Kaposi肉瘤相關(guān)皰疹病毒8型相關(guān)微小RNA k12-1和k12-12在Kaposi肉瘤組織中的表達及意義

吳秀娟 趙宗峰 普雄明

Kaposi肉瘤相關(guān)皰疹病毒8型相關(guān)微小RNA k12-1和k12-12在Kaposi肉瘤組織中的表達及意義

吳秀娟 趙宗峰 普雄明

目的檢測Kaposi肉瘤腫瘤組織中Kaposi肉瘤相關(guān)皰疹病毒8型相關(guān)微小RNA k12-1（kshvmiR-k12-1）和k12-12（kshv-miR-k12-12）的表達，并探討其與Kaposi肉瘤病理分期、HIV感染、人皰疹病毒8型（HHV-8）感染、皮損面積之間的關(guān)系。方法選取液氮保存的Kaposi肉瘤腫瘤組織和瘤旁正常組織18對，采用Trizol法提取標(biāo)本組織中的總RNA并反轉(zhuǎn)錄成cDNA，采用SYBR Green實時熒光定量PCR法定量檢測kshv-miR-k12-1和kshv-miR-k12-12，比較Kaposi肉瘤腫瘤組織及其瘤旁組織中kshv-miR-k12-1和kshv-miR-k12-12表達的差異，并分析其與Kaposi肉瘤病理分期、HIV和HHV-8感染、皮損面積之間的關(guān)系。結(jié)果kshv-miR-k12-1和kshv-miR-k12-12在Kaposi肉瘤腫瘤組織中的2-△△Ct值分別為（1.016±1.645）和（2.104± 1.973），明顯高于瘤旁正常組織，分別為 0.029± 0.019（t=2.542，P=0.016）和 0.102± 0.093（t=4.301，P=0.000）。不同HIV和HHV-8感染狀態(tài)、病理分期、皮損面積患者的kshv-miR-k12-1和kshv-miR-k12-12表達差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（均P＞0.05）。結(jié)論kshv-miR-k12-1和kshv-miR-k12-12在Kaposi肉瘤腫瘤組織中呈明顯高表達，但與HIV感染、HHV-8感染、病理分期及皮損面積無明顯相關(guān)。

肉瘤，卡波西；皰疹病毒8型，人；kshv-miR-k12-1；kshv-miR-k12-12

研究顯示，在Kaposi肉瘤中共有17條Kaposi肉瘤相關(guān)皰疹病毒8型（Kaposi′s sarcoma-associated herpesvirus，KSHV）相關(guān)微小 RNAs，由 12 個基因編碼，易在潛伏感染細胞中被檢測出來，并參與細胞基因的轉(zhuǎn)錄后調(diào)節(jié)［1-2］。K12基因是一個潛伏基因，在 KSHV 裂解復(fù)制期激活［3］，研究表明［4］，kshvmiR-k12-3和kshv-miR-k12-7誘導(dǎo)巨噬細胞和單核細胞分泌白細胞介素6（IL-6）和IL-10，表明這兩個miRNA參與免疫反應(yīng)，從而影響KSHV相關(guān)腫瘤的進展，但kshv-miR-k12-1和kshv-miR-k12-12在Kaposi肉瘤中的表達及意義尚不明確。本研究采用實時熒光定量PCR方法檢測18對Kaposi肉瘤腫瘤組織和瘤旁正常組織中kshv-miR-k12-1和kshv-miR-k12-12的表達，探討kshv-miR-k12-1和kshv-miR-k12-12與Kaposi肉瘤臨床分型、病理類型、人皰疹病毒 8 型（human herpesvirus 8，HHV-8）感染、皮損面積之間的關(guān)系。

作者單位：830001烏魯木齊，新疆維吾爾自治區(qū)人民醫(yī)院皮膚性病科（吳秀娟、普雄明），臨床醫(yī)學(xué)研究中心（趙宗峰）

資料與方法

1.樣本來源及資料收集：組織樣本來自2012年1月至2013年9月在我院就診的Kaposi肉瘤患者腫瘤和瘤旁組織，手術(shù)切除后立即于液氮中儲存。所有標(biāo)本均經(jīng)組織病理檢查，由兩名高年資病理醫(yī)生確診為Kaposi肉瘤。對入選的所有病例完善其臨床資料及相關(guān)檢查結(jié)果，包括性別、年齡、HIV及HHV-8感染情況、病理分期、皮損面積。本研究已通過新疆維吾爾自治區(qū)人民醫(yī)院倫理委員會審批，患者均已簽署知情同意書。

2.主要試劑與儀器：cDNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（美國Epicentre公司），miScript SYBR熒光定量PCR試劑盒（德國Qiagen公司），一抗為鼠抗人HHV-8單克隆抗體（英國Abcam公司），二抗（丹麥Dako公司）。所有引物均由上海英駿生物技術(shù)有限公司合成。NanoDrop? ND-1000（美國 NanoDrop公司），SYBR Green實時熒光定量PCR（美國Applied Biosystems公司）。

3.提取組織中的總RNA：取-80℃凍存的Kaposi肉瘤腫瘤組織和瘤旁正常組織約20 mg，加入Trizol 1 ml，冰浴中用電動勻漿器進行勻漿，然后按總RNA抽提試劑盒說明書提取總RNA。取1 μl RNA進行1.2%瓊脂糖凝膠電泳鑒定RNA完整性，同時取 1 μl RNA用 NanoDrop? ND-1000測定RNA濃度和純度，本次實驗所有標(biāo)本A260/A280均為1.7～2.0，說明RNA純度高。

4.實時熒光定量PCR：根據(jù)cDNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書將RNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，反應(yīng)體系（20 μl）包括緩沖液 2 μl、MMLV 反轉(zhuǎn)錄酶 0.2 μl、總 RNA 700 ng、RNA 酶抑制劑 0.3 μl、dNTP 2μl、莖環(huán)引物0.3 μl，加入去 RNA 酶水至 20 μl。反應(yīng)條件：16 ℃30 min，42℃ 30 min，85℃ 5 min，完成后 cDNA 貯存于-20℃?zhèn)溆?。kshv-miR-k12-1莖環(huán)引物序列：5′-GTCGTATCCAGTGCGTGTCGTGGAGTCGGCAATTG CACTGGATACGACGCTTAC-3′；kshv-miR-k12-12莖環(huán)引物序列：5′-GTCGTATCCAGTGCGTGTCGTGG AGTCGGCAATTGCACTGGATACGACTCAACCA-3′；內(nèi)參U6莖環(huán)引物序列：5′-CGCTTCACGAATTTGCG TGTCAT-3′。實時熒光定量 PCR 反應(yīng)體系（10 μl）包括：熒光染料反應(yīng)液5 μl，上、下游引物各1 μl，cDNA 2 μl，加水至總體積為 10 μl。反應(yīng)條件：95 ℃10 min；40 個 PCR 循環(huán) （95 ℃ 10 s，60 ℃ 60 s）。kshv-miR-k12-1實時熒光定量PCR引物（上游：5′-GGGGATTACAGGAAACTGGGT，下游 5′-GTGCGTG TCGTGGAGTCG-3′），擴增產(chǎn)物大小為 65 bp。kshvmiR-k12-12實時熒光定量PCR引物（上游：5′-AATGGGGGAGGGTGCC-3′，下游 5′-GTGCGTGTCG TGGAGTCG-3′），擴增產(chǎn)物大小為 62 bp。U6 實時熒光定量PCR引物（上游：5′-GCTTCGGCAGCACATA TACTAAAAT-3′，下游 5′-CGCTTCACGAATTTGCG TGTCAT-3′），擴增產(chǎn)物大小為89 bp。本實驗采用2-△△Ct法分析表達量大小，用 2-△△Ct值計算 kshvmiR-k12-1和kshv-miR-k12-12的相對表達量。

5.HHV-8免疫組化染色：采用Envision二步法，一抗工作液稀釋濃度為1∶50，選擇PCR擴增HHV-8基因陽性的組織切片作為陽性對照，用PBS緩沖液代替一抗作為空白對照。

6.統(tǒng)計學(xué)分析：采用SPSS17.0統(tǒng)計軟件，計量資料以±s表示，數(shù)據(jù)比較采用方差分析，獨立樣本t檢驗和配對t檢驗，P≤0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

1.臨床資料：Kaposi肉瘤患者18例，男17例，女1例，維吾爾族；病理分期：斑片期6例，斑塊期3例，結(jié)節(jié)期9例；皮損面積≤1%6例，＞1%～5%5例，＞5%～10%5例，＞10%～30%2例。分型：經(jīng)典型 11例，發(fā)病年齡（64.9±11.0）歲，病程（36.3±39.1）個月，HHV-8感染（HHV-8免疫組化陽性）9例；艾滋?。ˋIDS）相關(guān)型7例，發(fā)病年齡（47.6±11.9）歲，病程（5.3±2.8）個月，HHV-8感染（HHV-8免疫組化陽性）6例。

2.Kaposi肉瘤腫瘤組織和瘤旁正常組織中kshv-miR-k12-1和kshv-miR-k12-12的表達：kshv-miR-k12-1、kshv-miR-k12-12和內(nèi)參 U6的熔解曲線均呈單峰狀，說明熒光分別由目標(biāo)產(chǎn)物kshv-miR-k12-1、kshv-miR-k12-12和內(nèi)參 U6發(fā)出，特異性好。18例Kaposi肉瘤腫瘤組織中kshvmiR-k12-1表達量（2-△△Ct）為1.016±1.645，瘤旁正常組織為0.029±0.019，其表達倍數(shù)（腫瘤/瘤旁）為35.03，經(jīng)配對t檢驗，兩組差異有統(tǒng)計學(xué)意義（t=2.542，P=0.016）。kshv-miR-k12-12 的平均表達量（2.104±1.973）明顯高于瘤旁正常組織（0.102±0.093），其表達倍數(shù)（腫瘤/瘤旁）為 20.62。經(jīng)配對t檢驗，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（t=4.301，P=0.000）。

3.Kaposi肉瘤中 kshv-miR-k12-1和 kshvmiR-k12-12的表達與臨床表現(xiàn)的關(guān)系：經(jīng)單因素方差分析或獨立樣本t檢驗分析，不同HIV和HHV-8感染狀態(tài)、病理分期、皮損面積患者的kshv-miR-k12-1表達差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（表1）。

討 論

miRNA作為轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控基因表達的關(guān)鍵因子，對腫瘤發(fā)生發(fā)展有重要作用［5］。Kaposi肉瘤的病因一直未能確定，目前HHV-8被公認為是其致病因子［6-7］。Kaposi肉瘤相關(guān)皰疹病毒分為裂解期和潛伏期兩個周期，潛伏期時一小部分病毒基因表達，包括kaposin基因、病毒Fas相關(guān)死亡結(jié)構(gòu)域樣白介素1β轉(zhuǎn)換酶抑制蛋白（vFLIP）、病毒細胞周期蛋白（vCYC）、潛伏相關(guān)核抗原（LANA）和12個miR-k12-1到miR-k12-12的前體miRNA，這些前體miRNA可以產(chǎn)生24個成熟 miRNA［8-9］。成熟miRNA均來自KSHV潛伏期位點，共有一個啟動子，基本上表達所有KSHV感染的細胞［10-13］。miR-k12-12 完全保守，miR-k12-1、3、8、10 和 11 高度保守，miR-k12-2、4、5、6、7 和 9 具有相對明顯的多態(tài)性。

表1 18例Kaposi肉瘤腫瘤組織中kshv-miR-K12-1、kshv-miR-k12-1表達量與臨床參數(shù)的關(guān)系

本研究采用實時熒光定量PCR方法檢測18對維吾爾族Kaposi肉瘤患者腫瘤和瘤旁正常組織中kshv-miR-k12-1和kshv-miR-k12-12的表達情況，結(jié)果顯示，這兩條miRNA在Kaposi肉瘤腫瘤組織中的表達明顯高于瘤旁正常組織，提示kshv-miR-k12-1和kshv-miR-k12-12可能與Kaposi肉瘤的發(fā)生發(fā)展有關(guān)。Catrina Ene等［14］檢測17個4%甲醛包埋的Kaposi肉瘤標(biāo)本和3個KSHV陰性正常石蠟包埋組織標(biāo)本kshv-miR-k12-1，結(jié)果顯示，kshvmiR-K12-1在Kaposi肉瘤中表達明顯上調(diào)。Hansen等［15］研究結(jié)果顯示，kshv-miR-k12-1 在 Kaposi肉瘤中明顯高表達。本研究與上述研究結(jié)果一致，更加肯定了kshv-miR-k12-1參與了Kaposi肉瘤的發(fā)生發(fā)展。采用多個生物信息學(xué)軟件預(yù)測骨橋蛋白（SPP1）、塑性相關(guān)基因1（PRG1）、整膜蛋白2A（ITM2A）、S100 鈣結(jié)合蛋白 A2（S100A2）和血小板反應(yīng)蛋白1（THBS1）結(jié)合在KSHV miRNA3′UTR區(qū)，是kshv-miR-k12-1調(diào)控的靶基因。尤其是THBS1受多個KSHV miRNA調(diào)控，如kshv-miR-k12-1、kshv-miR-k12-3-3p、kshv-miR-k12-6-3p和 kshv-miR-k12-11。Samols等［16］研究證實，KSHV miRNA 抑制 SPP1、PRG1和 THBS1的3′UTR區(qū)，表明這些基因受KSHV miRNA表達的影響而發(fā)生改變。Suffert等［17］研究顯示，KSHV miRNA 下調(diào)內(nèi)源性Casp3 水平，表明 Casp3 3′UTR 受 kshv-miR-k12-1，kshv-miR-k12-3和kshv-miR-k12-4-3p的調(diào)控。

本研究還分析了kshv-miR-k12-1和kshvmiR-k12-12的表達與Kaposi肉瘤HHV-8感染、HIV感染、病理分期及皮損面積之間的關(guān)系，結(jié)果未見差異有統(tǒng)計學(xué)意義，提示kshv-miR-k12-1和kshv-miR-k12-12表達量可能與HHV-8感染、HIV感染、病理分期及皮損面積無關(guān)，也可能與本研究Kaposi肉瘤標(biāo)本數(shù)量較少有關(guān)，此結(jié)果在國內(nèi)外相關(guān)研究中尚未見報道。

本研究證實，kshv-miR-k12-1和kshv-miR-k12-12與Kaposi肉瘤發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，但其功能和調(diào)控的靶基因尚未明確，有待進一步研究。

［1］Qin Z,Freitas E,Sullivan R,et al.Upregulation of xCT by KSHV-encoded microRNAs facilitates KSHV dissemination and persistence in an environment of oxidative stress［J］.PLoS Pathog,2010,6（1）:e1000742.

［2］Boss IW,Renne R.Viral miRNAs:tools for immune evasion［J］.Curr Opin Microbiol,2010,13（4）:540-545.

［3］Cai X,Lu S,Zhang Z,et al.Kaposi′s sarcoma-associated herpesvirus expresses an array of viral microRNAs in latently infected cells［J］.Proc Natl Acad Sci U S A,2005,102（15）:5570-5575.

［4］Qin Z,Kearney P,Plaisance K,et al.Pivotal advance:Kaposi′s sarcoma-associated herpesvirus （KSHV）-encoded microRNA specifically induce IL-6 and IL-10 secretion by macrophages and monocytes［J］.J Leukoc Biol,2010,87（1）:25-34.

［5］Volinia S,Calin GA,Liu CG,et al.A microRNA expression signature of human solid tumors defines cancer gene targets［J］.Proc Natl Acad Sci U S A,2006,103（7）:2257-2261.

［6］普雄明,吳衛(wèi)東,居哈爾.Kaposi肉瘤患者血清人類皰疹病毒8型的檢測［J］.臨床皮膚科雜志,2004,33（2）:87-88.

［7］王慧,呂國棟,王曉東,等.基因芯片表達譜篩選Kaposi肉瘤相關(guān)基因［J］.中華皮膚科雜志,2011,44（6）:403-406.

［8］Gottwein E,Corcoran DL,Mukherjee N,et al.Viral microRNA targetome of KSHV-infected primary effusion lymphoma cell lines［J］.Cell Host Microbe,2011,10（5）:515-526.

［9］Haecker I,Gay LA,Yang Y,et al.Ago HITS-CLIP expands understanding of Kaposi′s sarcoma-associated herpesvirus miRNA function in primary effusion lymphomas［J］.PLoS Pathog,2012,8（8）:e1002884.

［10］Dittmer D,Lagunoff M,Renne R,et al.A cluster of latently expressed genes in Kaposi′s sarcoma-associated herpesvirus［J］.J Virol,1998,72（10）:8309-8315.

［11］ Fakhari FD,Dittmer DP.Charting latency transcripts in Kaposi′s sarcoma-associated herpesvirus by whole-genome real-time quantitative PCR［J］.J Virol,2002,76（12）:6213-6223.

［12］O′Hara AJ,Vahrson W,Dittmer DP.Gene alteration and precursor and mature microRNA transcription changes contribute to the miRNA signature of primary effusion lymphoma［J］.Blood,2008,111（4）:2347-2353.

［13］ O′Hara AJ,Wang L,Dezube BJ,et al.Tumor suppressor microRNAs are underrepresented in primary effusion lymphoma and Kaposi sarcoma［J］.Blood,2009,113（23）:5938-5941.

［14］Catrina Ene AM,Borze I,Guled M,et al.MicroRNA expression profiles in Kaposi′s sarcoma［J］.Pathol Oncol Res,2014,20（1）:153-159.

［15］Hansen A,Henderson S,Lagos D,et al.KSHV-encoded miRNAs target MAF to induce endothelial cell reprogramming［J］.Genes Dev,2010,24（2）:195-205.

［16］Samols MA,Skalsky RL,Maldonado AM,et al.Identification of cellular genes targeted by KSHV-encoded microRNAs［J］.PLoS Pathog,2007,3（5）:e65.

［17］ Suffert G,Malterer G,Hausser J,et al.Kaposi′s sarcoma herpesvirus microRNAs target caspase 3 and regulate apoptosis ［J］.PLoS Pathog,2011,7（12）:e1002405.

Expressions of Kaposi′s sarcoma-associated herpesvirus type 8-associated microRNAs k12-1 and k12-12 in Kaposi′s sarcoma and their significance

Wu Xiujuan*,Zhao Zongfeng,Pu Xiongming.*Department of Dermatovenereology,People′s Hospital of Xinjiang Uygur Autonomous Region,Urumqi 830001,China

ObjectiveTo measure the expressions of Kaposi′s sarcoma-associated herpesvirus type 8 associatedmicroRNAs k12-1 （kshv-miR-k12-1）and k12-12 （kshv-miR-k12-12）in Kaposi′s sarcoma tissue,and to assess their relationship with pathological stage and lesion area of Kaposi′s sarcoma,HIV infection,and human herpesvirus type 8（HPV-8） infection.MethodsTotally,18 paired tissue specimens stored in liquid nitrogen from Kaposi′s sarcoma lesions and paralesional skin were collected.Total RNAs were extracted from these specimens by using Trizol reagent,and reversely transcribed into cDNA.SYBR Green real-time fluorescence-based quantitative PCR was performed to measure the expressions of kshv-miR-k12-1 and kshv-miR-k12-12 in these specimens.The relationship of kshv-miR-k12-1 and kshv-miR-k12-12 expressions with the pathological stage and lesion area of Kaposi′s sarcoma,HIV and HPV-8 infections was analyzed.ResultsCompared with paralesional normal skin,Kaposi′s sarcoma lesions showed significantly increased expressions of kshv-miR-k12-1 （2-△△Ct:1.016 ± 1.645 vs.0.029 ± 0.019,t=2.542,P=0.016）and kshv-miR-k12-12（2-△△Ct:2.104 ± 1.973 vs.0.102 ± 0.093,t=4.301,P=0.000）.There were no significant differences in the expressions of kshv-miR-k12-1 or kshv-miR-k12-12 between patients with HIV or HPV-8 infection and those without,among patients with different pathological stages of Kaposi′s sarcoma,or among patients with different lesion areas （allP＞ 0.05）.ConclusionBoth kshv-miR-k12-1 and kshv-miR-k12-12 are highly expressed in Kaposi′s sarcoma,but neither of their expressions is related to HIV or HPV-8 infection,pathological stage or lesion area of Kaposi′s sarcoma.

Sarcoma,Kaposi;Herpesvirus 8,human;kshv-miR-k12-1;kshv-miR-k12-12

Pu Xiongming,Email:puxiongming@126.com

10.3760/cma.j.issn.0412-4030.2015.12.008

國家自然科學(xué)基金（81260311）；新疆維吾爾自治區(qū)自然科學(xué)基金（2014211A059）

普雄明，Email：puxiongming@126.com

2015-01-12）

（本文編輯：周良佳 顏艷）