yīng)液，37℃消化30 min，65℃滅活10 min。反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)：取4 μl RNA模板做反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，反應(yīng)條件為37℃15 min，然后85℃5s。熒光定量PCR反應(yīng)：反應(yīng)條件為93℃2 min，93℃15 s，55℃25 s，72℃25 s，共40個(gè)循環(huán)。每個(gè)樣本重復(fù)3次。

結(jié)果

一、正常人表皮黑素細(xì)胞的培養(yǎng)及鑒定

培養(yǎng)24 h時(shí)大部分細(xì)胞可貼壁，鏡下可見(jiàn)散在分布的梭形或多角形細(xì)胞，樹(shù)突少而細(xì)長(zhǎng)，少量呈圓形、胞質(zhì)透明的細(xì)胞。24 h后首次換液，以后每隔2～3 d換1次液，鏡下可觀察到黑素細(xì)胞逐漸增多，樹(shù)突數(shù)量逐漸增加至2個(gè)以上，角質(zhì)形成細(xì)胞也呈“鋪路石樣”聚集。約8～15 d黑素細(xì)胞及角質(zhì)形成細(xì)胞接近80%融合，此時(shí)可傳代。見(jiàn)圖1。

圖1 正常人表皮黑素細(xì)胞（×100）

L-DOPA染色鑒定人表皮黑素細(xì)胞：正常人表皮黑素細(xì)胞經(jīng)L-DOPA染色后，可呈陽(yáng)性反應(yīng)，各細(xì)胞樹(shù)突及胞質(zhì)呈灰棕色或棕褐色。見(jiàn)圖2。

圖2 L-DOPA染色陽(yáng)性人表皮黑素細(xì)胞（×100）

HMB-45免疫組化染色鑒定：經(jīng)HMB-45染色，鏡下胞質(zhì)呈棕黃色或棕褐色，表明染色結(jié)果為陽(yáng)性，證明該細(xì)胞可正常合成黑素，為成熟黑素細(xì)胞。見(jiàn)圖3。

圖3 HMB-45染色陽(yáng)性人表皮黑素細(xì)胞（×100）

二、不同濃度姜黃素對(duì)黑素細(xì)胞活性的影響

各組數(shù)據(jù)經(jīng)兩因素多個(gè)水平的析因設(shè)計(jì)與方差分析檢驗(yàn)后，結(jié)果顯示不同濃度姜黃素溶液對(duì)黑素細(xì)胞增殖的影響不同（F=43.617，P=0.000），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，即姜黃素溶液濃度越高對(duì)黑素細(xì)胞越有抑制作用。不同時(shí)間對(duì)黑素細(xì)胞的增殖也有影響（F=11.459，P=0.000），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，即隨著姜黃素溶液作用時(shí)間越長(zhǎng)對(duì)黑素細(xì)胞越有抑制作用。不同濃度姜黃素溶液與時(shí)間有交互作用（F=3.168，P＜0.05），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，即隨著姜黃素溶液濃度的增加及作用時(shí)間的增長(zhǎng)，對(duì)黑素細(xì)胞的抑制作用增強(qiáng)。見(jiàn)表1。

三、不同濃度姜黃素對(duì)黑素細(xì)胞遷移的影響

培養(yǎng)48 h時(shí)觀察細(xì)胞遷移情況。單因素方差分析結(jié)果顯示，F(xiàn)=1534.467，P＜0.001，不同濃度姜黃素對(duì)黑素細(xì)胞遷移率的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。Levene方差齊性檢驗(yàn)顯示，F(xiàn)=1.181，P=0.376，按α=0.1水準(zhǔn)，滿足方差齊性。采用SNK法進(jìn)行多重比較顯示，與對(duì)照組（80.25%±1.48%）相比，5、10、20 μmol/L的姜黃素可明顯抑制黑素細(xì)胞的遷移，遷移率分別為 65.82% ±0.63%，51.30% ±0.92%，21.50% ± 0.92%；差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P值分別為0.004、＜0.001、＜0.001）。

表1 不同濃度姜黃素對(duì)黒素細(xì)胞活性的影響（±s）

表1 不同濃度姜黃素對(duì)黒素細(xì)胞活性的影響（±s）

注：n=3。a：僅有培養(yǎng)基；b：培養(yǎng)基＋黑素細(xì)胞；c：培養(yǎng)基＋各濃度姜黃素；d：培養(yǎng)基＋黑素細(xì)胞＋各濃度姜黃素；e：與陰性對(duì)照組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）

組別 24 h 48 h空白對(duì)照組a 0.009±0.001 0.008±0.001陰性對(duì)照組b 1.000±0.018 0.993±0.064藥物對(duì)照組c 5 μmol/L姜黃素 0.035±0.005 0.037±0.003 10 μmol/L姜黃素 0.031±0.004 0.033±0.004 20 μmol/L姜黃素 0.032±0.002 0.035±0.002 30 μmol/L姜黃素 0.039±0.003 0.040±0.002實(shí)驗(yàn)組d 5 μmol/L姜黃素 1.007±0.064 0.959±0.029 10 μmol/L姜黃素 0.970±0.030 0.885±0.033 20 μmol/L姜黃素 0.870±0.066 0.877±0.025 30 μmol/L姜黃素 0.783±0.053e 0.637±0.015e

四、不同濃度姜黃素對(duì)黑素細(xì)胞c-kit mRNA表達(dá)的影響

培養(yǎng)48 h時(shí)，單因素方差分析結(jié)果顯示，F(xiàn)= 39.115，P＜0.001，不同濃度姜黃素組黑素細(xì)胞c-kit mRNA相對(duì)表達(dá)量不完全相同。方差齊性檢驗(yàn)顯示，F(xiàn)=3.640，P=0.064，按α=0.10水準(zhǔn)，尚不能認(rèn)為4組資料方差齊。采用Tamhane T2進(jìn)行多重比較，與對(duì)照組（3.371±0.352）相比，5、10、20 μmol/L姜黃素在培養(yǎng) 48 h時(shí)均能顯著抑制黑素細(xì)胞 c-kit mRNA表達(dá)（c-kit mRNA相對(duì)表達(dá)量分別為1.799± 0.372，1.539±0.224，1.026±0.038），P值分別為0.025、0.012、0.021，且呈濃度依耐性，以20 μmol/L的姜黃素抑制最顯著。

討論

研究發(fā)現(xiàn)，姜黃素具有抗炎、抗細(xì)菌、抗氧化、抗腫瘤、抑制酪氨酸酶活性的作用［6-7］。林茂等［8］通過(guò)探討姜黃素對(duì)體外原代培養(yǎng)的正常人表皮黑素細(xì)胞黑素生成及酪氨酸酶活性的影響，推測(cè)姜黃素對(duì)黃褐斑等色素性皮膚病有一定的治療作用。但其具體機(jī)制仍不清楚，為了進(jìn)一步研究姜黃素治療色素沉著性疾病的作用及其機(jī)制，我們通過(guò)體外培養(yǎng)人表皮黑素細(xì)胞，探討姜黃素對(duì)人表皮黑素細(xì)胞活性、遷移及與遷移密切相關(guān)的c-kit mRNA相對(duì)表達(dá)量的影響。

黑素細(xì)胞分別經(jīng)5、10、20 μmol/L濃度的姜黃素培養(yǎng)基作用24、48 h后，細(xì)胞形態(tài)學(xué)上未見(jiàn)明顯改變。但經(jīng)30 μmol/L濃度的姜黃素培養(yǎng)基處理24 h后，部分黑素細(xì)胞出現(xiàn)了核固縮，樹(shù)突收縮及折光性減弱，且細(xì)胞數(shù)目較空白對(duì)照組減少。采用MTS法檢測(cè)細(xì)胞活性，發(fā)現(xiàn)當(dāng)姜黃素達(dá)到30 μmol/L時(shí)對(duì)黑素細(xì)胞有明顯的毒性作用，提示低濃度的姜黃素對(duì)黑素細(xì)胞無(wú)明顯毒性作用，但30 μmol/L的姜黃素可直接引起細(xì)胞凋亡。有關(guān)黑素細(xì)胞凋亡的具體機(jī)制，目前仍然不清楚。研究發(fā)現(xiàn)，19 000磷蛋白靶向作用可以消除活化的黑素細(xì)胞，其表達(dá)上調(diào)或下調(diào)都會(huì)抑制黑素細(xì)胞的活性，從而黑素含量和酪氨酸酶活性都會(huì)降低。19 000磷蛋白1是正常分化的黑素細(xì)胞直接的抑制開(kāi)關(guān)，而能調(diào)節(jié)19 000磷蛋白l的因子是治療局限性色素沉著的潛在途徑之一。姜黃素是如何引起黑素細(xì)胞的凋亡，其凋亡是否與上述凋亡蛋白酶相關(guān)，這些尚待進(jìn)一步研究。

有學(xué)者認(rèn)為，黑素細(xì)胞的遷移是依賴于膜結(jié)合的c-kit受體，c-kit受體通過(guò)跨膜二聚化或突變體的基底目標(biāo)而改變上皮內(nèi)黑素細(xì)胞定位、存活及與上皮細(xì)胞的粘附［9］。Oba-Shinjo等研究發(fā)現(xiàn)黑素細(xì)胞的黏附、遷移與細(xì)胞外基質(zhì)具有密切關(guān)聯(lián)。黑素細(xì)胞為貼壁生長(zhǎng)的細(xì)胞，自身不能分泌細(xì)胞外基質(zhì)，但可與周圍的細(xì)胞外基質(zhì)黏附從而發(fā)生一系列變化［10］。有學(xué)者發(fā)現(xiàn)，當(dāng)黑素細(xì)胞處于增殖狀態(tài)時(shí)，與細(xì)胞外基質(zhì)纖維連接蛋白的黏附性可增強(qiáng)［11］。本研究為觀察姜黃素對(duì)表皮黑素細(xì)胞的遷移情況，我們的預(yù)實(shí)驗(yàn)用絲裂霉素提前16 h作用于黑素細(xì)胞，以期在不損傷細(xì)胞活性的前提下終止黑素細(xì)胞的增殖，觀察姜黃素對(duì)黑素細(xì)胞遷移情況的影響，結(jié)果提示5、10、20 μmol/L的姜黃素可抑制黑素細(xì)胞的遷移，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，且隨著的濃度的增大，對(duì)黑素細(xì)胞的抑制越顯著。我們采用熒光定量PCR檢測(cè)經(jīng)不同濃度姜黃素作用后人表皮黑素細(xì)胞c-kit mRNA的相對(duì)表達(dá)量，結(jié)果顯示，姜黃素在20 μmol/L的范圍內(nèi)，可下調(diào)黑素細(xì)胞c-kit mRNA的相對(duì)表達(dá)量。因此，通過(guò)本研究，我們認(rèn)為姜黃素在低濃度時(shí)對(duì)黑素細(xì)胞無(wú)明顯細(xì)胞毒性，30 μmol/L的姜黃素可引起黑素細(xì)胞的凋亡從而直接抑制局部黑素細(xì)胞的增殖。姜黃素可下調(diào)黑素細(xì)胞c-kit mRNA相對(duì)表達(dá)量，并對(duì)黑素細(xì)胞的遷移能力有抑制作用。這些結(jié)果表明，姜黃素具有開(kāi)發(fā)為美白產(chǎn)品的潛能，為治療黃褐斑等色素沉著性疾病提供了一定的依據(jù)，但姜黃素是如何抑制酪氨酸酶活性及黑素細(xì)胞的遷移，它通過(guò)什么途徑誘導(dǎo)黑素細(xì)胞的凋亡，尚待進(jìn)一步研究。

［1］Wu IB,Lambert C,Lotti TM,et al.Melasma［J］.G Ital Dermatol Venereol,2012,147（4）:413-418.

［2］Yamakoshi J,Sano A,Tokutake S,et al.Oral intake of proanthocyanidin-rich extract from grape seeds improves chloasma［J］. Phytother Res,2004,18（11）:895-899.

［3］Jang YH,Lee JY,Kang HY,et al.Oestrogen and progesterone receptor expression in melasma:an immunohistochemical analysis［J］.J Eur Acad Dermatol Venereol,2010,24（11）:1312-1316.

［4］Grimes PE.Management of hyperpigmentation in darker racial ethnic groups［J］.Semin Cutan Med Surg,2009,28（2）:77-85.

［5］劉彥群,周琳,魏志平.姜黃素對(duì)小鼠黑素瘤的抑制作用及對(duì)核因子κB激活和生存素表達(dá)的影響［J］.中華皮膚科雜志,2007, 40（11）:684-687.

［6］Lee KH,Ab Aziz FH,Syahida A,et al.Synthesis and biological evaluation of curcumin-like diarylpentanoid analogues for antiinflammatory,antioxidant and anti-tyrosinase activities［J］.Eur J Med Chem,2009,44（8）:3195-3200.

［7］楊柳依,曹煜,魏羽佳,等.14種中藥提取成分對(duì)酪氨酸酶活性的抑制作用［J］.中華皮膚科雜志,2003,36（4）:207-209.

［8］林茂,盧珊姍,齊曉怡,等.姜黃素對(duì)正常人表皮黑素細(xì)胞黑素生成的影響［J］.中國(guó)中西醫(yī)結(jié)合皮膚性病學(xué)雜志,2011,10（1）:5-7.

［9］Tabone-Eglinger S,Wehrle-Haller M,Aebischer N,et al. Membrane-bound Kit ligand regulates melanocyte adhesion and survival,providing physical interaction with an intraepithelial niche［J］.FASEB J,2012,26（9）:3738-3753.

［10］Oba-Shinjo SM,Correa M,Ricca TI,et al.Melanocyte transformation associated with substrate adhesion impediment［J］. Neoplasia,2006,8（3）:231-241.

［11］Danen EH,Jansen KF,Klein CE,et al.Loss of adhesion to basement membrane components but not to keratinocytes in proliferating melanocytes［J］.Eur J Cell Biol,1996,70（1）:69-75.

Effect of curcumin on the activity and migration of as well as c-kit mRNA expression in melanocytes

Li Qilin, Lu Xiaojuan,Niu Mu.Department of Dermatology,Fourth Affiliated Hospital of Jinan University,Guangzhou Red Cross Hospital,Guangzhou 510220,China
< class="emphasis_italic">Corresponding author:Li Qilin,Email:qlli_cn@163.com

Li Qilin,Email:qlli_cn@163.com

ObjectiveTo explore the effect of curcumin on the activity and migration of as well as c-kit mRNA expression in melanocytes.MethodsHuman epidermal melanocytes were isolated from the prepuce in adolescents and subjected to primary culture.To estimate the effect of curcumin on the proliferative activity of melanocytes,some melanocytes were randomly divided into several groups to be cultured in the MelM-2 medium with or without the presence of 5,10,20 or 30 μmol/L curcumin,the MelM-2 medium containing curcumin of 5－30 μmol/L served as the drug control groups,and the MelM-2 medium without curcumin served as the blank control group.After 24 and 48 hours of culture, MTS assay was performed to evaluate the proliferative activity of melanocytes.Some cultured melanocytes were randomly divided into 4 groups to be cultured in the MelM-2 medium with 0,5,10 and 20 μmol/L curcumin respectively for 48 hours.Then,wound scratch assay was conducted to estimate the migratory activity of melanocytes,and real-time fluorescence-based quantitative PCR to quantify the mRNA expression of c-kit in melanocytes.Statistical analysis was carried out by factorial design analysis of variance（ANOVA）,one-way ANOVA and least significant difference（LSD）-ttest.ResultsThe proliferative activity of melanocytes was significantly decreased at 24 and 48 hours in the 30-μmol/L curcumin group compared with the negative control group（0.783±0.053 vs.1.000±0.018 at 24 hours,0.637±0.015 vs.0.993±0.064 at 48 hours,bothP＜0.05）,while no significant differences were observed between the other curcumin groups and the negative control group（allP＞0.05）.The 48-hour treatment with curcumin could significantly inhibit the migration of melanocytes in the 5-,10-and 20-μmol/L curcumin groups compared with the control group（allP＜0.05）. The mRNA expression level of c-kit was also significantly reduced at 48 hours in the 5-,10-and 20-μmol/L curcumin groups compared with the control group（1.799±0.372,1.539±0.224 and 1.026±0.038 vs.3.371±0.352,allP＜0.05）.ConclusionCurcumin at low concentrations（≤20 μmol/L）has no obvious cytotoxicity against melanocytes, but can inhibit the migration of and c-kit mRNA expression in melanocytes,while curcumin at 30 μmol/L can promote the apoptosis of melanocytes.

Melanocytes;Curcumin;Cell movement;Proto-oncogene proteins c-kit;Gene expression

10.3760/cma.j.issn.0412-4030.2015.10.010

廣東省科技計(jì)劃項(xiàng)目（粵科函規(guī)財(cái)字［2014］807號(hào)）

510220廣州，暨南大學(xué)第四附屬醫(yī)院、廣州市紅十字會(huì)醫(yī)院皮膚科

李其林，Email：qlli_cn@163.com

2015-01-26）

（本文編輯：吳曉初）