梅毒螺旋體Tp0751蛋白在早期梅毒兔模型皮損轉(zhuǎn)錄水平的研究

柯吳堅(jiān) 楊慧蘭 楊斌 鄭和平 楊立剛 陳征宇薛耀華 任旭琦 呂萍 張曉輝 王柳苑

梅毒螺旋體Tp0751蛋白在早期梅毒兔模型皮損轉(zhuǎn)錄水平的研究

柯吳堅(jiān) 楊慧蘭 楊斌 鄭和平 楊立剛 陳征宇薛耀華 任旭琦 呂萍 張曉輝 王柳苑

目的探討梅毒螺旋體（Tp）Tp0751蛋白在早期梅毒兔模型中轉(zhuǎn)錄水平變化情況。方法3只新西蘭白兔背部剔毛，皮下注入107/ml Tp Nichols Seattle株0.1 ml，共10處，建立早期兔梅毒感染模型。同時(shí)于未注射部位行皮膚活檢術(shù)，切取0.4 cm×0.4 cm皮膚作為陰性對照。每天觀察注射部位皮膚變化情況，測量并記錄皮疹大小。每隔3天切取1處注射部位0.4 cm×0.4 cm皮膚用于Tp0751和Tp0574 mRNA檢測。整個(gè)實(shí)驗(yàn)過程30 d，共行11次皮膚活檢。熒光定量PCR連續(xù)動(dòng)態(tài)觀察兔硬下疳皮損形成過程中Tp0751 mRNA表達(dá)的差異。結(jié)果新西蘭白兔皮下注入Tp后，背部在第6天出現(xiàn)紅色丘疹，到第19天皮疹達(dá)最大并出現(xiàn)潰瘍，形成硬下疳。第25天，全身陸續(xù)出現(xiàn)播散性二期梅毒疹。Tp0574和Tp0751 mRNA水平在早期呈現(xiàn)上升趨勢，到第15天達(dá)最高峰（與其他各時(shí)間點(diǎn)比較，均P＜0.05），其后迅速下降，在第27天有少許上升。標(biāo)準(zhǔn)化的Tp0751 mRNA從第15天起轉(zhuǎn)錄水平逐漸升高，到第24天達(dá)最高峰（P＜0.05）。結(jié)論標(biāo)準(zhǔn)化Tp0751轉(zhuǎn)錄水平在Tp被清除后期出現(xiàn)全身播散性二期梅毒疹前高表達(dá)。表明Tp0751蛋白可能參與Tp全身播散。

蒼白密螺旋體；梅毒；模型，動(dòng)物；兔；Tp0751蛋白

梅毒是由梅毒螺旋體（Treponema pallidum，Tp）感染引起的一種性傳播疾病。在自然宿主中，Tp感染始于暴露的黏膜表面或表皮微損傷，隨后Tp在感染入口處繁殖并通過循環(huán)系統(tǒng)播散全身［1］。體外研究顯示，Tp可通過Tp0751蛋白黏附到宿主體內(nèi)的層黏連蛋白，并經(jīng)自催化裂解作用降解層黏連蛋白和纖維蛋白原［2-6］，提示Tp在感染過程中利用Tp0751在體內(nèi)進(jìn)行播散［2］。我們建立梅毒早期感染兔模型，連續(xù)觀察Tp0751蛋白在皮損中轉(zhuǎn)錄水平變化情況，以期從宿主方面探討Tp播散的機(jī)制。

一、動(dòng)物來源

新西蘭白兔3月齡，3 kg重，購于南方醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，合格證號44002100005265。予不含抗生素的飼料和水喂養(yǎng)，取血清行性病研究實(shí)驗(yàn)室試驗(yàn)（VDRL）和梅毒螺旋體免疫熒光抗體試驗(yàn)（FTA）以排除兔梅毒螺旋體感染。將檢測結(jié)果全陰性新西蘭白兔3只用于后續(xù)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)。

二、方法

1.Tp0751序列分析和引物設(shè)計(jì)：從基因庫和DNA資料庫中搜索Tp0751氨基酸和核酸序列（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/genome/?term=Treponema%20pallidum），用BioEdit 7.1軟件（http://bioedit.software.informer.com/7.1/）對密螺旋體屬的5個(gè)梅毒蒼白密螺旋體（Nichols、DAl-1、Chicago、Mexico A 和SS-14）、3 個(gè)雅司蒼白密螺旋體（Samoa D、CDC2 和 Gauthier）和1個(gè)未分類的類人猿密螺旋體（Fribourg-Blanc）進(jìn)行多重序列比對。應(yīng)用引物設(shè)計(jì)軟件Primer 3：WWW primer tool（http://biotools.umassmed.edu/bioapps/primer3_www.cgi）對基因庫查詢到Nichols株Tp0751基因序列（序列號：NC_000919.1）進(jìn)行引物設(shè)計(jì)。用Restriction Mapper（http://www.restrictionmapper.org/）和NEBcutter V2.0.（http://tools.neb.com/NEBcutter2/）預(yù)判待擴(kuò)增的DNA序列不被HindⅢ限制性內(nèi)切酶（英國New England Biolabs公司）酶切。Tp0751正向引物：5′-ATGATACCTTCGGCGCTCTA-3′，反向引物：5′-CTATGCGCATTGCTGTTTGT-3′，擴(kuò)增片段204 bp。管家基因Tp0574 正向引物：5′-CGTGTGGTATCAACTATGG-3′，反向引物：5′-TCAACCGTGTACTCAGTGC-3′，擴(kuò)增片段 313 bp。Tp0574引物和質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品由華盛頓大學(xué)Giacani教授饋贈(zèng)。

2.Tp傳代培養(yǎng)：取2 ml凍存的108/ml Tp Nichols Seattle株（由華盛頓大學(xué)Lukehart教授饋贈(zèng)）接種于新西蘭白兔雙側(cè)睪丸，每個(gè)睪丸接種1 ml。待7～10 d形成睪丸炎后，處死兔子，手術(shù)取睪丸，切碎、離心制備成108/ml菌懸液。為使Tp恢復(fù)毒力，再次按以上步驟傳代于另一只新西蘭白兔睪丸并提取Tp后用于建立早期梅毒兔模型。

3.早期梅毒兔模型建立：3只新西蘭白兔背部剔毛，每只兔皮下注入107/ml Tp Nichols Seattle株0.1 ml，共10處。同時(shí)于未注射部位行皮膚活檢術(shù)，切取0.4 cm×0.4 cm皮膚作為陰性對照。每天觀察注射部位皮膚變化情況，測量并記錄皮疹大小。每隔3天切取1處注射部位0.4 cm×0.4 cm皮膚用于Tp0751和Tp0574 mRNA檢測。整個(gè)實(shí)驗(yàn)過程30 d，共行11次皮膚活檢。

4.總RNA提取和cDNA合成：用Ultraspec RNA分離液（美國Biotecx公司）從兔皮膚組織和兔睪丸提取的Nichols Seattle株菌懸液分離提取總RNA；用Turbo DNA酶（美國Ambion公司）去除總RNA中基因組DNA；用SuperScriptⅢ第1鏈合成系統(tǒng)（美國Invitrogen公司）合成cDNA，以上過程嚴(yán)格按試劑盒說明書操作。

5.PCR擴(kuò)增Tp0751：以兔睪丸Nichols Seattle株cDNA為模板，PCR擴(kuò)增Tp0751 mRNA。50 μl PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系：5 μl待測 cDNA 樣本、200 μmol/L dNTPs、5 μl 10 × Go Taq PCR緩沖液 （美國 Promega 公司）、1.5 mmol/L MgCl2、0.6 μmol/L Tp0751引物、0.5 U熱啟動(dòng)Taq PCR聚合酶（美國Promega公司）。擴(kuò)增條件：95℃變性 10 min；95℃ 1 min、60℃ 2 min、72℃1 min，共45個(gè)循環(huán)；最后72℃延伸10 min。擴(kuò)增PCR產(chǎn)物經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳鑒定。

6.Tp0751質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品構(gòu)建：將4 μl Tp0751 PCR擴(kuò)增產(chǎn)物克隆至TOPO TA克隆pCR 2.1質(zhì)粒（美國Life Technologies公司）。將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到TOP 10感受態(tài)細(xì)胞（美國Invitrogen公司）。挑選10個(gè)菌落，用常規(guī)PCR法（同上）驗(yàn)證轉(zhuǎn)化子。取PCR驗(yàn)證正確的轉(zhuǎn)化子搖菌過夜，Plasmid Mini試劑盒（德國Qiagen公司）提取質(zhì)粒。雙向DNA測序法（美國Genewiz公司）再次驗(yàn)證重組質(zhì)粒。線性質(zhì)粒經(jīng)限制性內(nèi)切酶HindⅢ（Promega）酶切過夜。用PCR純化試劑盒（德國Qiagen公司）純化酶切后質(zhì)粒。NanoDrop-1000分光光度計(jì)（美國Thermo Fisher Scientific公司）檢測質(zhì)粒濃度。質(zhì)?？截悢?shù)計(jì)算公式 =［（6.02× 1023拷貝數(shù)）×（質(zhì)粒濃度 g/μl）］/［擴(kuò)增產(chǎn)物堿基數(shù) ×（660 道爾頓/bp）］［7］。根據(jù)計(jì)算結(jié)果，10 倍倍比稀釋質(zhì)粒（106～ 100）拷貝數(shù)/μl。為獲得可靠的標(biāo)準(zhǔn)曲線，每個(gè)不同濃度的質(zhì)粒在LightCycle擴(kuò)增儀（瑞士Roche公司）重復(fù)擴(kuò)增6次。標(biāo)準(zhǔn)曲線最大可接受誤差閾值設(shè)置為0.05。

7.實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測Tp0751和Tp0574 mRNA：參考LightCycler FastStart DNA MasterPLUS SYBR Green試劑盒說明，熒光定量PCR檢測早期梅毒兔模型皮損Tp0751和Tp0574轉(zhuǎn)錄水平。以兔睪丸Nichols Seattle株cDNA為陽性對照，以分子水（mH2O）為陰性對照。反應(yīng)體系：5 μl待測cDNA 樣本、1 μmol/L Tp0751 或 Tp0574 引物、4 μl 5 × Master Mix、9 μl mH2O。反應(yīng)條件：95℃變性 10 min；95℃ 10 s、60℃8 s、72℃13 s，共45個(gè)循環(huán)；最后72℃延伸10 min。當(dāng)每個(gè)循環(huán)擴(kuò)增溫度達(dá)引物采集溫度（88℃）時(shí)，SYBR Green結(jié)合到雙鏈DNA并釋放熒光，在530 nm處可檢測到熒光信號。每次檢測均加入已知濃度的質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品作為內(nèi)參。每個(gè)樣本重復(fù)檢測3次。LightCycler software（3.5版本）分析檢測結(jié)果。根據(jù)熔解曲線排除非特異性擴(kuò)增和形成的引物二聚體。

圖1 早期梅毒兔模型一期和二期皮疹形成過程 1A：皮下注入107/ml Tp Nichols Seattle株后第7天，背部見高出皮膚的紅色小丘疹；1B：第21天，背部紅色丘疹增大，正中出現(xiàn)潰瘍；1C：第30天，背部丘疹變平，潰瘍結(jié)痂消失；1D：第25天，背部出現(xiàn)播散性淡紅色斑丘疹；1E：第28天，背部播散性斑丘疹變大、顏色加深

三、結(jié)果

1.Tp0751序列分析結(jié)果：從基因庫中搜索到9個(gè)密螺旋體的Tp0751氨基酸和核酸序列進(jìn)行多重序列比對，結(jié)果顯示，9個(gè)密螺旋體的Tp0751的基因序列完全一致，并未出現(xiàn)基因突變、插入或缺失等情況。

2.早期梅毒兔模型一期和二期皮疹形成過程：予兔背部皮下注入107/ml Tp Nichols Seattle株0.1 ml，第6天，可見直徑0.5 cm、邊界清楚、質(zhì)地略硬的紅色小丘疹。隨著時(shí)間增加，丘疹逐漸增大、高出皮膚，顏色加深。到第19天時(shí)，皮疹增大到直徑2.1 cm，正中出現(xiàn)直徑0.2 cm潰瘍。持續(xù)4～5 d后，皮疹逐漸變小，顏色變淡，潰瘍處結(jié)痂、消失（圖1A～1C）。從第25天起（圖1D），兔模型全身陸續(xù)出現(xiàn)散在的淺紅色的播散性二期梅毒疹。隨著時(shí)間的增加，紅色丘疹逐漸加深、變大、高出皮膚（圖1E），5～7 d后變平并消失。

3.實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測Tp0751和Tp0574 mRNA水平：制備的Tp0751質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品其拷貝數(shù)達(dá)5.85×109拷貝/μl，予10倍倍比稀釋建立標(biāo)準(zhǔn)曲線后，分別對Tp早期兔模型不同時(shí)間皮損Tp0574和Tp0751 mRNA進(jìn)行動(dòng)態(tài)表達(dá)水平檢測，發(fā)現(xiàn)二者的mRNA水平呈現(xiàn)逐漸上升，到第15天達(dá)最高峰后迅速下降，隨后在第27天又有小幅上升。各時(shí)間點(diǎn)Tp0574和Tp0751 mRNA水平經(jīng)One-Way ANOVA分析比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（分別F=14.54、9.677，均P＜0.000 1）。用SNK法對各時(shí)間點(diǎn)均值間兩兩比較，在第15天Tp0574和Tp0751轉(zhuǎn)錄水平均達(dá)最高（P＜0.05）。見表1。

將Tp0751 mRNA熒光定量PCR檢測結(jié)果與Tp管家基因Tp0574進(jìn)行定量比較，最終獲得標(biāo)準(zhǔn)化Tp0751 mRNA動(dòng)態(tài)表達(dá)水平。經(jīng)One-Way ANOVA分析比較，各時(shí)間點(diǎn)轉(zhuǎn)錄水平差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=4.367，P=0.0003）。各時(shí)間點(diǎn)均值間兩兩比較，標(biāo)準(zhǔn)化Tp0751轉(zhuǎn)錄水平在早期呈持續(xù)穩(wěn)定表達(dá)，從第15天起，其轉(zhuǎn)錄水平呈上升趨勢，在第24天也即出現(xiàn)二期全身播散性梅毒疹前1天，達(dá)最高峰（P＜0.05），隨后呈下降趨勢。

四、討論

多種病原體通過細(xì)胞外基質(zhì)（ECM）層黏連蛋白侵入附著到宿主組織［5］。對Tp基因組預(yù)測的編碼外膜蛋白的開放閱讀框（ORF）進(jìn)行分析，并重組表達(dá)這些蛋白質(zhì)發(fā)現(xiàn)，Tp外膜蛋白Tp0751具有黏附層黏連蛋白功能［6］。進(jìn)一步研究顯示，Tp0751 可黏附到層黏連蛋白 1、2、4、8、10 亞型［5］。感染過程中，當(dāng)高度侵襲性病原體的黏附素遇到宿主體內(nèi)各種組織時(shí)，這種廣泛的黏附功能將發(fā)揮其普遍黏附作用［5］。與其他侵襲性病原體（如肺炎鏈球菌、鼠疫耶爾森菌、霍亂弧菌和產(chǎn)氣莢膜梭菌等）相似，Tp可表達(dá)Tp0751蛋白，該蛋白可結(jié)合并降解人纖維蛋白原和層黏連蛋白［2-3］。Houston 等［3］對 Tp0751一級序列分析顯示，其C端存在HEXXH金屬蛋白酶基序，通過引入 3個(gè)獨(dú)立突變點(diǎn) （AEXXH［H198A］，HAXXH［E199A］和 HEXXA［H202A］）可阻止 Tp0751介導(dǎo)纖維蛋白凝塊溶解作用，但該點(diǎn)突變不影響Tp0751與宿主成分黏附作用［2］，提示Tp0751基因的保守性在Tp體內(nèi)播散中具有重要作用。

表1 實(shí)時(shí)熒光定量PCR動(dòng)態(tài)檢測早期兔模型不同時(shí)間皮損Tp0751和Tp0574 mRNA結(jié)果（±s）

表1 實(shí)時(shí)熒光定量PCR動(dòng)態(tài)檢測早期兔模型不同時(shí)間皮損Tp0751和Tp0574 mRNA結(jié)果（±s）

注：n=3。a：用SNK法對各時(shí)間點(diǎn)均值間兩兩比較，Tp0574和Tp0751轉(zhuǎn)錄水平與其他時(shí)間點(diǎn)比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，P＜0.05

活檢時(shí)間 Tp0751拷貝/μl Tp0574拷貝/μl Tp0751×100/Tp0574第6天 1.78±2.68 17.78±23.45 3.68±5.54第9天 1.96±1.40 30.22±19.96 9.44±10.36第12天 9.57±8.07 106.83±80.65 8.16±2.91第15天 32.50±19.48a 490.33±338.64a 7.01±0.94第18天 12.28±7.21 126.78±74.29 9.85±2.02第21天 0.76±0.56 8.78±5.83 12.08±7.59第24天 2.09±1.90 6.89±2.71 29.31±20.93a第27天 11.41±17.31 44.22±59.25 13.58±13.79第30天 1.62±1.67 7.22±8.32 11.08±9.22

本研究予3只兔背部皮下注入Nichols Seattle株，每隔3天行皮膚活檢術(shù)，取皮損行Tp0751和Tp0574 mRNA熒光定量PCR檢測。在皮下注入Tp后第6天出現(xiàn)紅色小丘疹。隨時(shí)間的增加，丘疹逐漸增大。當(dāng)?shù)降?9天時(shí)，皮疹達(dá)最大并出現(xiàn)潰瘍。在第25天，早期兔模型出現(xiàn)全身播散性紅色、略高于皮膚的二期梅毒疹。二期梅毒疹持續(xù)5～7 d后消失。以上實(shí)驗(yàn)與Godornes等［6］建立的早期梅毒模型觀察到的結(jié)果相似，證明早期梅毒兔模型建立成功。分別對Tp早期兔模型皮損Tp0574和Tp0751 mRNA進(jìn)行動(dòng)態(tài)表達(dá)水平檢測發(fā)現(xiàn)，二者的mRNA水平呈現(xiàn)逐漸上升趨勢，到第15天達(dá)最高峰（P＜0.05），其后迅速下降。雖然在第27天又有少許上升，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。Tp0574和Tp0751轉(zhuǎn)錄水平與Tp在宿主一期皮損內(nèi)增殖（早期轉(zhuǎn)錄水平增加）和誘導(dǎo)宿主后天抗感染免疫所致的病原體清除（后期下降）的過程相平行，進(jìn)一步支持早期梅毒模型建立成功。

Tp0751轉(zhuǎn)錄水平受皮損內(nèi)Tp數(shù)量多少影響，為獲得標(biāo)準(zhǔn)化Tp0751 mRNA水平，我們需要選用合適的參比基因作為對照，以期獲得可靠的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。Giacani等［8］為檢測不同Tp菌株感染兔模型睪丸中tpr基因mRNA表達(dá)水平，選擇多個(gè)Tp高轉(zhuǎn)錄表達(dá)基因如47 000的脂蛋白基因（Tp0574）、flaA 基 因 （Tp0249）、tpp17 基 因 （Tp0435）、groEL 基 因（Tp0030）和V型ATP酶的A亞基（Tp0426）進(jìn)行轉(zhuǎn)錄水平分析。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，Tp0574和Tp0426基因二者在不同Tp菌株感染峰值間的表達(dá)差異最低，因此，建議使用任一基因作為參照基因用于mRNA表達(dá)標(biāo)準(zhǔn)化的參考基因。此外，Smajs等［9］研究顯示，Tp0574在Tp體內(nèi)持續(xù)穩(wěn)定表達(dá)，通過計(jì)算Tp0574 cDNA/DNA比值（17.7）可間接計(jì)算出皮損內(nèi)Tp感染數(shù)。為此，我們選用Tp管家基因Tp0574作為Tp0751標(biāo)準(zhǔn)化的參比基因，最終獲得較為客觀的Tp0751轉(zhuǎn)錄水平動(dòng)態(tài)變化趨勢。

Tp自然感染過程始于黏附到暴露的黏膜表面或表皮微損傷，隨后Tp開始在感染入口處繁殖并誘導(dǎo)產(chǎn)生一期梅毒皮損（硬下疳），該皮損含有大量的螺旋體。硬下疳持續(xù)存在，直到宿主后天抗感染免疫的形成，引發(fā)調(diào)理吞噬介導(dǎo)的病原體清除，從而使硬下疳皮損自然消退［10-11］。雖然在一期梅毒皮損形成的早期Tp就開始播散并侵入身體各處，但Turner等［12］研究證實(shí)，二期梅毒主要由Tp通過造血系統(tǒng)在體內(nèi)的播散所致。Reid等［13］根據(jù)對TprK可變區(qū)異質(zhì)性研究顯示，96%的二期梅毒疹由于單個(gè)Tp的體內(nèi)再次播散所致。

我們的結(jié)果顯示，Tp0574和Tp0751 mRNA在接種Tp第15天后迅速下降，提示兔模型皮損內(nèi)Tp被宿主局部后天抗感染免疫大量清除，從而使二者mRNA水平表達(dá)下降。而標(biāo)準(zhǔn)化的Tp0751從第15天起轉(zhuǎn)錄水平逐漸升高，在第24天（即出現(xiàn)全身播散性二期梅毒疹前1天）達(dá)最高峰（P＜0.05）。根據(jù)前期體外Tp0751的黏附和播散功能研究結(jié)果，結(jié)合以上數(shù)據(jù)，我們推測，在早期梅毒皮損形成后期，Tp為了對抗宿主后天抗感染免疫引發(fā)調(diào)理吞噬介導(dǎo)的清除作用，通過高度表達(dá)Tp0751蛋白降解層黏連蛋白和纖維蛋白原，進(jìn)而在宿主體內(nèi)播散。

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Transcript levels of theTreponema pallidumprotein Tp0751 in skin lesions of a rabbit model of early syphilis

Ke Wujian*,Yang Huilan,Yang Bin,Zheng Heping,Yang Ligang,Chen Zhengyu,Xue Yaohua,Ren Xuqi,Lyu Ping,Zhang Xiaohui,Wang Liuyuan.*Guangdong Provincial Dermatology Hospital,Guangzhou 510009,China

ObjectiveTo trace changes in the transcript level of theTreponema pallidum（Tp）protein Tp0751 in skin lesions of a rabbit model of early syphilis.MethodsThree New Zealand white rabbits were intracutaneously injected with 0.1 ml of Tp （Nichols Seattle strains）suspensions （107treponemes/ml）at 10 sites on the shaved back to establish a model of early syphilis.All the rabbits

a single injection with the total amount of treponemes being 107.Then,skin changes at injection sites were observed,and the size of skin rashes was recorded on a daily basis.Skin specimens sized 0.4 cm × 0.4 cm were excised from an injection site and a non-injection site（negative control）separately every 3 days for the detection of Tp0751 and Tp0574 mRNAs.The whole experiment lasted 30 days,and a total of 11 skin biopsies were carried out.Fluorescence-based quantitative PCR was performed to measure the mRNA expressions of Tp0751 and Tp0574 continuously and dynamically during the development of chancre.ResultsAfter intracutaneous injection of Tp suspensions,red papules occurred on the back of rabbits on day 6,and reached maximum size on day 19 with the formation of ulcer and chancre.On day 25,disseminated secondary syphilides gradually appeared all over the body surface of the rabbits.The mRNA expression levels of Tp0574 and Tp0751 increased at the early stage,peaked onday 15（compared with the other time points,allP＜0.05）,thereafter rapidly declined,but rose slightly on day 27.The standardized expression level of Tp0751 mRNA increased gradually after day 15,and peaked on day 24（compared with the other time points,allP＜ 0.05）.ConclusionThe transcript level of Tp0751 was high in rabbits at the late stage of Tp clearance when generalized disseminated secondary syphilides had not appeared,suggesting that Tp0751 may be involved in the systemic spread of Tp.

Treponema pallidum;Syphilis;Models,animal;Rabbits;Tp0751 protein

s:Yang Huilan,Email:huilany88@hotmail.com;Yang Bin,Email:yangbin101@hotmail.com

作者單位：510009廣州，廣東省皮膚性病防治中心（柯吳堅(jiān)、楊斌、鄭和平、楊立剛、陳征宇、薛耀華、任旭琦、呂萍、張曉輝、王柳苑）；廣州軍區(qū)廣州總醫(yī)院（楊慧蘭）

10.3760/cma.j.issn.0412-4030.2015.12.011

廣東省醫(yī)學(xué)科研基金指令性課題（C2012032）

楊慧蘭，Email：huilany88@hotmail.com；楊斌，Email：yangbin101@hotmail.com

2015-03-17）

（本文編輯：吳曉初）